向澤敏， 葛俊驛， 邱曉挺， 嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

鯖科魚類活性肽的酶法制備及其生理功能研究進(jìn)展

向澤敏， 葛俊驛， 邱曉挺， 嚴(yán)小軍

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

鯖科魚類作為重要的海洋經(jīng)濟(jì)種類，資源豐富，是食源性蛋白的重要來源，但目前對其綜合利用卻徘徊在較低水平。酶解鯖科魚類蛋白以制備具有抗氧化、降血壓、免疫、抗菌等作用的活性肽是將鯖科魚類進(jìn)行高附加值利用的一條有效途徑。就酶解鯖類蛋白質(zhì)制備活性肽的工藝條件、活性肽常見的分離純化和序列鑒定方法、活性肽的主要生理功能等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，討論了酶法制備活性肽的研究中所面臨的問題和相應(yīng)對策，并對其應(yīng)用前景予以展望。

鯖科；活性肽；酶法制備；分離純化；生理功能

鯖科(Scombridae)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、輻鰭亞綱(Actinopterygii)、鱸形目(Perciformes)、鯖亞目(Scombroidei)，是一類海洋中上層洄游性魚類。其中鯖屬(Scomber)、金槍魚屬(Thunnus)、馬鮫屬(Scomberomorus)、羽鰓鮐屬(Rastrelliger)和鰹屬(Katsuwonus)為鯖科中較常見的重要經(jīng)濟(jì)種類，廣泛分布于全球各大洋的溫帶及熱帶海域[1]。鯖科魚類具有生長快、產(chǎn)量高及營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)。然而，除魚肉直接食用或被加工成低值的生魚片或罐頭等外，大量副產(chǎn)物通常會(huì)被丟棄。其綜合價(jià)值尤其是許多生物活性物質(zhì)均未得到充分開發(fā)與利用，造成了一定的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[2]。

水解蛋白質(zhì)制備活性多肽是一條將鯖科魚類進(jìn)行高附加值利用的有效途徑?；钚噪牡难芯恳殉蔀楫?dāng)前生物活性物質(zhì)開發(fā)的熱門領(lǐng)域之一。現(xiàn)有研究表明活性肽具有多種生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓、抗血栓、抗菌、免疫等，可以作為潛在的藥物、保健品和食品防腐劑。活性較高的多肽通常由2到20個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量一般小于6000 u，而生物體內(nèi)天然存在的活性肽含量低，分離純化困難，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[3]。近年來，酶解技術(shù)在海產(chǎn)品蛋白深加工中被廣泛使用，其水解效率高、條件溫和可控、無副反應(yīng)、適用面廣、酶用量少且來源廣，與酸堿降解相比具有無可比擬的優(yōu)勢[4]。如今，許多現(xiàn)代分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定手段已高效廣泛地應(yīng)用于海洋功能活性肽的研究中[3]。

本文概述了酶法制備鯖科魚類蛋白活性肽的工藝、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定和活性肽生理功能方面的研究進(jìn)展，以期為鯖科魚類蛋白的高值化利用及其活性肽功能開發(fā)的進(jìn)一步研究應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 酶法制備鯖科魚類活性肽及其鑒定

1.1 活性肽酶法制備的工藝條件

蛋白酶水解是最快速、最安全、最易操控的制備活性肽的方法之一，它不但能改善蛋白的生理功能，而且能提高副產(chǎn)物的利用率，減少浪費(fèi)與污染。蛋白酶種類繁多，不同蛋白酶具有不同的催化位點(diǎn)，形成的肽或氨基酸也有所不同，從而獲得具有不同功能的活性肽[3]。影響酶解效率和目標(biāo)多肽得率的因素主要包括蛋白酶種類的選擇、酶濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等，因此，需要對酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。表1 列舉了部分研究酶解鯖科魚類蛋白的工藝條件。由表1可知，同種原料的酶解選擇指標(biāo)不同，最佳蛋白酶的選擇也不同；酶解指標(biāo)相同，因底物不同，酶選擇也會(huì)有所不同；其他條件均相同時(shí)，雙酶酶解的效果一般優(yōu)于單酶解：酶解時(shí)間縮短，酶用量減少，多肽得率提高；當(dāng)其他條件相同，更精準(zhǔn)的優(yōu)化方法會(huì)帶來更優(yōu)的酶解條件[5-8]。

表1 酶解鯖科魚類蛋白的工藝條件Table 1 Optimization of enzymatic hydrolysis of Scombridae fishes

E： 酶用量；S：底物用量；E/S：酶用量與底物用量之比

1.2 活性肽的分離純化

粗酶解液成分復(fù)雜，除含多種肽類外，還有未水解的大分子蛋白和游離氨基酸的存在，故需對其進(jìn)行分離純化。常用于鯖科魚類的方法主要有：超濾法、凝膠過濾層析、離子交換層析和高效液相色譜。

超濾法(Ultrafiltration，UF)是利用截流不同分子質(zhì)量的超濾膜對酶解液進(jìn)行分段來分離出理想分子質(zhì)量大小的肽段。劉哲[9]采用截留分子質(zhì)量為10 000 u 和5000 u 的UF 膜對馬鮫魚(Scomberomorusniphonius)魚肉酶解物進(jìn)行超濾分離，通過截留樣品中的大分子物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對小分子物質(zhì)的富集，使得小于5000 u 的多肽組分活性最高。

凝膠過濾層析(Gel Filtration Chromatography，GFC)是一種以分子大小和形狀差異來分離樣品中各個(gè)組分的色譜分離法。Guerard 等[10]應(yīng)用Superdex Peptide HR 10/30 GFC 柱分析了不同水解度的黃鰭金槍魚(Thunnusalbacares)胃蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布情況。

而酶解物粗品中，副產(chǎn)物較多，影響活性肽組分的因素也較多，單一的分離純化方法往往很難得到較高純度的產(chǎn)品，普遍采用兩種或兩種以上分離分析技術(shù)聯(lián)用的手段。Nguyen 等[11]采用Superdex Peptide 10/300 GL GFC 柱結(jié)合高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)對黃鰭金槍魚酶解物組分進(jìn)行了有效的分離純化。Wang 等[12]通過UF、離子交換柱SP Sephadex C-25、GFC 柱Sephadex G-25 和HPLC 色譜柱TSK gel 3000 PWXL 一系列連續(xù)分離技術(shù)，應(yīng)用活性追蹤法最終從鮐魚(Pneumatophorusjaponicus)水解液中純化出一個(gè)1664 u 的抗氧化肽。

1.3 活性肽序列鑒定

多肽序列中氨基酸的排列順序決定其空間結(jié)構(gòu)及功能特性，因此序列鑒定是活性肽的重要表征手段。鑒定鯖科魚類活性肽序列的方法主要為質(zhì)譜法和Edman 降解法。質(zhì)譜法(Mass Spectrometry，MS)是將待測物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，測定各種離子譜峰的強(qiáng)度，通過對質(zhì)譜中的分子離子峰和碎片離子峰等分析，來求其相對分子質(zhì)量并推測結(jié)構(gòu)的方法。Je 等[13]自大眼金槍魚(Thunnusobesus)暗色肉的胃蛋白酶解液中分離到一個(gè)抗氧化肽，通過Q-TOF MS譜圖的分子離子峰確定肽的分子質(zhì)量為1222 u，串聯(lián)質(zhì)譜分析序列為Leu-Asn-Leu-Pro-Thr-Ala-Val-Tyr-Met-Val-Thr。利用基于經(jīng)典Edman 降解法的蛋白質(zhì)多肽測序儀對多肽N 端進(jìn)行序列測定目前也較為普遍。譚洪亮等[14]從金槍魚魚骨膠原蛋白酶解物分離純化得到一個(gè)抗氧化的10AA，經(jīng)蛋白質(zhì)序列分析儀測定氨基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Gln-Gly，ESI-MS 檢測確定其分子質(zhì)量為839.87 u。

2 鯖科魚類活性肽的生理功能

2.1 抗氧化功能

肽的抗氧化機(jī)制是通過清除體內(nèi)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的具有強(qiáng)氧化性對人體有害的氧自由基、羥自由基來發(fā)揮作用。近年來大量國內(nèi)外研究表明，海洋鯖類蛋白活性肽具有較好的抗氧化活性。Chi 等[15]探討了分別從鰹魚(Katsuwonuspelamis)暗色肉的中性蛋白酶酶解物和堿性蛋白酶酶解物分離得到的13個(gè)和18個(gè)活性肽的氨基酸組成和序列對其抗氧化作用的影響，研究證實(shí)，多肽較低的分子量、疏水性芳香族氨基酸殘基的存在及特定氨基酸序列是影響多肽抗氧化活性的關(guān)鍵因素。不同鯖科物種的蛋白經(jīng)不同蛋白酶酶解純化獲得的抗氧化多肽的序列結(jié)構(gòu)，見表2。

表2 鯖科魚類抗氧化多肽的序列Table 2 The sequences of antioxidant peptides of Scombridae fishes

注：Protease XXIII、MICE 和Orientase 分別來源于曲霉屬真菌、鯖魚盲腸和枯草芽孢桿菌

2.2 降血壓功能

肽的降血壓作用是通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)活性來達(dá)到降血壓的功效。1993 年Matsumura 等[21]最先從鰹魚酶解物中分離到6個(gè)ACE 抑制活性的肽，其中包括5個(gè)三肽和一個(gè)四肽，通過體外ACE 半抑制濃度(inhibitory concentration 50%，IC50) 實(shí)驗(yàn)顯示，具有較強(qiáng)ACE 抑制活性的肽均為三肽，均由疏水性氨基酸組成且C 端均為 Pro。近年來，一些研究報(bào)道了金槍魚蛋白活性肽具有高效的ACE 抑制作用，并對其進(jìn)行序列測定(表3)，發(fā)現(xiàn)通常C 端具有Pro 或Trp、Tyr、Phe 等芳香族氨基酸，N 端為支鏈脂肪族氨基酸的肽易與ACE 結(jié)合，從而抑制其活性。Martinez Alvarez 等[26]借助體外模擬腸道消化作用研究，提高金槍魚副產(chǎn)物酶解組分的ACE和寡肽酶抑制活性。

表3 金槍魚ACE 抑制肽的序列Table 3 The sequences of ACE inhibitory peptides of tuna

—：未檢測

2.3 免疫功能

免疫活性肽是生物體內(nèi)的一種細(xì)胞信號傳遞物質(zhì)，通過內(nèi)分泌、神經(jīng)分泌等作用方式行使功能，生物體內(nèi)含量較低、結(jié)構(gòu)多樣。紀(jì)麗娜[27]利用小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，追蹤分離金槍魚頭酶解物免疫活性組分，采用噻唑藍(lán)MTT 比色法、中性紅實(shí)驗(yàn)、Griess 法和酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)分別測定免疫組分對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞代謝活性的影響、吞噬功能的影響、釋放NO 的影響和分泌腫瘤壞死因子、白介素-6 的影響，結(jié)果顯示，在一定劑量范圍內(nèi)活性肽組分可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖且無細(xì)胞毒害。

2.4 其他功能

除以上生理功能外，鯖類活性肽還具有降血脂、抗菌、抗疲勞活性和鐵結(jié)合能力。王玉明等[28]研究鰹肝臟水解物對大鼠脂肪代謝的影響，結(jié)果表明，鰹肝臟水解物能降低血液和肝臟中引起動(dòng)脈粥樣硬化以及脂肪肝的甘油三酯濃度。Ennaas 等[29]從鯖魚(Scomberscombrus)副產(chǎn)物的復(fù)合酶酶解物中分離到4個(gè)抗菌肽，其中序列為Ser-Ile-Phe-Ile-Gln-Arg-Phe-Thr-Thr的肽對革蘭氏陽性菌Listeriainnocua和革蘭氏陰性菌E.coli均具有較好抗菌活性的抑菌作用。Wang 等[30]對鮐魚酶解物中分離得到小于2500 u 的組分進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗疲勞試驗(yàn)，在觀察小鼠生理指標(biāo)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在一定程度上可以緩解小鼠疲勞癥狀且推斷其抗疲勞作用機(jī)制可能與其抗氧化效應(yīng)有關(guān)。王攀峰等[31]從馬鮫魚加工副產(chǎn)物中制備純化得到3個(gè)不同的鐵結(jié)合肽段，其氨基酸序列和分子質(zhì)量分別為Asn-Pro-Val-Arg-Gly-Asn(656.104 u)、Asn-Pro-Asp-Arg-Gly-Asn(672.079 u)和Ser-Thr-Tyr-Glu-Leu-Thr-Phe(861.104 u) 。前兩者較強(qiáng)的鐵結(jié)合力可能與含Asn 和Pro 量較高有關(guān)，后者可能由于Thr 含量較高有關(guān)。鐵結(jié)合肽將有助于新型鐵制劑的研發(fā)，可能對缺鐵性貧血有輔助治療作用。

3 討論

海洋中的鯖科魚類資源豐富，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，尤其富含蛋白質(zhì)和生理活性物質(zhì)。來自鯖科魚類蛋白質(zhì)的活性肽在食品、醫(yī)療等多方面具有廣闊的應(yīng)用前景。運(yùn)用低成本、高效率、低污染的可控酶解技術(shù)制備鯖類蛋白活性肽的研究已取得較大進(jìn)展，但在今后的研究中仍存在一定問題，亟待探討與解決。

首先，選擇合適的蛋白酶是首要任務(wù)，許多已知的商業(yè)蛋白酶已得到廣泛應(yīng)用，但利用具有特異切割位點(diǎn)和切割特性的新型蛋白酶酶解鯖類蛋白制備活性肽的報(bào)道并不多見。目前，大多商業(yè)蛋白酶酶活的最適溫度一般在30°C 以上，可能會(huì)對多肽的活性產(chǎn)生一定影響，可考慮采用基因重組表達(dá)特定的蛋白酶[32]或從海洋微生物的代謝產(chǎn)物中分離低溫蛋白酶[33]作為水解工具。要獲得更多結(jié)構(gòu)新穎、功能特異的活性肽，必須著力開發(fā)新型工具蛋白酶。

其次，酶解工藝技術(shù)也是整個(gè)研究的重要環(huán)節(jié)。由于酶解體系較復(fù)雜，影響因素甚多,尋找一個(gè)高精度的優(yōu)化模型，如利用正交、響應(yīng)面結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬[34]，并建立一套高效的酶解工藝優(yōu)化機(jī)制就顯得尤為重要。

再次，活性肽的分離純化及序列鑒定的研究仍面臨極大挑戰(zhàn)。鑒于酶解物成分復(fù)雜、存在分子質(zhì)量、極性及其他性質(zhì)相近的不同肽類，合理選擇有效的技術(shù)路線從酶解物中高效分離到純度較高、活性良好的多肽方面的研究有待加強(qiáng)。而且，應(yīng)研究出更有效的多肽序列鑒定策略，解決可能會(huì)因非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的存在或肽內(nèi)部環(huán)化而致的測序失敗[9]問題。此外，加深對活性肽的序列結(jié)構(gòu)研究，分析其間構(gòu)效關(guān)系[35]，可為將來實(shí)現(xiàn)定向獲取活性肽創(chuàng)造可能。

最后，鯖類蛋白活性肽雖已有抗氧化、抗高血壓、免疫等活性方面的研究，但關(guān)于抗腫瘤、降血糖等更多生理作用的研究還存在欠缺，可通過后期的化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾技術(shù)賦予或改善其功能[31]，定向獲得目標(biāo)活性肽。同時(shí)活性肽的具體作用機(jī)理和途徑尚未完全明確，且其活性測定現(xiàn)僅局限于體外和小鼠實(shí)驗(yàn)，安全性及有效性仍需通過藥理學(xué)研究來論證。

綜上所述，鯖科魚類蛋白活性肽可能會(huì)成為功能食品和醫(yī)藥的有效成分，其多種活性使其具有作為食品添加劑、營養(yǎng)保健品或藥物等有效成分的極大潛力。國內(nèi)已有鯖科金槍魚多肽蛋白試產(chǎn)和鮐魚多肽功能飲料等初步商業(yè)化應(yīng)用研究，盡管與國外發(fā)達(dá)國家相比仍存在較大差距，但隨著我國科研工作者對鯖科魚類的深入研究和新技術(shù)的引進(jìn)，相信國內(nèi)未來鯖科魚類活性肽的產(chǎn)業(yè)化工作必將取得突破性進(jìn)展。

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Progress in bioactive peptides obtained by enzymatic hydrolysis of Scombridae proteins

XIANG Ze-min, GE Jun-yi, QIU Xiao-ting, YAN Xiao-jun

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education,School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Scombridae fishes, as economically important marine species, are abundant sources of food proteins. Their comprehensive utilization rate, however, is still at a low level. Bioactive peptides with various biological activities such as antioxidation, anti-hypertension, immunization and antibacterial prepared by enzymatic hydrolysis is an efficient way for higher added-value of Scombridae fishes. This paper reviewed the conditions of enzymatic hydrolysis of Scombridae proteins, the approaches for purification and identification as well as the primary physiological functions of Scombridae peptides. Furthermore, the problems and corresponding countermeasures were discussed and potential applications of bioactive peptides from hydrolysates of Scombridae fishes were summarized.

Scombridae; bioactive peptides; enzymatic hydrolysis; purification; physiological functions

2016-07-15；

2016-08-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400683)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ14C050001)；寧波大學(xué)人才引進(jìn)啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(013-E00843134702、 013-E00843144702、013-421504460)；寧波大學(xué)王寬誠基金

向澤敏，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ蠊δ苄远嚯?，E-mail: xzm1411074792@163.com

邱曉挺，博士，講師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)，E-mail: xiaotingqiu@126.com

S917.4；TS254.9

A

2095-1736(2017)01-0065-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.065