方國鋒， 王錫昌， 梁田田， 陶寧萍， 盧 瑛

(上海海洋大學食品學院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)， 上海 201306)

基于免疫層析檢測的河豚毒素快速樣品前處理方法研究

方國鋒， 王錫昌， 梁田田， 陶寧萍， 盧 瑛

(上海海洋大學食品學院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)， 上海 201306)

為了建立適合河豚毒素免疫層析檢測的前處理方法，采用超濾技術(shù)對前處理方法進行了優(yōu)化，并對建立的磁性免疫層析試紙條進行了評價。研究結(jié)果顯示，采用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾處理，4000 r/min離心10 min的處理是最優(yōu)的，可以降低溶液中的蛋白濃度，加標回收率在92.4%～126.0%之間，適合免疫層析檢測。為河豚毒素的快速現(xiàn)場檢測提供了前處理技術(shù)參考。

河豚毒素；前處理；超濾；免疫層析檢測

河豚自古是魚中珍品，但在國內(nèi)，由于其含有劇毒的河豚毒素(tetrodotoxin, TTX),一直被禁止食用。TTX是一種小分子化合物，毒性很強，作用于神經(jīng)系統(tǒng)，選擇性地阻斷鈉離子通道，影響神經(jīng)肌肉興奮信號的傳導，甚至引起死亡[1]。TTX易吸濕潮解，不溶于有機溶劑，微溶于水，極易溶于醋酸水溶液，所以多采用乙酸水溶液進行提取。TTX的理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，在中性和酸性溶液中相對穩(wěn)定，在堿性水溶液中易分解，可降解為幾種喹啉化合物[2]，一般難以通過烹調(diào)手段破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施[3]。

隨著免疫檢測技術(shù)的興起，TTX快速檢測方法也備受關(guān)注[4]。TTX免疫分析檢測技術(shù)[5]得到發(fā)展，包括酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒法[6]、基于磁性納米探針免疫層析檢測技術(shù)[7]等。

不過，免疫檢測技術(shù)對樣品前處理有更高的要求。目前，針對TTX的提取過程常常包括加熱煮沸等步驟，導致提取液中會有較高濃度的水溶性蛋白質(zhì)存在，這會改變層析速度，降低層析效果，也會影響TTX與抗體的結(jié)合[8]，從而影響檢測結(jié)果。因此，在前處理過程中如何控制蛋白的濃度值得研究。

現(xiàn)有的前處理技術(shù)步驟相對繁瑣、耗時長。國標中的液相色譜法[9]、ELISA法[10]和小鼠生物法[11]，前處理方法包括兩次加熱煮沸、過濾、脫脂等復雜的步驟，無法滿足現(xiàn)場操作的要求。超濾可分離相對分子質(zhì)量數(shù)千至數(shù)百萬不等的物質(zhì)，適合對水溶性蛋白質(zhì)的處理[12]。本研究在原有的前處理基礎上，采用超濾技術(shù)進行改進，與免疫層析檢測技術(shù)相配套，簡化了前處理步驟，縮短了時間，提高檢測效率、準確性和實用性，適用于針對河豚肌肉的現(xiàn)場檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

純度大于99%的TTX標準品，購自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；氫氧化鈉、乙酸等試劑為分析純，購自國藥集團；卡槽(MICT test cassette)、磁性納米微球購自上海奧潤微納新材料科技有限公司；超濾離心管購自上海天承生物科技有限公司；樣本為江蘇中洋集團所提供的人工養(yǎng)殖暗紋東方鲀。

德國Eppendorf離心機5810B型購自德國Eppendorf公司；Biotek Synergy 2多功能酶標儀購自芯起點基因科技(北京)有限公司；MAR磁信號分析系統(tǒng)購自美國Magna Bio Sciences公司。

1.2 樣品提取

參考本實驗室前期的研究[13]，將河豚肌肉組織絞碎，稱取2.0 g，加入5 mL的2%(V/V)乙酸水溶液后水浴煮沸10 min，冷卻至室溫后取上清；沉淀加入3 mL 2%乙酸水溶液加熱煮沸3 min，冷卻至室溫后取上清；與第一次取得的上清液合并，調(diào)節(jié)pH值7.0～8.0，定容至10 mL，4000 r/min離心10 min，取4 mL上清置于截留分子質(zhì)量為10 ku超濾離心管(外管15 mL內(nèi)管4 mL)內(nèi)管中，4000 r/min離心10 min，收集濾液待用。

1.3 免疫層析檢測

采用經(jīng)典的EDC/NHS化學偶聯(lián)法將磁性納米微球與TTX單克隆抗體(本實驗室自行制備)[14]進行偶聯(lián)，制備磁性免疫探針。免疫層析試紙條的制備參考徐曉巍等[15]的方法，依次將底板、硝酸纖維素膜(CN140)、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊和覆膜進行組裝，之后裁切成0.5 cm寬的試紙條待用，將100 μg/mL的制備好的載體蛋白復合物(TTX-BSA)[16]和2 mg/mL的二抗(羊抗鼠IgG)包被在CN140上劃膜濃度為1.0 μL/cm，分別作為檢測線(Test line)和質(zhì)控線(Control line)，之后裁切成0.5 cm寬的試紙條待用。檢測時，準確移取待測樣本105 μL，層析體系15 μL[5%(V/V)Tween-20, 0.2 g/mL BSA和0.005 mol/L硼酸溶液]，免疫磁珠5 μL(0.2 mg/mL)，混勻后緩慢滴加在試紙條的樣品墊處，層析30 min后，將試紙條裝入卡槽中，采用磁信號儀檢測磁信號值(Magnetic signal，MS)。免疫層析檢測采用的是間接競爭模式，對于陰性樣本，T線區(qū)域有明顯的顏色反應，陽性反之。以TTX標準溶液的濃度為橫坐標，以相對應的試紙條的磁信號值為縱坐標建立對數(shù)標準曲線。

1.4 前處理優(yōu)化

1.4.1 樣品中BSA濃度對層析檢測的影響

為了解樣品提取液中蛋白濃度對免疫檢測的影響，將BSA蛋白溶解在0.01 mol/L pH 7.0 PBS緩沖溶液中，配制BSA濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20 mg/mL的PBS緩沖溶液為空白對照，之后進行免疫層析檢測，檢測T線的磁信號值，并計算和比較樣品與空白對照的磁信號的比值。

1.4.2 截留分子質(zhì)量的優(yōu)化

超濾技術(shù)應用于TTX的前處理已有相關(guān)報道[17]，出于實際應用的考慮采用商業(yè)化的超濾離心管，截留分子質(zhì)量主要是3、10、30、50和100 ku，外管15 mL內(nèi)管4 mL，離心處理條件為4000 r/min，40 min，超濾處理河豚肌肉提取液。

1.4.3 超濾處理時間的優(yōu)化

超濾處理河豚肌肉提取液并量取濾液體積，截留分子質(zhì)量采用1.4.2優(yōu)化結(jié)果。處理時間40 min，每隔5 min對處理所得濾液體積進行取量，并計算濾液體積的比值。

為了比較處理時間對加標樣本的處理效果的影響，對河豚肌肉提取液加標后進行提取和檢測，加標濃度為10、100和1000 ng/mL，溶于0.1%的乙酸水溶液。分別進行超濾處理，處理時間為10、15和20 min，之后進行層析檢測，層析完成后測定磁信號值。

1.4.4 樣品回收率

在無毒的河豚肌肉中添加低、中、高3個濃度的TTX標準品，濃度分別是10、100和1000 ng/mL，溶于0.1%乙酸水溶液，加標方法參考王靜等[18]的方法，對河豚肌肉進行勻漿后加入TTX標準溶液，攪拌均勻使TTX均勻吸附。然后利用優(yōu)化的超濾前處理技術(shù)進行提取，最后采用免疫層析試紙條進行定性和定量檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫層析檢測的定量檢測

根據(jù)試紙條的加標檢測，并對試紙條T線部分的磁信號進行檢測，建立標準曲線如圖1所示。TTX的含量在50～5000 ng/mL的范圍內(nèi)，與磁信號的值具有良好的對數(shù)線性關(guān)系，關(guān)系式y(tǒng)=-320 ln(x) + 2990.2，R2為0.9944。由此可見，磁性免疫層析方法可用于TTX的定量分析和檢測。

圖1 河豚毒素免疫層析試紙條檢測定量標準曲線Fig 1 Standard curve of test strip for TTX

2.2 蛋白質(zhì)濃度對層析檢測的影響

如圖2所示，樣品中的BSA蛋白質(zhì)含量顯著影響層析檢測的磁信號值，在濃度為0.05 mg/mL時，磁信號與空白對照接近，說明層析檢測效果較好甚至優(yōu)于空白對照(PBS緩沖溶液)，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，層析檢測的磁信號值減小，這說明對層析檢測有不利影響。當濃度達到0.2 mg/mL時，磁信號值顯著降低，遠小于陰性空白對照，表明該濃度BSA對層析檢測信號有顯著的干擾影響。

圖2 BSA濃度對層析檢測的影響Fig 2 Influence of the concentration of BSA on the immunochromatographic detection

2.3 超濾處理條件的優(yōu)化

2.3.1 截留分子質(zhì)量的優(yōu)化

不同截留分子質(zhì)量的超濾處理對免疫層析檢測結(jié)果如圖3所示，從圖中可知，隨著截留分子質(zhì)量的增大，磁信號值先增大后減小，當截留分子質(zhì)量為10 ku時，檢測的磁信號值最大，陰性比值接近100%，與空白對照(0.01 mol/L pH 7.0的PBS緩沖溶液)的層析檢測結(jié)果類似，說明層析檢測結(jié)果最理想。

本結(jié)果表明小分子蛋白質(zhì)，對層析檢測信號的干擾較小，可能是相對較小分子質(zhì)量的蛋白可以增加疏水性并減弱重潤濕作用[19]，也較少地影響抗原抗體的結(jié)合。而相對分子質(zhì)量較大的蛋白會堵塞硝酸纖維素膜等的空間結(jié)構(gòu)，并影響TTX與抗體的結(jié)合，降低層析檢測效果。

圖3 不同截留分子質(zhì)量對層析檢測的影響Fig 3 Influence of molecular weight cut-off on the immunochromatographic detection

2.3.2 超濾處理時間的優(yōu)化

如圖4所示，隨著處理時間的延長，對4 mL樣本的處理所得的濾液體積在前20 min顯著增加，處理時間超過20 min后，濾液體積趨于穩(wěn)定。處理時間在10～20 min時，濾液體積變化較大，且所得濾液得率超過50%。因此，初步優(yōu)化的處理時間為10、15和20 min，通過加標檢測，對處理時間進行進一步的優(yōu)化。

圖4 處理時間對濾液體積的影響Fig 4 Influence of the processing time on the volume of processing fluid

對提取液的加標檢測結(jié)果如圖5所示，磁信號隨著加標濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，這與競爭法檢測原理相符合，表明所選的樣品前處理可以正確檢測TTX。對比同一加標濃度的不同處理時間10、15和20 min時的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)處理時間對磁信號并無顯著差異?？紤]到現(xiàn)場檢測的實效性，確定超濾10 min為最優(yōu)的處理時間。

圖5 不同處理時間的加標檢測結(jié)果Fig 5 Results of detection in different treatment time

2.4 回收率評價

本研究選取了低、中、高3個濃度的TTX對樣品前處理的回收率進行了評價，河豚肌肉組織的加標提取回收率檢測結(jié)果如表1所示。由表1可知，當加標濃度為10 ng/mL時，層析檢測的回收率結(jié)果明顯偏大，此時的檢測結(jié)果為陰性，且該濃度的TTX已經(jīng)超出了標準曲線的線性范圍。當加標濃度為100 ng/mL和1000 ng/mL時，加標回收率在92.4%～126.0%之間，結(jié)果總體比較理想。且這兩個加標濃度的實驗結(jié)果可以通過肉眼觀察進行毒性判斷，適用于進行初篩的現(xiàn)場快速檢測方法[20]。上述結(jié)果表明本研究建立的樣品前處理方法在標準曲線的線性范圍內(nèi)可獲得較高的回收率，但在標準曲線的低濃度和高濃度范圍，磁信號的較小波動均會導致檢測結(jié)果的較大變化。

表1 樣品加標結(jié)果Table 1 Results of detection for sample adding TTX

2.5 前處理方法的比較

本研究表明樣品的前處理技術(shù)會對免疫層析檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。本研究的前處理方法和國標GBT 5009.206—2007的ELISA方法的樣品前處理對比結(jié)果如表2所示。

表2 兩種方法前處理方法比較結(jié)果Table 2 Comparison of two pretreatment methods

由表2可知，ELISA前處理方法步驟復雜繁瑣耗時長，同時無水乙醚有一定的危害。而本研究建立的超濾法處理具有操作簡單、耗時短等優(yōu)點，與免疫層析檢測技術(shù)相配套。

3 結(jié)論

基于免疫檢測技術(shù)的TTX快速現(xiàn)場檢測，具有快速簡便，肉眼判定和大量樣本的初篩等優(yōu)點。而本研究建立的河豚肌肉組織的超濾法樣品前處理技術(shù)，耗時短(約35 min)，操作簡便，可滿足現(xiàn)場檢測對前處理的要求，今后可作為免疫層析檢測技術(shù)的配套樣品處理方法進行應用，具有較好的應用前景。

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Rapid preparation technology for tetrodotoxin based on immunochromatographic detection

FANG Guo-feng, WANG Xi-chang, LIANG Tian-tian, TAO Ning-ping, LU Ying

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation (Shanghai), Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China)

In order to establish a suitable pretreatment method for immunochromatographic detection for tetrodotoxin, in this study，the ultrafiltration technology was applied to optimize the pretreatment. The magnetic immunochromatographic test strip established by our laboratory was used for evaluation. The results showed that the optimal treatment of centrifugation at 4000 r/min for 10 min with a cut off molecular of 10 ku. This method was suitable for immunochromatographic assay with good recovery (92.4%-126.0%). Also, the concentration of protein in the solution reduced after pretreatment. This study provides technical support for rapid on-site test of tetrodotoxin.

tetrodotoxin; pretreatment; ultrafiltration; immunochromatographic detection

2016-04-27；

2016-05-18

上海市科委項目(15320502100)；十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計劃項目(2015BAD17B02)；養(yǎng)殖暗紋東方鲀商品魚凈化和品質(zhì)提升研究：青產(chǎn)學研2015-26

方國鋒，碩士，從事食品營養(yǎng)與安全研究，E-mail：1249400576@qq.com

盧瑛，博士，副教授，研究方向為食品安全檢測、納米生物技術(shù)，E-mail：y-lu@shou.edu.cn

TS254.7

B

2095-1736(2017)01-0094-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.094