方國鋒， 王錫昌， 梁田田， 陶寧萍， 盧 瑛

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)， 上海 201306)

基于免疫層析檢測的河豚毒素快速樣品前處理方法研究

方國鋒， 王錫昌， 梁田田， 陶寧萍， 盧 瑛

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)， 上海 201306)

為了建立適合河豚毒素免疫層析檢測的前處理方法，采用超濾技術(shù)對(duì)前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)建立的磁性免疫層析試紙條進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究結(jié)果顯示，采用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾處理，4000 r/min離心10 min的處理是最優(yōu)的，可以降低溶液中的蛋白濃度，加標(biāo)回收率在92.4%～126.0%之間，適合免疫層析檢測。為河豚毒素的快速現(xiàn)場檢測提供了前處理技術(shù)參考。

河豚毒素；前處理；超濾；免疫層析檢測

河豚自古是魚中珍品，但在國內(nèi)，由于其含有劇毒的河豚毒素(tetrodotoxin, TTX),一直被禁止食用。TTX是一種小分子化合物，毒性很強(qiáng)，作用于神經(jīng)系統(tǒng)，選擇性地阻斷鈉離子通道，影響神經(jīng)肌肉興奮信號(hào)的傳導(dǎo)，甚至引起死亡[1]。TTX易吸濕潮解，不溶于有機(jī)溶劑，微溶于水，極易溶于醋酸水溶液，所以多采用乙酸水溶液進(jìn)行提取。TTX的理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，在中性和酸性溶液中相對(duì)穩(wěn)定，在堿性水溶液中易分解，可降解為幾種喹啉化合物[2]，一般難以通過烹調(diào)手段破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施[3]。

隨著免疫檢測技術(shù)的興起，TTX快速檢測方法也備受關(guān)注[4]。TTX免疫分析檢測技術(shù)[5]得到發(fā)展，包括酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒法[6]、基于磁性納米探針免疫層析檢測技術(shù)[7]等。

不過，免疫檢測技術(shù)對(duì)樣品前處理有更高的要求。目前，針對(duì)TTX的提取過程常常包括加熱煮沸等步驟，導(dǎo)致提取液中會(huì)有較高濃度的水溶性蛋白質(zhì)存在，這會(huì)改變層析速度，降低層析效果，也會(huì)影響TTX與抗體的結(jié)合[8]，從而影響檢測結(jié)果。因此，在前處理過程中如何控制蛋白的濃度值得研究。

現(xiàn)有的前處理技術(shù)步驟相對(duì)繁瑣、耗時(shí)長。國標(biāo)中的液相色譜法[9]、ELISA法[10]和小鼠生物法[11]，前處理方法包括兩次加熱煮沸、過濾、脫脂等復(fù)雜的步驟，無法滿足現(xiàn)場操作的要求。超濾可分離相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)千至數(shù)百萬不等的物質(zhì)，適合對(duì)水溶性蛋白質(zhì)的處理[12]。本研究在原有的前處理基礎(chǔ)上，采用超濾技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，與免疫層析檢測技術(shù)相配套，簡化了前處理步驟，縮短了時(shí)間，提高檢測效率、準(zhǔn)確性和實(shí)用性，適用于針對(duì)河豚肌肉的現(xiàn)場檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

純度大于99%的TTX標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；氫氧化鈉、乙酸等試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)；卡槽(MICT test cassette)、磁性納米微球購自上海奧潤微納新材料科技有限公司；超濾離心管購自上海天承生物科技有限公司；樣本為江蘇中洋集團(tuán)所提供的人工養(yǎng)殖暗紋東方鲀。

德國Eppendorf離心機(jī)5810B型購自德國Eppendorf公司；Biotek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀購自芯起點(diǎn)基因科技(北京)有限公司；MAR磁信號(hào)分析系統(tǒng)購自美國Magna Bio Sciences公司。

1.2 樣品提取

參考本實(shí)驗(yàn)室前期的研究[13]，將河豚肌肉組織絞碎，稱取2.0 g，加入5 mL的2%(V/V)乙酸水溶液后水浴煮沸10 min，冷卻至室溫后取上清；沉淀加入3 mL 2%乙酸水溶液加熱煮沸3 min，冷卻至室溫后取上清；與第一次取得的上清液合并，調(diào)節(jié)pH值7.0～8.0，定容至10 mL，4000 r/min離心10 min，取4 mL上清置于截留分子質(zhì)量為10 ku超濾離心管(外管15 mL內(nèi)管4 mL)內(nèi)管中，4000 r/min離心10 min，收集濾液待用。

1.3 免疫層析檢測

采用經(jīng)典的EDC/NHS化學(xué)偶聯(lián)法將磁性納米微球與TTX單克隆抗體(本實(shí)驗(yàn)室自行制備)[14]進(jìn)行偶聯(lián)，制備磁性免疫探針。免疫層析試紙條的制備參考徐曉巍等[15]的方法，依次將底板、硝酸纖維素膜(CN140)、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊和覆膜進(jìn)行組裝，之后裁切成0.5 cm寬的試紙條待用，將100 μg/mL的制備好的載體蛋白復(fù)合物(TTX-BSA)[16]和2 mg/mL的二抗(羊抗鼠IgG)包被在CN140上劃膜濃度為1.0 μL/cm，分別作為檢測線(Test line)和質(zhì)控線(Control line)，之后裁切成0.5 cm寬的試紙條待用。檢測時(shí)，準(zhǔn)確移取待測樣本105 μL，層析體系15 μL[5%(V/V)Tween-20, 0.2 g/mL BSA和0.005 mol/L硼酸溶液]，免疫磁珠5 μL(0.2 mg/mL)，混勻后緩慢滴加在試紙條的樣品墊處，層析30 min后，將試紙條裝入卡槽中，采用磁信號(hào)儀檢測磁信號(hào)值(Magnetic signal，MS)。免疫層析檢測采用的是間接競爭模式，對(duì)于陰性樣本，T線區(qū)域有明顯的顏色反應(yīng)，陽性反之。以TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的試紙條的磁信號(hào)值為縱坐標(biāo)建立對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 前處理優(yōu)化

1.4.1 樣品中BSA濃度對(duì)層析檢測的影響

為了解樣品提取液中蛋白濃度對(duì)免疫檢測的影響，將BSA蛋白溶解在0.01 mol/L pH 7.0 PBS緩沖溶液中，配制BSA濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20 mg/mL的PBS緩沖溶液為空白對(duì)照，之后進(jìn)行免疫層析檢測，檢測T線的磁信號(hào)值，并計(jì)算和比較樣品與空白對(duì)照的磁信號(hào)的比值。

1.4.2 截留分子質(zhì)量的優(yōu)化

超濾技術(shù)應(yīng)用于TTX的前處理已有相關(guān)報(bào)道[17]，出于實(shí)際應(yīng)用的考慮采用商業(yè)化的超濾離心管，截留分子質(zhì)量主要是3、10、30、50和100 ku，外管15 mL內(nèi)管4 mL，離心處理?xiàng)l件為4000 r/min，40 min，超濾處理河豚肌肉提取液。

1.4.3 超濾處理時(shí)間的優(yōu)化

超濾處理河豚肌肉提取液并量取濾液體積，截留分子質(zhì)量采用1.4.2優(yōu)化結(jié)果。處理時(shí)間40 min，每隔5 min對(duì)處理所得濾液體積進(jìn)行取量，并計(jì)算濾液體積的比值。

為了比較處理時(shí)間對(duì)加標(biāo)樣本的處理效果的影響，對(duì)河豚肌肉提取液加標(biāo)后進(jìn)行提取和檢測，加標(biāo)濃度為10、100和1000 ng/mL，溶于0.1%的乙酸水溶液。分別進(jìn)行超濾處理，處理時(shí)間為10、15和20 min，之后進(jìn)行層析檢測，層析完成后測定磁信號(hào)值。

1.4.4 樣品回收率

在無毒的河豚肌肉中添加低、中、高3個(gè)濃度的TTX標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別是10、100和1000 ng/mL，溶于0.1%乙酸水溶液，加標(biāo)方法參考王靜等[18]的方法，對(duì)河豚肌肉進(jìn)行勻漿后加入TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌均勻使TTX均勻吸附。然后利用優(yōu)化的超濾前處理技術(shù)進(jìn)行提取，最后采用免疫層析試紙條進(jìn)行定性和定量檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫層析檢測的定量檢測

根據(jù)試紙條的加標(biāo)檢測，并對(duì)試紙條T線部分的磁信號(hào)進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。TTX的含量在50～5000 ng/mL的范圍內(nèi)，與磁信號(hào)的值具有良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系，關(guān)系式y(tǒng)=-320 ln(x) + 2990.2，R2為0.9944。由此可見，磁性免疫層析方法可用于TTX的定量分析和檢測。

圖1 河豚毒素免疫層析試紙條檢測定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of test strip for TTX

2.2 蛋白質(zhì)濃度對(duì)層析檢測的影響

如圖2所示，樣品中的BSA蛋白質(zhì)含量顯著影響層析檢測的磁信號(hào)值，在濃度為0.05 mg/mL時(shí)，磁信號(hào)與空白對(duì)照接近，說明層析檢測效果較好甚至優(yōu)于空白對(duì)照(PBS緩沖溶液)，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，層析檢測的磁信號(hào)值減小，這說明對(duì)層析檢測有不利影響。當(dāng)濃度達(dá)到0.2 mg/mL時(shí)，磁信號(hào)值顯著降低，遠(yuǎn)小于陰性空白對(duì)照，表明該濃度BSA對(duì)層析檢測信號(hào)有顯著的干擾影響。

圖2 BSA濃度對(duì)層析檢測的影響Fig 2 Influence of the concentration of BSA on the immunochromatographic detection

2.3 超濾處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 截留分子質(zhì)量的優(yōu)化

不同截留分子質(zhì)量的超濾處理對(duì)免疫層析檢測結(jié)果如圖3所示，從圖中可知，隨著截留分子質(zhì)量的增大，磁信號(hào)值先增大后減小，當(dāng)截留分子質(zhì)量為10 ku時(shí)，檢測的磁信號(hào)值最大，陰性比值接近100%，與空白對(duì)照(0.01 mol/L pH 7.0的PBS緩沖溶液)的層析檢測結(jié)果類似，說明層析檢測結(jié)果最理想。

本結(jié)果表明小分子蛋白質(zhì)，對(duì)層析檢測信號(hào)的干擾較小，可能是相對(duì)較小分子質(zhì)量的蛋白可以增加疏水性并減弱重潤濕作用[19]，也較少地影響抗原抗體的結(jié)合。而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白會(huì)堵塞硝酸纖維素膜等的空間結(jié)構(gòu)，并影響TTX與抗體的結(jié)合，降低層析檢測效果。

圖3 不同截留分子質(zhì)量對(duì)層析檢測的影響Fig 3 Influence of molecular weight cut-off on the immunochromatographic detection

2.3.2 超濾處理時(shí)間的優(yōu)化

如圖4所示，隨著處理時(shí)間的延長，對(duì)4 mL樣本的處理所得的濾液體積在前20 min顯著增加，處理時(shí)間超過20 min后，濾液體積趨于穩(wěn)定。處理時(shí)間在10～20 min時(shí)，濾液體積變化較大，且所得濾液得率超過50%。因此，初步優(yōu)化的處理時(shí)間為10、15和20 min，通過加標(biāo)檢測，對(duì)處理時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

圖4 處理時(shí)間對(duì)濾液體積的影響Fig 4 Influence of the processing time on the volume of processing fluid

對(duì)提取液的加標(biāo)檢測結(jié)果如圖5所示，磁信號(hào)隨著加標(biāo)濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，這與競爭法檢測原理相符合，表明所選的樣品前處理可以正確檢測TTX。對(duì)比同一加標(biāo)濃度的不同處理時(shí)間10、15和20 min時(shí)的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間對(duì)磁信號(hào)并無顯著差異?？紤]到現(xiàn)場檢測的實(shí)效性，確定超濾10 min為最優(yōu)的處理時(shí)間。

圖5 不同處理時(shí)間的加標(biāo)檢測結(jié)果Fig 5 Results of detection in different treatment time

2.4 回收率評(píng)價(jià)

本研究選取了低、中、高3個(gè)濃度的TTX對(duì)樣品前處理的回收率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，河豚肌肉組織的加標(biāo)提取回收率檢測結(jié)果如表1所示。由表1可知，當(dāng)加標(biāo)濃度為10 ng/mL時(shí)，層析檢測的回收率結(jié)果明顯偏大，此時(shí)的檢測結(jié)果為陰性，且該濃度的TTX已經(jīng)超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。當(dāng)加標(biāo)濃度為100 ng/mL和1000 ng/mL時(shí)，加標(biāo)回收率在92.4%～126.0%之間，結(jié)果總體比較理想。且這兩個(gè)加標(biāo)濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以通過肉眼觀察進(jìn)行毒性判斷，適用于進(jìn)行初篩的現(xiàn)場快速檢測方法[20]。上述結(jié)果表明本研究建立的樣品前處理方法在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)可獲得較高的回收率，但在標(biāo)準(zhǔn)曲線的低濃度和高濃度范圍，磁信號(hào)的較小波動(dòng)均會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果的較大變化。

表1 樣品加標(biāo)結(jié)果Table 1 Results of detection for sample adding TTX

2.5 前處理方法的比較

本研究表明樣品的前處理技術(shù)會(huì)對(duì)免疫層析檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。本研究的前處理方法和國標(biāo)GBT 5009.206—2007的ELISA方法的樣品前處理對(duì)比結(jié)果如表2所示。

表2 兩種方法前處理方法比較結(jié)果Table 2 Comparison of two pretreatment methods

由表2可知，ELISA前處理方法步驟復(fù)雜繁瑣耗時(shí)長，同時(shí)無水乙醚有一定的危害。而本研究建立的超濾法處理具有操作簡單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，與免疫層析檢測技術(shù)相配套。

3 結(jié)論

基于免疫檢測技術(shù)的TTX快速現(xiàn)場檢測，具有快速簡便，肉眼判定和大量樣本的初篩等優(yōu)點(diǎn)。而本研究建立的河豚肌肉組織的超濾法樣品前處理技術(shù)，耗時(shí)短(約35 min)，操作簡便，可滿足現(xiàn)場檢測對(duì)前處理的要求，今后可作為免疫層析檢測技術(shù)的配套樣品處理方法進(jìn)行應(yīng)用，具有較好的應(yīng)用前景。

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Rapid preparation technology for tetrodotoxin based on immunochromatographic detection

FANG Guo-feng, WANG Xi-chang, LIANG Tian-tian, TAO Ning-ping, LU Ying

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation (Shanghai), Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China)

In order to establish a suitable pretreatment method for immunochromatographic detection for tetrodotoxin, in this study，the ultrafiltration technology was applied to optimize the pretreatment. The magnetic immunochromatographic test strip established by our laboratory was used for evaluation. The results showed that the optimal treatment of centrifugation at 4000 r/min for 10 min with a cut off molecular of 10 ku. This method was suitable for immunochromatographic assay with good recovery (92.4%-126.0%). Also, the concentration of protein in the solution reduced after pretreatment. This study provides technical support for rapid on-site test of tetrodotoxin.

tetrodotoxin; pretreatment; ultrafiltration; immunochromatographic detection

2016-04-27；

2016-05-18

上海市科委項(xiàng)目(15320502100)；十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD17B02)；養(yǎng)殖暗紋東方鲀商品魚凈化和品質(zhì)提升研究：青產(chǎn)學(xué)研2015-26

方國鋒，碩士，從事食品營養(yǎng)與安全研究，E-mail：1249400576@qq.com

盧瑛，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測、納米生物技術(shù)，E-mail：y-lu@shou.edu.cn

TS254.7

B

2095-1736(2017)01-0094-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.094