徐 煜, 張 琳, 李亞鶴, 楊 柳, 王 東, 孫 雪， 徐年軍

(寧波大學 海洋學院, 寧波 315211)

雨生紅球藻中蝦青素萃取工藝優(yōu)化

徐 煜, 張 琳, 李亞鶴, 楊 柳, 王 東, 孫 雪， 徐年軍

(寧波大學 海洋學院, 寧波 315211)

建立了雨生紅球藻中蝦青素的超聲波提取和高效液相色譜檢測方法, 優(yōu)化了雨生紅球藻蝦青素萃取工藝各項參數(shù)。實驗數(shù)據(jù)顯示: 相對于其他有機溶劑, 最佳提取溶劑為丙酮, 以蝦青素含量作為衡量標準, 各溶劑提取效率的順序為: 丙酮>二氯甲烷/甲醇(1∶3,V/V)>甲醇>石油醚>氯仿。通過響應面實驗, 對影響蝦青素提取的各項因素實施了優(yōu)化, 確定了超聲波輔助提取蝦青素的最佳工藝參數(shù): 料液比1∶377, 超聲時間5.19 min, 超聲波功率為145 W, 蝦青素含量的預測值為2.931%, 在優(yōu)化條件下, 蝦青素含量實際測定值為2.896%。在該條件下，雨生紅球藻蝦青素含量明顯提高。

雨生紅球藻; 蝦青素; 超聲波提取法; 響應面; 高效液相色譜法

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)為已知蝦青素含量最高的藻類之一[1]。雖然很多藻類都能夠合成蝦青素(astaxanthin), 如斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)[2]、極地雪藻(Chlamydomonasnivalis)[3]、綠球藻(Chlorococcumsp.)[4]等, 但雨生紅球藻是較為典型的種類, 它的蝦青素含量遠高于其他藻類, 達到細胞干重1.0%～3.0%[5], 并且雨生紅球藻含有豐富的不飽和脂肪酸[6]。雨生紅球藻積累速率也高于目前已知藻類, 并且其所含蝦青素及其酯類的配比與鮭魚等水產(chǎn)動物的配比極為類似[7]。因此, 學界將它作為天然蝦青素的可靠來源, 并開展了深入的研究。

目前, 人們主要使用植物油[8-9]或有機溶劑[10]作為溶劑來萃取雨生紅球藻中的蝦青素。大部分蝦青素以游離形態(tài)存在于藻類中[11], 溶劑直接萃取的效果較好, 但提取時間長, 需要加以輔助技術, 如微波萃取[12]、超臨界萃取[13]、亞臨界水萃取[14]和超聲波[15]等技術手段。超聲波技術的優(yōu)點包括成本低、效果佳、處理時間短[16]等。本文使用超聲波輔助技術對蝦青素進行提取, 借助于超聲波的空化作用, 雨生紅球藻的細胞壁和細胞膜被損壞, 蝦青素溶出, 增強了溶劑的提取效果[17]。

由于雨生紅球藻含有包括葉綠素、類胡蘿卜素在內(nèi)的其他色素物質(zhì)[18], 普通檢測方法容易受到雜質(zhì)干擾, 本文使用C18反向色譜柱[19]進行分離定量, 減弱了以上不利因素帶來的誤差。本研究為藻類抗氧化物質(zhì)生產(chǎn)與檢測提供了基本的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻藻粉: 上海嘉興澤元生物制品有限公司; 蝦青素標準品: 德國Dr.Ehrenstorfer公司; 色譜級甲醇: 美國CNW公司; 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT); 其他試劑均為分析純。

LC-P310型高效液相色譜儀: 江蘇天瑞儀器股份有限公司; R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀: 瑞士BUCHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同提取溶劑的影響

準確稱量藻樣若干份, 每份20 mg, 各置于15 mL離心管中。向各離心管中分別加入甲醇、二氯甲烷/甲醇(1∶3,V/V)、丙酮、石油醚、氯仿各10 mL, 將超聲波組織破碎儀設置為模式3(總時間: 10 min, 超聲1.5 s/間歇2 s, 超聲波頻率40%, 調(diào)節(jié)超聲探頭在液面下同一位置), 在冰浴環(huán)境中超聲波破碎, 時間10 min。處理過后的液體在8000 r/min低溫4 ℃離心15 min, 取上清液, 將其在-4 ℃條件下避光保存。將以上的實驗步驟重復2～3次, 直到離心管中的細胞沉淀物呈現(xiàn)乳白色。將得到的等體積樣品在50 ℃條件下, 旋轉(zhuǎn)揮發(fā)全部有機溶劑后, 使用甲醇將殘留物溶解并且定容至5 mL容量瓶中, 再使用0.22 μm有機系濾膜將獲得的溶液過濾, 最后進行HPLC檢測(以蝦青素含量作為衡量指標)。

1.2.2 液相色譜檢測條件

流動相(甲醇∶水=95∶5), 流速1 mL/min, 設置波長478 nm, 柱溫30℃, 色譜柱welch ultimate XB-C18, 5 μm, 4.6×250 mm。每次進樣量為20 μL。

1.2.3 標準曲線的繪制

精確稱取5 mg蝦青素標準品, 使用BHT甲醇溶液, 將蝦青素標準品定容在25 mL容量瓶中, 此為0.2 mg/mL蝦青素標準品儲備液,-4 ℃避光保存?zhèn)溆? 使用前取出恢復至室溫。分別吸取0.125、0.250、0.625、1.25、2.5、5和10 mL儲備液, 稀釋于25 mL容量瓶。對制備好的標準品梯度溶液進行檢測。

以蝦青素濃度平均值(μg/mL)為縱坐標, 峰面積(mAU*s)為橫坐標, 制作標準曲線。標準曲線的回歸方程為:Y=0.0006X+0.7331,R2=0.9977, 其中Y為濃度(μg/mL),X為峰面積(mAU*s), 回歸方程的線性范圍為1～80 μg/mL, 最低檢出限為0.5 μg/mL。

1.2.4 蝦青素含量計算公式

η(%)=(c×v)/m×100%

η為蝦青素含量(%),c為提取液的蝦青素濃度(mg/mL),v為定容體積(mL),m為藻樣質(zhì)量(mg)。

1.2.5 單因素實驗設計

1)料液比: 稱量5份藻樣, 每份0.0200 g, 分別置于10 mL離心管中, 向各管中加入1、2、4、8、12和16 mL丙酮, 將料液比(mg/mL)各設置為: 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600及1∶800, 超聲波功率設置為300 W, 超聲時間設置為10 min, 進行浸提實驗, 后續(xù)步驟同1.2.1, 比較蝦青素含量。

2)超聲波時間: 稱量5份藻樣, 每份0.0200 g, 分別置于10 mL離心管中, 向各管中加入4 mL丙酮, 使其料液比為1∶800, 分別提取2、4、6、8和10 min, 后續(xù)驟同 1.2.1, 比較蝦青素含量。

3)超聲波功率: 稱量5份藻樣, 每份0.0200 g, 分別置于10 mL離心管中, 設置超聲波功率分別為100、200、300、400和500 W, 分別向5支管中各加入4 mL丙酮, 使其料液比為1∶800, 總超聲時間10 min, 進行浸提實驗, 后續(xù)步驟同1.2.1, 比較蝦青素含量。

1.2.6 響應面實驗設計

使用design-expert V8.0.6進行實驗設計(見表1), 以蝦青素含量為考察指標, 以料液比(A)、超聲時間(B)和超聲波功率(C)為自變量, 設置17個處理組。

表1 雨生紅球藻蝦青素提取響應面實驗設計Table 1 Response surface experiment design of extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007、Origin 8.0及SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分離結(jié)果和標準曲線的建立

蝦青素標準溶液的高效液相色譜圖(圖1), 紅球藻提取液的高效液相色譜圖(圖2)。通過與已有的研究結(jié)果對比分析[20], 使用保留時間法對蝦青素進行定性分析, 確定在13.12 min處色譜峰為蝦青素。

2.2 雨生紅球藻蝦青素提取的單因素實驗結(jié)果

2.2.1 不同提取溶劑對蝦青素含量的影響

超聲波能量在不同介質(zhì)中的傳播效果是不同的, 所以選取合適的溶劑可以增強提取效果。另外, 根據(jù)蝦青素的溶解度差異和藻粉的物料性質(zhì), 選取二氯甲烷/甲醇(1∶3,V/V)、石油醚、氯仿、甲醇、丙酮作為實驗溶劑, 進行提取。不同溶劑按效果排序為: 丙酮>二氯甲烷/甲醇(1∶3,V/V)>甲醇>石油醚>氯仿, 與其他溶劑相比, 丙酮的提取效率明顯高于其他溶劑。丙酮的極性相對較高, 藻粉在極性較高的溶劑中的分散性很好, 且丙酮是一種提取色素物質(zhì)的傳統(tǒng)理想溶劑。因此本實驗選擇丙酮作為提取溶劑(圖3)。

圖 1 蝦青素標準溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of astaxanthin standard

注： 1為蝦青素

圖 2 雨生紅球藻提取液色譜圖Fig 2 Chromatogram of extract from Haematococcus pluvialis

注：1為蝦青素

2.2.2 料液比的影響

將丙酮作為溶劑, 設置超聲時間10 min, 料液比對蝦青素含量的影響如圖4。在料液比從1∶50增加到1∶600時, 含量從1.372%增加到1.781%, 提高幅度較大。當料液比高于1∶200時, 隨著料液比提高, 含量變化減小, 在料液比為1∶600時, 含量達到1.835%。

圖 3 不同類型溶劑對雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig 3 Effects of different solvents on astaxanthin yields of Haematococcus pluvialis

圖 4 料液比對雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig 4 The effect of ratio of solid/liquid on astaxanthin yield of Haematococcus pluvialis

圖 5 超聲波時間對雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig 5 The effect of ultrasonic time on astaxanthin yield of Haematococcus pluvialis

2.2.3 超聲時間的影響

超聲時間對蝦青素含量的影響如圖5。料液比設置為1∶200, 伴隨著超聲波時間增加, 在8 min以內(nèi), 蝦青素含量緩慢提高, 當8 min時, 含量為2.53%, 之后, 隨著時間延長, 含量緩慢降低, 10 min時降為2.33%。由于雨生紅球藻的紅孢囊細胞(haematocysts)的直徑通常僅為20～40 μm[21], 相對于其他微藻具有較厚的細胞壁, 只有經(jīng)過破壁后[22], 溶劑才能迅速滲入, 讓溶解擴散作用到達均衡狀態(tài)。提取達到溶解擴散均衡以后, 較長時間超聲波處理對蝦青素穩(wěn)定性的負面效果增大。

圖 6 超聲波功率對雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig 6 The effect of ultrasonic power on astaxanthin yield of Haematococcus pluvialis

2.2.4 超聲波功率的影響

超聲波功率對蝦青素含量的影響見圖6。 當超聲波功率從100 W提高至400 W, 含量從1.527%增至2.024%。超聲作用使雨生紅球藻的細胞壁與細胞膜破損, 隨著超聲波功率的增強, 利于蝦青素溶出。功率高于400 W時, 含量開始緩慢降低。當超聲于丙酮中傳播時, 由超聲造成的分子震動被摩擦力限制, 讓部分能量轉(zhuǎn)化成熱量, 由于超聲波產(chǎn)生的熱量較多，而蝦青素對熱敏感, 容易降解成其他物質(zhì)[23], 所以當超聲波功率超過400 W時, 蝦青素含量有所降低。

表 2 響應面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface method

2.3 雨生紅球藻蝦青素提取響應面實驗結(jié)果及分析

實驗設計因素、水平和實驗結(jié)果如表2, 選取料液比(A)、超聲波時間(B)及超聲波功率(C)進行三水平三因素響應面分析。運用軟件Design-expert V8.0.6, 以多元回歸擬合的方法對數(shù)據(jù)進行處理, 獲得雨生紅球藻中蝦青素含量的回歸方程:

Y=0.48+7.64×10-3×A+0.16×B+8.12×10-3×C-1.25×10-4×AB-9.33×10-6×AC-1.12×10-4×BC-7.47×10-6×A2-9.27×10-3×B2-1.36×10-5×C2

由表3可以得出, 模型F值極顯著(P<0.01), 而失擬項的F值不顯著(P>0.05), 數(shù)學模型的相關系數(shù)R2是96.94%, 表明模型的誤差較小，擬合效果良好?？梢允褂迷摂?shù)學模型, 進行預測與分析。

以回歸方程為基礎, 可以通過軟件導出等高線圖與響應面分析圖(圖7), 通過等高線的輪廓可以反映出2個因素交互作用的強與弱, 圓形與橢圓形代表交互作用的顯著與不顯著。由圖7可知,超聲波時間與料液比交互作用較為顯著, 超聲波時間與料液比的交互作用較顯著, 超聲波時間與超聲波功率交互作用也較顯著。在所選的各因素水平范圍內(nèi), 各因素對蝦青素含量影響的強弱排序: 料液比>超聲波功率>超聲時間。

圖 7 各因素對雨聲紅球藻中蝦青素含量影響的響應面圖及等高線Fig 7 Response surface plot and contour plot of interaction effects between every two factors on the extraction astaxanthin yield from Haematococcus pluvialis

使用軟件處理后，獲得的最優(yōu)參數(shù)是: 料液比1∶377, 超聲時間5.19 min, 超聲波功率為145 W。蝦青素含量預測值為2.931%。在此條件下, 采用超聲波輔助提取紅球藻蝦青素, 提取過程重復3次, 蝦青素含量實際測量值是2.896%, 和預測值對比, 相對誤差為0.035%, 與預測值基本一致。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

注： **P<0.01, 差異極顯著;*P<0.05, 差異顯著

3 討論

雨生紅球藻中含有多種具有良好開發(fā)前景的天然類胡蘿卜素, 包括蝦青素紫黃素、環(huán)氧化玉米黃質(zhì)、新黃素等[24], 其中, 目前市場價值最高的是具有強抗氧化活性的蝦青素[25]。也有研究進行了紅發(fā)夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的相關研究[26]。蝦青素作為一種已經(jīng)在市場化銷售并且收到良好反饋的化妝品原料, 其提取與穩(wěn)定儲存是學者關注的方面之一。當蝦青素從藻細胞中提取出來后, 會在強光及高溫條件下發(fā)生降解[21]。Bustamante等[27]發(fā)現(xiàn)了一種提高蝦青素穩(wěn)定性方法, 將雨生紅球藻與油性樹脂微囊化, 以降低蝦青素的降解率與減小半衰期。但在實驗室層面上, 其方法不宜采用。

為了克服傳統(tǒng)提取與檢測方法的缺點,本實驗使用高效液相色譜法檢測,此法可縮短樣品處理周期,且所需樣品量小,讓避光、恒溫[28]、氮氣保護等更容易操作,在一定程度上提高了蝦青素的穩(wěn)定性,降低了實驗誤差,也符合國家最新出臺的行業(yè)標準[29]。本研究同時使用軟件獲得超聲波輔助提取蝦青素的回歸方程,對雨生紅球藻蝦青素超聲波輔助提取技術進行了優(yōu)化,各參數(shù)為料液比1∶377,超聲時間5.19 min,提取功率145 W,蝦青素含量預測結(jié)果是2.931%,實際測量結(jié)果是2.896%,同預測結(jié)果對比僅相差0.035%, 實際結(jié)果與模型預測值基本符合。與國內(nèi)已經(jīng)報道的蝦青素提取工藝優(yōu)化研究[30-33]相比, 本方法的優(yōu)勢在于首次將高效液相色譜檢測技術與響應面優(yōu)化設計有機結(jié)合, 提高了數(shù)據(jù)的準確性。

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Optimization of extracting process of astaxanthin fromHaematcoccuspluvialis

XU Yu, ZHANG Lin, LI Ya-he, YANG Liu, WANG Dong, SUN Xue, XU Nian-jun

(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

This paper established a method for astaxanthin extracting by ultrasonic extraction and detection by high performance liquid chromatography(HPLC). The result showed that acetone was the optimal solvent among the selected solvents. The astaxanthin yield ofHaematococcuspluvialiswas used as measurement index, the sequence of extraction efficiency of different solvent was that acetone> methylene chloride: methanol(3∶1,V/V) > methanol > petroleum ether > chloroform. The mathematical model of ultrasound assisted astaxanthin extraction ofH.pluvialiswas established by response surface method. The optimal condition for extraction technique was that S/L 1∶377, ultrasonic time 5.19 min and ultrasonic power 145 W. Under the optimal condition, the predicted astaxanthin yield was 2.931%, and the measured value was 2.896%. It indicated that the adaptable of model was good. Compared with conventional reflux extraction methods, extraction efficiency of astaxanthin was improved significantly assisted by response surface method.

Haematococcuspluvialis; astaxanthin; ultrasound assisted extraction; response surface; HPLC

2016-03-07;

2016-04-21

國家自然科學基金(31572638)；浙江省科技廳公益項目(2015C32021); 寧波市科技計劃項目(2014C10023)

徐 煜, 碩士, 研究方向為藻類生物技術， E-mail:bioxuyu@163.com

徐年軍, 研究員, 博士生導師, 研究方向為藻類生理生化, E-mail:xunianjun@nbu.edu.cn

Q949.2;TQ914.2

B

2095-1736(2017)01-0098-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.098