穆方申, 苗 亮, 李明云, 胡 謀, 陳 炯, 張 浩

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

微衛(wèi)星技術(shù)篩選大黃魚耐低溫標(biāo)記

穆方申, 苗 亮, 李明云, 胡 謀, 陳 炯, 張 浩

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315211)

為篩選大黃魚耐低溫性狀相關(guān)分子標(biāo)記，對(duì)大黃魚進(jìn)行降溫實(shí)驗(yàn)(15℃降至6℃)后用SSR標(biāo)記對(duì)低溫敏感個(gè)體和低溫耐受個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增分析。結(jié)果顯示：10對(duì)SSR引物共擴(kuò)增到39個(gè)條帶，僅標(biāo)記KPC43的擴(kuò)增條帶在低溫敏感和低溫耐受個(gè)體間的出現(xiàn)頻率存在顯著差異。標(biāo)記KPC43共擴(kuò)增到3個(gè)等位基因，其中KPC43170bp在低溫耐受組中出現(xiàn)的頻率(80.0%)顯著高于低溫敏感組(23.33%)，該條帶與大黃魚耐低溫能力存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.498；KPC43150bp在低溫敏感組中出現(xiàn)的頻率(76.67%)顯著高于低溫耐受組(30.0%)，與大黃魚耐低溫能力存在極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到-0.417。序列比對(duì)顯示KPC43170bp僅核心序列比KPC43150bp多了10個(gè)(TG)重復(fù)。推測(cè)SSR標(biāo)記KPC43可能與大黃魚耐低溫性狀相關(guān)基因連鎖，其核心序列的重復(fù)次數(shù)可能與該基因的表達(dá)活性有關(guān)，從而影響大黃魚個(gè)體的耐低溫能力。

大黃魚；耐低溫；微衛(wèi)星標(biāo)記

大黃魚是一種暖水性魚類，是浙江、福建兩省的重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來，我國(guó)東南沿海在冬季常受寒潮侵襲，并多次出現(xiàn)特大寒潮，降溫幅度大、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，養(yǎng)殖海域水溫持續(xù)偏低，導(dǎo)致大黃魚被大量?jī)鏊溃?jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[1-2]。因此有必要研究低溫對(duì)大黃魚的影響，選育耐低溫能力強(qiáng)的大黃魚。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種成為培育具有優(yōu)良性狀新品種的一種重要方法。例如在鯉魚抗寒新品種荷包紅鯉的選育及其后續(xù)研究中，梁利群等[3-5]利用RAPD技術(shù)獲得6個(gè)與鯉魚耐寒相關(guān)的標(biāo)記，并且將其中1個(gè)標(biāo)記定位在鯉魚的第5號(hào)連鎖群上；潘賢等[6]篩選出2個(gè)與鯉魚抗寒性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用在鯉魚抗寒新品種的選育中起到了重要作用；黃海水產(chǎn)研究所的研究人員[8]在開發(fā)了半滑舌鰨雌性特異性AFLP標(biāo)記的基礎(chǔ)上，研究了培育單性群體的方法。

微衛(wèi)星標(biāo)記(Simple sequence repeat, SSR)是進(jìn)行遺傳分析和鑒定的有力手段之一，具有分布廣泛、呈孟德爾共顯性遺傳、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)[9]，目前已經(jīng)篩選到了羅非魚體重與體長(zhǎng)性狀[10-11]、虹鱒抗肝胰臟壞死病性狀[12]、褐牙鲆耐熱性狀[13]相關(guān)的多種SSR標(biāo)記。在大黃魚的研究中，高國(guó)強(qiáng)等[14]、王惠儒等[15]分別發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星標(biāo)記LYC002和LYC0015可能與大黃魚的耐低溫能力有關(guān)。這說明大黃魚耐低溫性狀可能受基因的控制，使用SSR篩選大黃魚的耐低溫標(biāo)記是可行的。

筆者所在課題組先后通過分析低溫下大黃魚血清生化、抗氧化水平、肝臟蛋白質(zhì)組、脂肪酸含量的變化探討了大黃魚低溫應(yīng)激和適應(yīng)的機(jī)理[16-19]，并且雙向電泳分析顯示經(jīng)過低溫選擇后大黃魚肝臟蛋白質(zhì)組中與抗細(xì)胞凋亡、能量供應(yīng)等功能相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)[20]。課題組運(yùn)用群體選育技術(shù)、經(jīng)連續(xù)5代選育獲得的新品種大黃魚“東海1號(hào)”不但生長(zhǎng)速度快，而且耐低溫能力也大幅提高[21]，但我們認(rèn)為大黃魚的耐低溫能力仍有較大提高余地，有必要做進(jìn)一步、更有針對(duì)性的遺傳育種。本研究利用10對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)降溫實(shí)驗(yàn)中的“東海1號(hào)”大黃魚低溫敏感和低溫耐受個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增分析，旨在尋找與大黃魚耐低溫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，以期為耐低溫品系選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用“東海1號(hào)”大黃魚200尾，于2012年12月取自浙江省象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司養(yǎng)殖網(wǎng)箱，實(shí)驗(yàn)魚健康無傷，體重43.5～45.5 g，體長(zhǎng)13.2～15.6 cm。

實(shí)驗(yàn)開始前，將魚置于0.86 m2×1.3 m 的水泥池中，在水溫(15.0±0.5)℃下暫養(yǎng)1周，避免其他應(yīng)激因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾。用THD-1006型低溫恒溫槽(寧波天恒儀器廠)進(jìn)行降溫和控溫，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚以0.5℃/48 h速率降溫，直至6℃。溫度降到6℃后，持續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)用水為象山港大黃魚養(yǎng)殖海區(qū)的沙濾海水，魚暫養(yǎng)與試驗(yàn)期間，早晚各換水1次，每次換水量1/3，換水前新水先預(yù)冷，并保持換水前后溫差在±0.2 ℃范圍之內(nèi)，對(duì)溫度降到9℃之前對(duì)低溫不能耐受的個(gè)體(低溫敏感)和降至6 ℃且維持5 d后仍能良好存活的個(gè)體(低溫耐受)進(jìn)行采樣，剪取鰭條液氮速凍后-80℃保存，用常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2 微衛(wèi)星分析

采用An等[22]開發(fā)的10對(duì)大黃魚微衛(wèi)星引物，序列及擴(kuò)增參數(shù)見表1，引物由生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積20 μL，包括10 μL 2XTaqpremix-Dye(上海博彩生物科技有限公司)、上下游引物各1 μL、DNA模板1μL、超純水7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次;最后72 ℃再延伸10 min。

表1 微衛(wèi)星引物信息Table 1 The characteristics of the 11 microsatellite loci isolated from Pseudosciaena crocea

聚丙烯酰胺凝膠電泳的步驟主要參照張秀華等人的實(shí)驗(yàn)[23]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物首先用1.5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，以100 bp DNA Ladder作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束后，EB溶液染色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照進(jìn)行檢測(cè)。然后進(jìn)行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。先將玻璃板使用乙醇擦拭干凈后固定，灌入8% 變性聚丙烯酰胺凝膠，灌完膠后立即將齒梳插入膠面，室溫放置2 h或密封于4 ℃冰箱過夜聚合。800 V電壓進(jìn)行0.5 h的預(yù)電泳。樣品處理如下：PCR產(chǎn)物與變性上樣緩沖液按1∶1體積混合均勻， 95 ℃變性5 min后，放于冰上冷卻3 min復(fù)性后點(diǎn)樣，再使用1000 V電壓電泳3～4 h。電泳完畢后使用100%冰醋酸搖床固定30 min后漂洗，硝酸銀染色30 min，染色結(jié)束使用預(yù)冷的顯色液顯色，出現(xiàn)條帶后放入冰醋酸終止顯色。使用Quantity One 4.62 (Bio-Rad公司)凝膠成像后統(tǒng)計(jì)、分析條帶。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS15.0軟件對(duì)微衛(wèi)星擴(kuò)增等位基因片段與大黃魚耐低溫性狀這兩個(gè)變量進(jìn)行皮爾遜檢驗(yàn)(Pearson correctlation)，檢測(cè)有差異的等位基因片段與大黃魚耐低溫性狀是否具有相關(guān)性。

1.4 差異等位基因片段的克隆、測(cè)序及序列比對(duì)

利用凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)從8%的PAGE凝膠中回收和純化特異的目的片段，將其連接到PMD19-T vector(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)入DH5α菌株，每個(gè)特異片段隨機(jī)挑取3個(gè)重復(fù)的陽(yáng)性克隆送至Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAstar軟件對(duì)特性片段序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 10對(duì)微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增特征

表2 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增特征Table 2 The genetic diversity of 10 microsatillite loci from Pseudosciaena crocea

本研究所用的10對(duì)微衛(wèi)星引物均能擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶，且均為多態(tài)性位點(diǎn)；10對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)為3～6 個(gè)，共擴(kuò)增到39個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物3.9個(gè)；觀測(cè)雜合度為0.223～0.964(平均0.527)，期望雜合度范圍0.346～0.779(平均0.552)；多態(tài)信息含量PIC范圍為0.376～0.667(平均0.531)，其中6個(gè)位點(diǎn)呈高度多態(tài)性(PIC>0.5)，具體見表2。表明獲得了較豐富的SSR標(biāo)記遺傳信息。

2.2 兩個(gè)差異等位基因片段與耐低溫的相關(guān)性

對(duì)低溫耐受和低溫敏感兩組大黃魚間10對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果分析顯示，僅KPC43位點(diǎn)的等位基因在低溫敏感組和低溫耐受組之間具有明顯差異(圖1)。在KPC43位點(diǎn)，兩組大黃魚中均檢測(cè)到3個(gè)等位，其中KPC43170bp在低溫耐受組中有80 %擴(kuò)增出了該片段，而低溫敏感組中僅有23.33 %擴(kuò)增出該片段，該等位基因片段在低溫耐受特性有較明顯的偏好性；KPC43150bp在低溫耐受組中有30 %擴(kuò)增出該片段，而低溫敏感組30個(gè)個(gè)體中有76.67 %擴(kuò)增出該片段，該等位基因片段對(duì)大黃魚的低溫敏感特性有較明顯的偏好性(表3)。

泊松相關(guān)系數(shù)顯示(表3)， KPC43170bp差異等位基因與耐低溫性存在極顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.498；KPC43150bp差異等位基因與耐低溫性存在極顯著的負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.417。

圖 1 微衛(wèi)星引物KPC43擴(kuò)增的兩群體間差異顯著的部分條帶Fig 1 Significantly different band amplified by microsatellite primer KPC43

注：1～10為低溫敏感組；11～30為低溫耐受組；M：PUC19 DNA ladder

表 3 KPC43位點(diǎn)差異等位基因在各組中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistic of two differential alleles of microsatellite loci KPC43

**：在0.01置信度極顯著相關(guān)

圖2 KPC43位點(diǎn)2個(gè)差異等位基因片段序列的比對(duì)結(jié)果Fig 2 Sequence alignment of two alleles from locus KPC43

序列比對(duì)結(jié)果表明，微衛(wèi)星位點(diǎn)KPC43兩個(gè)差異等位基因片段序列的差別僅在于(TG)重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同，KPC43170bp比KPC43150bp在(TG)重復(fù)單位上多重復(fù)了10次。

3 討論

水溫對(duì)魚類的生存和代謝有著至關(guān)重要的影響[24]。大黃魚是一種溫水性魚類，對(duì)低溫較為敏感，在寒流到來時(shí)常有大黃魚凍死，造成經(jīng)濟(jì)損失。徐鎮(zhèn)等[25]的研究顯示浙江岱衢洋大黃魚對(duì)低溫的耐受能力要高于福建群體，但水溫低于6℃時(shí)也大量死亡。對(duì)大黃魚的低溫脅迫實(shí)驗(yàn)和越冬期血清生化、脂肪酸組成等研究顯示，大黃魚有一定的低溫適應(yīng)能力，在一定的低溫范圍內(nèi)魚體會(huì)通過調(diào)整自身代謝進(jìn)行應(yīng)對(duì)，并可通過增加不飽和脂肪酸的含量來增加低溫下質(zhì)膜的流動(dòng)性[17,20]，并且經(jīng)過多代選育后選育群體的耐低溫能力會(huì)有所加強(qiáng)[21]。但目前對(duì)大黃魚的低溫適應(yīng)機(jī)理仍缺少足夠深入了解，也未見有關(guān)于大黃魚影響耐低溫性狀關(guān)鍵基因的報(bào)道。在某些極地魚類中，抗凍蛋白是其能耐受0℃以下低溫的重要機(jī)制之一[26]。大黃魚雖然也有編碼抗凍蛋白的基因，但其抗凍蛋白并沒有明顯的抗凍活性[27]。另外，即使將極地魚類的抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入大西洋鮭、羅非魚等魚類中，也并未提高其耐低溫能力[28]。因此，篩選與大黃魚耐低溫性狀相連鎖的分子標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助育種可能是培育耐低溫大黃魚的一條可行途徑。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有分布廣泛、呈孟德爾共顯性遺傳、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)[9]，被廣泛用于遺傳分析和鑒定的研究中。本研究用10對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)“東海1號(hào)”大黃魚的低溫敏感個(gè)體和低溫耐受個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增分析，共得到39個(gè)條帶，平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.527、0.552，多態(tài)信息含量PIC范圍平均為0.531，其中6個(gè)位點(diǎn)呈高度多態(tài)性(PIC>0.5)。雖然獲得了較豐富的SSR標(biāo)記遺傳信息，但10對(duì)SSR引物中僅KPC43擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)頻率在低溫敏感組和低溫耐受組之間存在顯著差異。高國(guó)強(qiáng)等[14]和王惠儒等[15]分別用5對(duì)和13對(duì)SSR引物對(duì)低溫選育的大黃魚和對(duì)照組進(jìn)行擴(kuò)增比較，也都是僅有1對(duì)引物的擴(kuò)增條帶在兩組間存在差異。SSR標(biāo)記篩選大黃魚耐低溫相關(guān)標(biāo)記的篩選率較低，可能是使用的標(biāo)記數(shù)量不夠多、對(duì)基因組覆蓋面較窄有關(guān)，可以嘗試使用諸如DArT基因芯片[29]、轉(zhuǎn)錄組分析[30]等技術(shù)進(jìn)行更加全面、細(xì)致地篩選。

筆者對(duì)微衛(wèi)星引物KPC43擴(kuò)增條帶的分析顯示，等位基因KPC43170bp和KPC43150bp分別與耐低溫性狀呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.498和-0.417，推測(cè)該微衛(wèi)星位點(diǎn)可能與某種耐低溫基因存在一定的連鎖關(guān)系。測(cè)序后比對(duì)KPC43位點(diǎn)這兩個(gè)等位基因在微衛(wèi)星核心序列的重復(fù)次數(shù)上存在差別，KPC43170bp中(TG)重復(fù)有12個(gè)，而KPC43150bp中(TG)重復(fù)僅2個(gè)。Streelman的研究顯示SSR位點(diǎn)核心單元的重復(fù)次數(shù)會(huì)影響與其緊密連鎖的基因的轉(zhuǎn)錄活性[31]。筆者推測(cè)大黃魚低溫敏感個(gè)體中的某個(gè)抗寒基因的(TG)重復(fù)單元重復(fù)的丟失影響了其表達(dá)活性，從而影響其耐低溫能力。高國(guó)強(qiáng)等[14]和王惠儒等[15]的研究結(jié)果均顯示：篩選出來SSR標(biāo)記其核心單元重復(fù)次數(shù)和耐低溫性狀呈一定相關(guān)關(guān)系，核心單元重復(fù)次數(shù)多的等位基因更多出現(xiàn)在低溫耐受組，而核心重復(fù)次數(shù)少的等位基因更多出現(xiàn)在正常對(duì)照組。這些研究結(jié)果也符合微衛(wèi)星逐步突變模型(SMM)[32-34]。

雖然微衛(wèi)星標(biāo)記KPC43與大黃魚耐低溫性狀相關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究該標(biāo)記與大黃魚耐低溫能力的直接關(guān)系。另外，該標(biāo)記是否與耐低溫相關(guān)的功能基因相連鎖，以及能否應(yīng)用于育種實(shí)踐中，都是今后需要繼續(xù)探索的。

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Screening of microsatellite markers associated with cold tolerance of large yellow croaker (Pseudosciaenacrocea)

MU Fang-shen, MIAO Liang, LI Ming-yun, HU Mou, CHEN Jiong, ZHANG Hao

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, the large yellow croakers Donghai No.1 was divided into cold-tolerant and cold-sensitive two groups by reducing water temperature from 15℃ to 6℃ gradually, and then the molecular marker which linked to the resistance to low temperature was screened by microsatellite markers (SSR) analysis. The results showed that 39 alleles were amplified using 10 SSR primers, and only the alleles frequence of locus KPC43 had significant difference between the cold-tolerant group and the cold-sensitive group. In the three alleles of KPC43, the occurrence frequency of KPC43170bpwas 80.0% in the cold-tolerant group, while its occurrence frequency was only 23.33% in the cold-sensitive group. Correlative analysis showed that there was a significant positive correlation between KPC43170bpand cold-tolerant trait (P<0.01), and the correlation coefficient was 0.498. In the cold-sensitive group, the frequency of the KPC43150bp(76.67%) was significantly higher than that in the cold-tolerant group (30.0 %). And there was a significant negative association with the KPC43150bpand cold-tolerant related character (P<0.01), and the correlation coefficient was-0.417. Sequence alignment showed that the microsatellite flanking regions of KPC43170bpand KPC43150bpwere the same, while the repeat sequence was (TG)12in KPC43170bpand (TG)2in KPC43150bp. It can be speculated that SSR marker KPC43 may be linked to some cold tolerant gene of large yellow croaker, and the repeat numbers of (TG) may affect these gene′s expressing activity, which is associated to the ability of cold tolerance.

Pseudosciaenacrocea; low temperature tolerant; microsatellite marker

2016-03-10；

2016-03-23

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2012AA10A403-4)；浙江省重大科技專項(xiàng)優(yōu)先主題(2009C12077; 2012C12907-8)；寧波市重大項(xiàng)目(2008C3005)

穆方申，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:mufangshen@126.com

李明云，教授，研究方向?yàn)轸~類遺傳育種與種質(zhì)保護(hù)，E-mail: limingyun@nbu.edu.cn

Q958.8; S917.4

A

2095-1736(2017)01-034-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.034