栗亞美， 陳阿娜， 楊艷坤， 白仲虎

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122; 2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部

酸性普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶在大腸桿菌中分泌表達研究

栗亞美1,2,3， 陳阿娜1,2,3， 楊艷坤1,2,3， 白仲虎1,2,3

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122; 2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部

重點實驗室， 無錫 214122; 3. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

來自于酸性普魯蘭芽孢桿菌的普魯蘭酶，由于分子量較大，在大腸桿菌中難以實現(xiàn)高效分泌表達。為研究其在E.coli中高效分泌表達策略，構(gòu)建了帶信號肽的pET-28a(+)-pelB-pul13A質(zhì)粒，通過發(fā)酵過程控制及向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加促分泌物質(zhì)，系統(tǒng)地優(yōu)化了分泌表達策略。通過分子改造，帶信號肽的表達系統(tǒng)實現(xiàn)了低水平的分泌性表達；進一步通過優(yōu)化培養(yǎng)基、誘導溫度、IPTG濃度、誘導時機及11種培養(yǎng)基添加物，促進普魯蘭酶最大限度的分泌到周質(zhì)空間。實驗結(jié)果顯示，連上pelB信號肽的pull3A在TB/SB培養(yǎng)基中，通過優(yōu)化的誘導條件(IPTG濃度0.1 mmol/L，誘導溫度20℃，誘導時機為接種后5 h)，在誘導20 h時加入0.03%SDS，周質(zhì)空間酶活達到最大值102.5 U/mL。在此基礎上，探究了化學添加劑對大腸桿菌細胞膜及膜通透性的影響，并應用優(yōu)化后的系統(tǒng)實現(xiàn)了乙酰膽堿酯酶和單域抗體的分泌表達。為大分子蛋白在大腸桿菌中分泌表達提供參考。

普魯蘭酶；分泌表達；信號肽；發(fā)酵優(yōu)化；培養(yǎng)基添加物；十二烷基磺酸鈉

普魯蘭酶是一種淀粉脫支酶，能專一性的切開α-1,6糖苷鍵，是淀粉加工業(yè)和制糖工業(yè)必不可少的酶制劑[1-3]。目前，各國學者已篩選得到多種能夠產(chǎn)生普魯蘭酶的微生物[4]：如諾維信公司篩選的酸性普魯蘭芽孢桿菌產(chǎn)生的嗜酸耐熱型普魯蘭酶，分子質(zhì)量105.4 ku，最適pH 4.5～5.5，最適反應溫度60℃，能較好地契合淀粉糖化工藝要求。但是野生宿主往往產(chǎn)普魯蘭酶量較低，或難以培養(yǎng)，限制了其在工業(yè)化過程中的應用。隨著基因重組技術的發(fā)展，多種普魯蘭酶基因在不同的宿主中得以功能性表達。其中大腸桿菌是表達異源蛋白最常用的宿主，主要基于大腸桿菌易于培養(yǎng)、基因操作簡單和可進行高密度培養(yǎng)等優(yōu)點[5]。Zouari等將Ⅰ型普魯蘭酶基因在大腸桿菌DH5α中表達，在連接脂肪酶A信號肽后，周質(zhì)空間酶活達到2.6 U/mL[6]。

然而，大腸桿菌在表達外源蛋白(尤其是大分子蛋白)的過程中，目的蛋白易在胞內(nèi)積累，部分蛋白會形成包涵體，進而加大了下游分離純化的難度[7]。因此，在大腸桿菌中實現(xiàn)分泌表達引起了廣泛的關注。大腸桿菌分泌重組蛋白主要通過兩種分泌系統(tǒng)，I型分泌系統(tǒng)和II型分泌系統(tǒng)。在I型分泌系統(tǒng)中，重組蛋白通過內(nèi)膜蛋白HlyB和HlyD，外膜蛋白TolC直接分泌到培養(yǎng)基。II型分泌系統(tǒng)重組蛋白需先被轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間然后再轉(zhuǎn)運到胞外，目前已知的參與重組蛋白分泌到周質(zhì)空間的途徑主要包括SecB途徑(應用廣泛)，SRP途徑(轉(zhuǎn)運正在折疊的蛋白)和TAT途徑(轉(zhuǎn)運折疊好的蛋白)，研究表明這3種分泌途徑存在相互影響。盡管如此，重組蛋白分泌到周質(zhì)空間甚至是培養(yǎng)基中還是非常困難，而且大腸桿菌編碼分泌系統(tǒng)蛋白需要在合適的基因和環(huán)境條件下。針對這兩種分泌策略，相關研究采取了不同的方法優(yōu)化分泌表達途徑[5]。如嚴偉等[4]采用大腸桿菌系統(tǒng)表達長野芽孢桿菌普魯蘭酶時，在誘導階段添加0.08 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L Na+，使得胞外酶活提高至8.1 U/mL，是不加任何添加劑的10.3 倍。段緒國等[8]在大腸桿菌表達普魯蘭酶，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下通過培養(yǎng)時添加20 mmol/L甜菜堿，周質(zhì)空間酶活達到49.5 U/mL。許多研究表明化學/小分子生物添加物對促進大腸桿菌分泌表達效果顯著[9]，根據(jù)其作用機理可分為3類。作用于內(nèi)膜的TritonX-100，Tween-80，SDS等；作用于外膜的甘氨酸，Ca2+等；起滲透調(diào)節(jié)作用的Na+、甜菜堿、蔗糖、山梨醇等[8-16]。在前期的研究中，本實驗室通過試錯法實現(xiàn)了Pul13A通過表達載體pET-22b(+)和pET-28a(+)在大腸桿菌BL21(DE3)中的可溶性表達[17]，但分泌效果卻不甚理想。因此，本研究通過信號肽，發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化與控制及培養(yǎng)基添加物等策略，以期最大限度地提高大分子蛋白普魯蘭酶的分泌。其中關于培養(yǎng)基添加物的研究，涵蓋了11種已經(jīng)發(fā)表過的促分泌物質(zhì)并進一步研究了不同培養(yǎng)基添加物對大腸桿菌細胞膜的影響。最終，將優(yōu)化后的體系應用于分泌表達不分泌蛋白乙酰膽堿酯酶和單域抗體。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

重組質(zhì)粒pET-22b(+)-pul13A、pET-28a(+)-pul13A由本實驗室構(gòu)建并保藏。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)(北京全式金生物技術有限公司)。乙酰膽堿酯酶(aChE)和單域抗體(scFv)基因由本實驗室其他課題組提供。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶，DNA聚合酶購自NEB；T4 DNA連接酶購自Therom (USA)；isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG)，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物柱純化試劑盒，羧芐青霉素，卡那霉素購自上海生工生物工程公司；引物由上海生工生物工程公司合成；普魯蘭和3-吲哚乙酸酯購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；酵母膏、蛋白胨(OXOID，UK)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-pul13A的構(gòu)建

以pET-22b(+)-pul13A為模板，采用PCR方法擴增pelB-pul13A，引物如表1所示。

表1 PCR所用引物Table 1 Primers for PCR

PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化試劑盒純化、BglⅡ和XhoⅠ雙酶切后與同樣雙酶切的載體pET-28a(+)-pul13A連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，得到BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-pul13A。

1.2.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，胰蛋白胨10，NaCl 10。TB/SB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨24,酵母提取物48，KH2PO4 2.31,K2HPO4 9.85,glycerol 25,pH 7.0。自誘導培養(yǎng)基(g/L)[9,15]：10 α-乳糖,0.5蔗糖,5甘油,3.4 KH2PO4,1.2 MgSO4, 10 N-Z amine AS, 8.95 Na2HPO4,1.42 Na2SO4，2.67 NH4Cl, 1000× trace mineral solution 1 mL(μmol/L): 50 FeCl3, 20 CaCl2, 10 MnCl2, 10 ZnSO4, 2 CoCl2, 2 CuCl2, 2 NiCl2, 2 NiCl2, 2 Na2Mo7O4, 2 Na2SeO3, 2 H3B4O7。

1.2.3 培養(yǎng)條件及發(fā)酵優(yōu)化

將-80℃保存的甘油菌BL21(DE3)-pET-28b(+)-pelB-pul13A，以2%接種量接種于加入卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，230 r/min培養(yǎng)8 h，以4%接種量轉(zhuǎn)接新鮮的LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)10 h，控制接種D600 nm=0.05接種到新鮮的TB/SB(LB或者自誘導培養(yǎng)基)中37℃，230 r/min培養(yǎng)一定時間(0、3、5、8、10和12 h)后，加入不同濃度IPTG(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L)于不同溫度誘導36 h收獲，并檢測D600 nm，上清酶活，周質(zhì)空間酶活。

1.2.4 細胞分級處理

取發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，上清組分用來測上清酶活。加入等體積的OSⅠ緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl、20%蔗糖、1 mmol/L EDTA、pH 8.0)，室溫緩慢攪拌10 min，10 000 r/min離心10 min，上清即為OSⅠ組分。加入等體積冰凍的5 mmol/L MgSO4，冰上緩慢攪拌10 min，10 000 r/min離心10 min，上清即為OSⅡ組分，周質(zhì)空間酶活為OSⅠ組分酶活與OSⅡ組分酶活之和。

1.2.5 普魯蘭酶活的測定

根據(jù)Kang等[18]的酶活測定方法，并作適當調(diào)整：0.1 mL粗酶液(上清組分或周質(zhì)空間組分)加入到含有0.2 mL 1%普魯蘭糖的100 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液的EP管內(nèi)，混勻，60℃水浴10 min，迅速加入0.45 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)，沸水浴10 min，于冰上冷卻后稀釋20倍測定D540 nm吸光度，并根據(jù)標準曲線，計算出酶活。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘分解鋪魯蘭糖所釋放的還原碳水化合物的毫克數(shù)，其還原力相當于產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.2.6 掃描電子顯微鏡下的細胞形態(tài)觀察

收集發(fā)酵36 h的新鮮菌液，3000 r/min離心后用6%戊二醛和100 mmol/L磷酸鹽緩沖液于4℃過夜固定。磷酸鹽緩沖液洗滌過夜固定菌體，OsO4(100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)進行后固定，重懸于150 mmol/L瓊脂糖，無水乙醇脫水，最后嵌入環(huán)氧類樹脂中。包埋好的樣品用真空蒸發(fā)器噴涂Au/Pd, 以10 kV的加速電壓用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)[19]。

1.2.7 細胞內(nèi)外膜通透性的測定

細胞內(nèi)外膜通透性的測定方法根據(jù)[20]并作適當調(diào)整：12 000 r/min 5 min離心收集菌體，用PBS洗滌2次，固定終D600 nm=0.5。取經(jīng)過上述處理的新鮮菌液200 μL，于96孔板中加入1.1 g/L鄰硝基苯β-D-半乳糖苷(ONPG)20 μL或頭孢硝噻吩(Nitrocefin)20 μL，利用酶標儀檢測D420 nm或者D500 nm變化以顯示內(nèi)膜或外膜通透性的改變。

1.2.8 乙酰膽堿酯酶(AChE)和單域抗體(ScFv)的分泌表達

合成5′-GGATCCTACGTACAAGCTT-3′和5′-AAGCTTGTACGTAGGATCC-3′兩條互補的含有BamH I,SnaB I和Hind III 3個限制性內(nèi)切酶酶切位點的寡核苷酸鏈，于PCR儀中進行常規(guī)退火反應。用BamH I和Hind III分別處理退火后的雙鏈和pET-28a(+)-pelB-pul13A，然后連接轉(zhuǎn)化。將連接轉(zhuǎn)化后的重組菌質(zhì)粒和pPIC9K-aChE分別用SnaB I和NotI酶切，連接轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，構(gòu)建BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-aChE。將pET-28a(+)-pelB-pul13A和pUC57-scFv分別用EcoI和XhoI酶切，連接轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，構(gòu)建BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-scFv。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件并添加0.03%SDS進行發(fā)酵培養(yǎng)，收集細胞各組分蛋白進行酶活測定，SDS-PAGE或Western Blot。

1.2.9 乙酰膽堿酯酶酶活測定

本實驗采用的是微量羥氨比色法 ，其原理是在AChE的催化作用下，吲哚乙酸酯水解生成吲哚酚和乙酸，吲哚酚與空氣中存在的氧氣作用，生成靚藍色物質(zhì)，其最大吸收波長λmax=605 nm，摩爾吸光系數(shù)ε=1600 L·mol-1·cm-1。

1.2.10 Western Blot

將SDS-PAGE蛋白膠浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中，只切取有樣品的部分，電轉(zhuǎn)儀進行轉(zhuǎn)膜。待轉(zhuǎn)膜結(jié)束，取出PVDF膜，封閉液室溫封閉1～3 h，輕輕倒出封閉液，PBST洗滌3次后，加入二抗，室溫2 h，PBST洗滌3次。吸取等量的A液和B液于PVDF上顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-pul13A的構(gòu)建

本實驗室前期的研究結(jié)果表明，BL21(DE3)-pET-22b(+)-pul13A和BL21(DE3)-pET-28a(+)-pul13A均能有效表達普魯蘭酶，區(qū)別在于pET-22b(+)載體上有pelB信號肽，在周質(zhì)空間甚至上清可以檢測到普魯蘭酶活性。然而，用-80℃保存的BL21(DE3)-pET-22b(+)-pul13A菌種進行誘導表達時，雖然SDS-PAGE結(jié)果顯示目的蛋白已經(jīng)被誘導表達，但是經(jīng)常出現(xiàn)檢測不到酶活的現(xiàn)象。此種情況下需要提取質(zhì)粒重新進行轉(zhuǎn)化，徒增工作量。而BL21(DE3)-pET-28a(+)-pul13A表達酶活穩(wěn)定，不受保存條件等因素影響。為了構(gòu)建穩(wěn)定的可分泌型表達質(zhì)粒，實驗設計將pET-22b(+)-pul13A上BglII-XhoI之間的序列剪切插入到pET-28a(+)上，構(gòu)建BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-pul13A。經(jīng)酶切驗證，測序正確后用于重組蛋白分泌表達。

2.2 重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化

誘導溫度，誘導時機是發(fā)酵條件優(yōu)化所必須考慮的重要因素。合適的發(fā)酵條件(溫度、IPTG濃度、誘導時機)有利于酶活的提高。溫度過高，容易形成包涵體，溫度過低會導致菌體濃度過低；IPTG濃度過高過低都不利于重組蛋白的表達[22]。

初始發(fā)酵條件是溫度20℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導時D600 nm=0.05，在LB培養(yǎng)基中誘導表達，周質(zhì)空間和上清都沒有檢測到酶活。查閱文獻確定單因子濃度范圍，分別對培養(yǎng)基(LB，自誘導培養(yǎng)基，TB/SB)，誘導物IPTG濃度(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L)，誘導溫度(16、20、24、30和37℃)，誘導時機(0、3、5、8、10和12 h)4個因素進行單因素優(yōu)化。結(jié)果表明，選取TB/SB培養(yǎng)基，IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導溫度為20℃，誘導時機是接種后5 h，上清和周質(zhì)空間酶活最高，分別是6.5 U/mL和3.25 U/mL(圖1)。

圖1 不同誘導溫度，IPTG濃度，誘導時機下上清(▲)和 周質(zhì)空間(■)普魯蘭酶活Fig 1 Pullulanase activity under different induction temperature, IPTG concenration and induced time

3種培養(yǎng)基，只有TB/SB培養(yǎng)基中，才能在周質(zhì)空間組分檢測到普魯蘭酶活，可能是因為TB/SB培養(yǎng)基營養(yǎng)最豐富，菌體量積累多，蛋白表達量提高，一些帶信號肽的目的蛋白未折疊之前就會被轉(zhuǎn)移到周質(zhì)空間。也可能是因為蛋白量過多“滲漏”到周質(zhì)空間甚至上清中。圖1表明，不同IPTG濃度、溫度、誘導時機對胞外酶活影響很大，低溫、低誘導物濃度會增加胞外酶活，過低會導致酶量合成過少，過高酶合成過量一方面會形成包涵體另一方面可能會導致分泌系統(tǒng)飽和。值得注意的是，誘導時機在接種后5 h為最佳，此時D600 nm約為5.0～6.0，表明由于IPTG及外源蛋白對大腸桿菌的抑制作用，誘導最好選在菌體量有一定積累的對數(shù)期中期。

2.3 重組菌培養(yǎng)基添加物優(yōu)化

培養(yǎng)基添加物由于簡便高效而廣泛應用于改變細胞膜通透性上[12,23]。已報道使用的培養(yǎng)基添加物包括：甘氨酸、Ca2+、有機溶劑(正戊醇，環(huán)己烷)、Tween-80、Tween-20、Triton X-100、SDS、Na+、Mg2+、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、脯氨酸、甜菜堿、K-谷氨酸、蔗糖、山梨醇[21-26]等。查閱文獻和相關實驗后，確定TB/SB培養(yǎng)基中分別添加250 mmol/L NaCl、80 mmol/L甜菜堿、150 mmol/L甘氨酸+20 mmol/L CaCl2、15%蔗糖、10%山梨醇、20 mmol/L MgCl2、20 mmol/L CaCl2、150 mmol/L甘氨酸、0.05%Triton X-100、0.1%Tween-80、0.03%SDS，以選擇最佳添加物使得胞內(nèi)普魯蘭酶盡可能多地分泌到周質(zhì)空間甚至胞外，其中150 mmol/L甘氨酸于誘導后16 h添加，0.05%Triton X-100、0.1%Tween-80、0.03%SDS于誘導后20 h 添加，其余均在誘導時添加。

由圖2可知，山梨醇、Triton X-100和SDS對分泌表達具有明顯促進作用，而Tween-80和CaCl2不利于分泌表達,其他物質(zhì)有促進有抑制，但作用不明顯。在所有添加物中，加入10%山梨醇，上清酶活為4.48 U/mL，提高了約3.78倍，酶活達到最高。0.03%SDS雖對菌體生長有一定的抑制作用，但上清酶活提高了2.3倍，周質(zhì)空間酶活提高了10.97倍，為102.5 U/mL。

Na+是一種滲透壓添加劑，能夠有效地預防細胞脫水，增強培養(yǎng)基離子強度并改變滲透壓，在細胞內(nèi)外滲透壓差作用下，細胞通透性改變，從而促進胞內(nèi)物質(zhì)的分泌。由圖2可知，250 mmol/L NaCl對于普魯蘭酶的分泌略起作用，并不明顯，但是會抑制細胞生長。甜菜堿是一種滲透劑，又稱化學伴侶，在體內(nèi)能顯著性增強熱不穩(wěn)定性蛋白在熱擊條件下的穩(wěn)定性，在體外可以幫助變性蛋白重新折疊，提高活性蛋白的產(chǎn)量[14-15]。80 mmol/L甜菜堿對上清酶活提高有影響，大約提高了1.5倍，周質(zhì)空間酶活無明顯提高。15%蔗糖對上清酶活基本無影響，周質(zhì)空間的酶活還有所降低。這3種物質(zhì)的添加在一定程度上均會抑制菌體生長，其中蔗糖在所有的添加物中抑制作用最顯著。

甘氨酸能夠增加細胞膜的通透性，潛在的機制是甘氨酸誘導的細胞壁上的肽聚糖結(jié)構(gòu)的修飾，導致細胞膜通透性明顯增加，但甘氨酸過多會導致菌體無法生長，長時間甚至會導致菌體自溶，所以甘氨酸一般建議在生長期后期添加[10,19,23]。150 mmol/L甘氨酸對菌體生長的抑制作用不明顯，上清酶活約提高0.5倍，對周質(zhì)空間酶活無正作用。20 mmol/L CaCl2對上清和周質(zhì)空間酶活都無提高作用。甘氨酸和金屬離子的搭配對酶活的提高比單獨使用更明顯。甘氨酸和Na+同時作用酶活是不加添加劑的10.3倍。甘氨酸和Ca+同時作用酶活提高了1.5倍。150 mmol/L甘氨酸和20 mmo/L CaCl2共同作用，菌體生長無明顯抑制，周質(zhì)空間酶活基本無增加，但上清酶活提高了約3.07倍，為3.01 U/mL。20 mmol/L MgCl2的加入使上清酶活略有提高，周質(zhì)空間酶活沒有提高。

表面活性劑包含TritonX-100、Tween-80、SDS，能夠作用于細胞膜，提高膜的透過性。由于對菌體生長會有抑制作用，所以一般選擇在誘導20 h時添加。0.05%Triton X-100的添加使上清酶活提高了2.6倍，周質(zhì)空間酶活提高了2.1倍為21.05 U/mL, 較另外兩種表面活性劑，對菌體生長基本無抑制。0.1%Tween-80無論對菌體濃度，上清酶活，還是周質(zhì)空間酶活都是負作用。SDS是一種陰離子表面活性劑，能夠抑制脂肪酸的生物合成，導致細胞膜磷脂雙分子層的不正確合成，進而增強細胞膜的透過性[24]。由圖3可知，SDS使得普魯蘭酶極大地釋放到周質(zhì)空間，胞外酶活提高了10.97倍，為102.5 U/mL。

起滲透作用的蔗糖、山梨醇和甜菜堿，均會抑制菌體生長，且在所有添加物中抑制作用最明顯。不同表面活性劑對菌體生長作用不同或抑制或促進。Tween-80對該蛋白的分泌有負作用，Triton X-100對內(nèi)外膜強度不同作用，Triton X-100較SDS對外膜的作用強，SDS較Triton X-100對內(nèi)膜的作用強，可能是由于內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)的差異性和不同表面活性劑的偏好性所致。不同金屬離子對菌體生長均有一定的抑制作用，已知Ca2+一方面能穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，一方面能通過改變滲透壓，改變膜通透性，由于后者作用強于前者，故也會表現(xiàn)出抑制菌體生長的現(xiàn)象。從對內(nèi)外膜的影響可以看出，Ca2+對內(nèi)外膜有穩(wěn)定作用，Mg2+對內(nèi)膜作用強于外膜，Na+對內(nèi)外膜均有作用，但不大。甘氨酸與金屬離子共用對內(nèi)外膜作用和重組蛋白的分泌，優(yōu)于各自單獨使用。

綜合考量上清酶活，周質(zhì)酶活及總酶活，確定最佳添加物為SDS。在前述優(yōu)化條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加SDS，至發(fā)酵終點時上清中的酶活達到2.02 U/mL，是對照的2.3倍；周質(zhì)空間酶活102.5 U/mL，是對照的10.97倍，見圖2。酶活結(jié)果及SDS-PAGE結(jié)果表明“滲漏”到上清中的酶活有限，大部分蛋白滯留在周質(zhì)空間。

圖 2 不同培養(yǎng)基添加物對周質(zhì)空間和上清普魯蘭酶活的影響Fig 2 Effects of different additives on periplasmic and supernatant pullulanase activity

Control:TB/SB; A: TB/SB +250 mmol/L NaCl; B: TB/SB +80 mmol/L Betaine; C: TB/SB +150 mmol/L Glycine+20 mmol/L CaCl2; D: TB/SB +15%Sucrose ; E: TB/SB +10%Sorbitol; F: TB/SB +20 mmol/L MgCl2; G: TB/SB +20 mmol/L CaCl2; H: TB/SB +150 mmol/L Glycine; I: TB/SB +0.05%Triton X-100; J: TB/SB +0.1%Tween-80; K: TB/SB +0.03%SDS

圖 3 上清、周質(zhì)和胞內(nèi)普魯蘭酶SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE of supernatant, periplasmic and intracellular pullulanase

1～3: Supernatant pullulanase; 1: TB/SB， 2: TB/SB+10%Sorbitol， 3: TB/SB +0.03%SDS。 4～6: Periplasmic pullulanase; 4: TB/SB， 5: TB/SB+10%Sorbitol， 6: TB/SB +0.03%SDS。 7～9: Intracellular pullulanase; 7: TB/SB， 8: TB/SB+10%Sorbitol， 9: TB/SB +0.03%SDS。 M： Protein Marker

2.4 0.03% SDS對重組菌細胞形態(tài)的影響

我們用掃描電子顯微鏡(SEM)來研究SDS對大腸桿菌細胞形態(tài)的影響。圖4-a大腸桿菌在沒有添加SDS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞形態(tài)呈桿狀，表面光滑。圖4-b大腸桿菌在添加SDS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞形態(tài)發(fā)生變化，表面凹陷或坍塌。說明，0.03%SDS能夠通過與細胞膜的相互作用改變細胞形態(tài)和膜的通透性，進而促進蛋白由胞內(nèi)向周質(zhì)空間及胞外的轉(zhuǎn)運。

2.5 不同添加劑對重組菌細胞內(nèi)外膜通透性的影響

大腸桿菌細胞內(nèi)膜的通透性可以用β-半乳糖苷酶的底物ONPG作為探針來測定。當ONPG透過內(nèi)膜，可以被定位在胞漿的β-半乳糖苷酶剪切，出現(xiàn)黃色。因此420 nm的吸光度及其增長速率可以用來指示內(nèi)膜通透性。同樣地，外膜通透性可以用β-內(nèi)酰胺酶的底物nitrocefin作為探針來測定，當nitrocefin被定位在周質(zhì)空間的β-內(nèi)酰胺酶消化后，出現(xiàn)紅色。因此500 nm的吸光度及其增長速率可以用來指示外膜通透性。如圖5所示，在沒有添加劑的培養(yǎng)基中，大腸桿菌細胞內(nèi)外膜通透性處于較低水平，在添加了不同添加劑后，內(nèi)外膜通透性均有所提高。其中，0.03%SDS明顯提高了內(nèi)膜通透性，較對照甚至其他添加劑都高很多，這可能是在添加了0.03%SDS后引起周質(zhì)空間酶活明顯增加的重要原因，其他添加劑對內(nèi)膜通透性并沒有明顯影響。在這11組不同組合的添加劑中，10%山梨醇對外膜通透性提高最顯著，這可能是在添加了10%山梨醇后引起胞外酶活提高的原因之一，其他添加劑都會或多或少的增加了外膜的通透性。但是內(nèi)外膜通透性的改變與發(fā)酵結(jié)果并非完全一致，這可能是內(nèi)外膜共同作用或者還有其他的影響因素所致。

圖4 SDS對大腸桿菌細胞形態(tài)的影響Fig 4 Effects of SDS on cell morphology

a: cell harvest at 36 h without addition of 0.03%SDS after 20 h; b: cell harvest at 36 h without addition of 0.03%SDS after 20 h

圖5 不同添加劑對大腸桿菌細胞內(nèi)外膜通透性的影響Fig 5 Effects of different additives on the permeabilities of inner(a) and outer(b) membranes

Control: TB/SB; A: TB/SB +250 mmol/L NaCl; B: TB/SB +80 mmol/L Betaine; C: TB/SB +150 mmol/L Glycine+20 mmol/L CaCl2; D: TB/SB +15%Sucrose; E: TB/SB +10%Sorbitol; F: TB/SB +20 mmol/L MgCl2; G: TB/SB +20 mmol/L CaCl2; H: TB/SB +150 mmol/L Glycine; I: TB/SB +0.05%Triton X-100; J: TB/SB +0.1%Tween-80; K: TB/SB +0.03%SDS

2.6 采用優(yōu)化后的體系來提高乙酰膽堿酯酶(aChE)和單域抗體(scFv)的分泌表達

應用優(yōu)化后的培養(yǎng)基、載體、發(fā)酵條件和培養(yǎng)基添加物(0.03%SDS)，是否能實現(xiàn)其他不分泌蛋白在大腸桿菌中的分泌表達是本課題研究意義所在。另外，本實驗室所用乙酰膽堿酯酶和單域抗體均遇到無法分泌至胞外的問題。所以，我們通過分子克隆手段構(gòu)建了重組菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-aChE和BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-scFv，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵20 h時添加0.03% SDS。未誘導的乙酰膽堿酯酶重組菌上清、OS1和OS2酶活分別為0.4 U、0.06 U和0.23 U，說明重組菌存在本底表達。IPTG誘導后的重組菌上清、OS1和OS2酶活分別為1.14 U、0.06 U和0.19 U。若在發(fā)酵20 h添加0.03% SDS，上清、OS1和OS2酶活分別為0.98 U、1.8U和0.45U，較未誘導重組菌而言，周質(zhì)空間酶活提高7.76倍(圖6)。如圖7，在3號條帶(周質(zhì)空間)檢測到了特異性單域抗體，從而初步實現(xiàn)了單域抗體在大腸桿菌中的分泌表達。

圖 6 總蛋白和周質(zhì)空間乙酰膽堿酯酶SDS-PAGEFig 6 SDS-PAGE of total protein and periplasmic aChE

1～3: Supernatant aChE; 1: TB/SB, 2: TB/SB+IPTG, 3: TB/SB +IPTG+0.03%SDS。 4～6: OS1 aChE; 4: TB/SB, 5: TB/SB+IPTG, 6: TB/SB +IPTG+0.03%SDS。 7～9: OS2 aChE; 7: TB/SB, 8: TB/SB+IPTG, 9: TB/SB +IPTG+0.03%SDS。 M: Protein marker

圖 7 周質(zhì)空間單域抗體Western BlotFig 7 Western Blot of periplasmic scFv

1: TB/SB; 2: TB/SB+IPTG; 3: TB/SB +IPTG+0.03%SDS

3 結(jié)論

采用重組大腸桿菌表達外源蛋白，可在胞內(nèi)積累大量的目的產(chǎn)物，但分泌情況卻不盡理想。特別是對于大分子蛋白，在大腸桿菌中實現(xiàn)分泌表達，已成為制約工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸[6,25]。周質(zhì)空間有利于外源蛋白正確折疊，實現(xiàn)周質(zhì)空間的分泌表達尤為重要[26-28]。本文從信號肽，發(fā)酵條件優(yōu)化和培養(yǎng)基添加物3個方面優(yōu)化重組大腸桿菌分泌表達普魯蘭酶。實驗結(jié)果表明，Bacillusacidopullulyticus普魯蘭酶在PelB信號肽的引導下，通過大腸桿菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)進入周質(zhì)空間。值得注意的是，只有抗生素抗性不同的pET-22b(+)-pul13A和pET-28a(+)-pelB-pul13A，前者總是出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象，而后者卻能穩(wěn)定地進行傳代和發(fā)酵。另外大腸桿菌發(fā)酵誘導時機一般建議是D600 nm=1.0左右，也就是對數(shù)期初期，而我們發(fā)現(xiàn)在D600 nm=5.0～6.0誘導能獲得更高的產(chǎn)量。

由于大腸桿菌外膜的阻攔或外膜轉(zhuǎn)運通道的飽和，大量的普魯蘭酶滯留于周質(zhì)空間，真正分泌至胞外的蛋白相對較少。培養(yǎng)基添加物會破壞內(nèi)外膜原有的致密結(jié)構(gòu)，增加細胞膜通透性，導致蛋白“滲漏”到培養(yǎng)基內(nèi)[12,19]。本文實驗結(jié)果表明SDS對內(nèi)膜作用最明顯，山梨醇對外膜作用最明顯。通過培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基添加物的優(yōu)化，普魯蘭酶在周質(zhì)空間的酶活達到102.5 U/mL。在實現(xiàn)乙酰膽堿酯酶和單域抗體的分泌上，進一步驗證了該優(yōu)化體系的實用性。培養(yǎng)基添加物的研究及其作用機理的推測，對其他大分子外源蛋白在大腸桿菌或其他革蘭氏陰性菌中的分泌表達具有參考意義。

[1]CHEN W B, NIE Y, XU Y. Signal peptide-independent secretory expression and characterization of pullulanase from a newly isolatedKlebsiellavariicolaSHN-1 inEscherichiacoli[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(1): 41-54.

[2]ROY I, GUPTA M N. Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads [J]. Enzyme Microb Technol, 2004, 34(1): 26-32.

[3]RIESENBERG D. High cell density cultivation ofEscherichiacoli[J]. Current Opinion in Biotechnol, 1991, 2(3): 380-384.

[4]嚴 偉, 聶 堯, 徐 巖. 長野芽孢桿菌(Bacillusnaganoensis)普魯蘭酶在大腸桿菌中的活性表達與分泌調(diào)控 [J]. 微生物學報, 2013, 53(2): 145-153.

[6]ZOUARI AYADI D, BEN ALI M, JEMLI S, et al. Heterologous expression, secretion and characterization of theGeobacillusthermoleovoransUS105 type Ⅰ pullulanase [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(3): 473-481.

[7]PARK S Y, PARK S H, CHOI S K. Active inclusion body formation usingPaenibacilluspolymyxaPoxBas a fusion partner inEscherichiacoli[J]. Anal Biochem, 2012, 426(1): 63-65.

[8]DUAN X, CHEN J, WU J. Optimization of pulluanase production inEscherichiacoliby regulation of process conditions and supplement with natural osmolytes [J]. Bioresource Technol, 2013, 146: 379-385.

[9]LI Y, CHEN C X, VON SPECHT B U, et al. Cloning and hemolysin-mediated secretory expression of a codon-optimized synthetic human interleukin-6 gene inEscherichiacoli[J]. Protein Expr Purif, 2002, 25(3): 437-447.

[10]KADERBHAI N, KARIM A, HANKEY W, et al. Glycine-induced extracellular secretion of a recombinant cytochrome expressed inEscherichiacoli[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1997, 25(Pt1): 53-61.

[11]TESFAI B T, WU D, CHEN S, et al. Effect of organic solvents on the yield and specificity of cyclodextrins by recombinant cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)fromAnaerobrancagottschalkii[J]. Incl Phenom Macrocycl Chem, 2013, 77(1): 147-153.

[12]DING R R, LI Z F, CHEN S, et al. Enhanced secretion of recombinant a-cyclodextrin glucosyltransferase fromE.coliby medium additives [J]. Process Biochemistry, 2010, 45(6): 880-886.

[13]王瑞剛, 張艷春, 張子義, 等. 三種滲透劑對轉(zhuǎn)基因煙草根系枯草芽孢桿菌纖溶酶(BSFE)分泌的調(diào)節(jié) [J]. 植物資源與環(huán)境學報, 2005, 14(2): 1-5.

[14]DIAMANT S, ELIAHU N, ROSENTHAL D, et al. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses [J]. J Biol Chem, 2001, 276(43): 39586-39591.

[15]DIAMANT S, ROSENTHAL D, AZEM A, et al. Dicarboxylic amino acids and glycine-betaine regulate chaperone mediated protein disaggregation under stress [J]. Mol Microbio, 2003, 49(2): 401 410.

[16]DE MARCO A, VIGH L, DIAMANT S, et al. Native folding of aggregation-prone recombinant proteins inEscherichiacoliby osmolytes, plasmid-or benzyl alcohol-overexpressed molecular chaperones [J]. Cell Stress Chaperones, 2005, 10(4): 329-339.

[17]CHEN A, LI Y, LIU X, et al. Soluble expression of pullulanase fromBacillusacidopullulyticusinEscherichiacoliby tightly controlling basal expression [J]. J Ind Microbiol Biotechnol [J]. 2014, 41(12):1803-1810.

[18]KANG J, PARK K M, CHOI K H, et al. Molecular cloning and biochemical characterization of a heat-stable type Ⅰ pullulanase fromThermotoganeapolitana[J]. Enzyme Microb Technol, 2010, 48(3): 260-266.

[19]LI Z F, LI B, LIU Z G, et al. Calcium leads to further increase in glycine-enhanced extracellular secretion of recombinant a cyclodextrin glycosyltransferase inEscherichiacoli[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57(14): 6231-6237.

[20]ERIKSSON M, NIELSEN P E, GOOD L. Cell permeability and uptake of antisense peptide-peptide nucleic acid(PNA)intoEscherichiacoli[J]. J Biol Chem, 2002, 277(9): 7144-7147.

[21]VILLATTE F, BACHMAN T T, HUSSEIN A S, et al. Acetylcholinesterase assay for rapid expression screening in liquid and solid media [J]. Biotechniques, 2001, 30(1): 81-84, 86.

[22]CHEN W B, NIE Y, XU Y, et al. Enhancement of extracellular pullulanase production from recombinantEscherichiacoliby combined strategy involving auto-induction and temperature control [J]. Bioprocess Biosyst Eng, 2014, 37(4): 601-608.

[23]LI Z, GU Z, WANG M, et al. Delayed supplementation of glycine enhances extracellular secretion of the recombinant α -cyclodextrin glycosyltransferase inEscherichiacoli[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(3): 553-561.

[24]張 蓓. 代謝工程[M]. 天津： 天津大學出版社, 2003: 4.

[25]姚永鵬, 王為善, 楊克遷. 鏈霉菌中高效生產(chǎn)聚酮化合物的研究方法及進展[J]. 微生物學報, 2016, 56(3): 418-428.

[26]沙 沖. 華根霉 (Rhizopuschinensis) 脂肪酶在異源宿主中的高效分泌表達[D]. 無錫：江南大學, 2015.

[27]王 嵐, 劉 新, 張 帆, 等. 重組人銅鋅超氧化物歧化酶在大腸桿菌中的表達研究[J]. 沈陽醫(yī)學院學報, 2015, 17(2): 70-73.

[28]賈曉歌, 鄧子新, 劉天罡. 無細胞蛋白表達體系研究進展及在生物制藥領域中的應用[J]. 微生物學報, 2016, 56(3): 530-542.

Study on secretory expression of recombination pullulanase fromBacillusacidopullulyticusinEscherichiacoli

LI Ya-mei1,2,3, CHEN A-na1,2,3, YANG Yan-kun1,2,3, BAI Zhong-hu1,2,3

(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology; 2. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; 3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnogy, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The pullulanase ofBacillusacidopullulyticushas low secretory expression level as a macromolecule. For pullulanase secretory in recombinationEscherichiacoliBL21(DE3), BL21(DE3)-pET-28a(+)-pelB-pul13Awith PelB signal peptide was constructed, then fermentation optimization and medium additives were employed for better secretory. Through the construction of recombinant strain BL21(DE3) with pelB, pullulanase was secreted at a low level. By fermentation optimization including medium , induced temperature , the concentration of IPTG, induced time and medium additives, the extracellular pullulanase activity was markedly increased. pullulanase was secreted into periplasmic space. Under the condition of 0.1 mmol/L IPTG, 20℃ induced afterD600 nmwas about 5.0-6.0, the periplasmic pullulanase activity reached to 102.5 U/mL with addition of 0.03%SDS after induction for 20 h.

pullulanase; secretory expression; signal peptide; fermentation optimization; medium additives; SDS

2016-03-24；

2016-04-27

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2015AA020802)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(No.JUSRP51401A);國家自然科學基金項目(No.31570034)

栗亞美，碩士，主要從事發(fā)酵工程研究，E-mail:1198066405@qq.com

白仲虎，教授，主要從事發(fā)酵工程領域科研工作，E-mail:baizhonghu@jiangnan.edu.cn

Q786；TQ925

A

2095-1736(2017)01-0023-07

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.023