安展飛, 栗亞美, 楊艷坤, 白仲虎

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室, 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 無錫 214122)

過表達(dá)人工設(shè)計的sRNA(anti-micA)提高大腸桿菌存活力和普魯蘭酶產(chǎn)量

安展飛1,2, 栗亞美1,2, 楊艷坤1,2, 白仲虎1,2

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室, 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 無錫 214122)

大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的過程中會受到各種外源和內(nèi)源的脅迫并且形成了多種感受和響應(yīng)特定刺激的脅迫信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。細(xì)菌脅迫應(yīng)激時，許多小的非編碼RNA(small non-coding RNA, sRNA)參與mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，改變其翻譯效率和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。通過過表達(dá)人工設(shè)計的micA反義sRNA anti-micA(bprO和omU)阻斷micA對ompA的沉默，進(jìn)而阻斷sigma E介導(dǎo)的細(xì)胞自溶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，提高大腸桿菌存活力和表達(dá)普魯蘭酶能力，并初步討論了影響人工設(shè)計反式編碼sRNA功能的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，在bprO和omU過表達(dá)菌株中，菌落形成單位分別提高了0.5和1個數(shù)量級，ompAmRNA相對水平分別提高了7.2和6.9倍，OmpA蛋白含量均顯著提高，普魯蘭酶產(chǎn)量分別提高了1.4和1.8倍，并且omU的過表達(dá)比bprO的過表達(dá)對菌體特性的影響更大。為菌種改良提供了一種新的方法，并為反式編碼sRNA的設(shè)計提供參考性指導(dǎo)。

脅迫應(yīng)激；人工設(shè)計sRNA；存活力；細(xì)胞自溶；普魯蘭酶

從20世紀(jì)70年代現(xiàn)代生物技術(shù)起步以來，以大腸桿菌(Escherichiacoli)為代表的細(xì)菌細(xì)胞作為重組蛋白質(zhì)外源表達(dá)的原核宿主細(xì)胞，得到了極為廣泛的使用[1]。但在表達(dá)外源蛋白的過程中由于宿主細(xì)胞受到各種各樣的環(huán)境脅迫及表達(dá)外源蛋白對宿主自身造成的代謝負(fù)擔(dān)等原因，造成宿主細(xì)胞存在普遍的自溶現(xiàn)象[2]，細(xì)菌細(xì)胞的過早自溶會縮短穩(wěn)定生產(chǎn)期的長度，顯著影響重組蛋白的表達(dá)質(zhì)量和水平。因此在發(fā)酵工程中維持宿主細(xì)胞穩(wěn)健的生理特性和生產(chǎn)效率對異源蛋白的表達(dá)非常重要。目前在已發(fā)現(xiàn)的5個感受和應(yīng)對E.coli細(xì)胞脅迫(Stress)的信號傳導(dǎo)途徑Bae、Cpx、Psp、Rcs和 sigma E中[3]，已明確地導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞自溶的信號傳導(dǎo)途徑和發(fā)生過程主要集中在Sigma E途徑[4]。在sigma E介導(dǎo)自溶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵步驟是：非編碼小RNAmicA在Hfq蛋白的協(xié)助作用下，與ompAmRNA 5′端非翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)堿基互補配對，然后三者形成的復(fù)合物被RNase E識別，導(dǎo)致ompA、micA被降解，造成OmpA表達(dá)量降低，細(xì)胞膜缺陷破裂降解[5-9]。因此我們試圖通過阻斷sigma E介導(dǎo)的細(xì)胞自溶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以提高大腸桿菌的存活力。但最近研究發(fā)現(xiàn)：1)sigma E參與大腸桿菌周知空間和外膜組分的形成及與其相關(guān)的重要生理生化反應(yīng)，是大腸桿菌存活的必須蛋白[10]；2)過表達(dá)外膜蛋白A(OmpA)同樣引起細(xì)胞自溶[11]；3)micA位于基因gshA和luxS的基因間隔區(qū)，與luxS5′端非編碼區(qū)和gshA3′終止子區(qū)部分重疊[12]，敲除micA會同時破壞gshA和luxS的完整性，對大腸桿菌產(chǎn)生二次影響。從而用傳統(tǒng)的基因敲除、過表達(dá)目的基因的方法改造sigma E介導(dǎo)的細(xì)胞自溶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在很大困難。而且，這些方法在實際應(yīng)用中存在操作復(fù)雜、費時、費力等問題，已不能滿足本研究對菌種改造需求。

近年來，人們逐漸發(fā)覺到在原核生物中sRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的方式參與許多重要的細(xì)胞生命過程[13]。sRNA具有高效的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用，不會對宿主細(xì)胞造成代謝負(fù)擔(dān)及伴隨基因敲除產(chǎn)生的二次效應(yīng)等優(yōu)點，這些特點使細(xì)胞能夠利用這些小分子對環(huán)境信號和脅迫做出快速的響應(yīng)，因此，大量能沉默或促進(jìn)特定基因mRNA翻譯的天然和人工設(shè)計sRNAs 被廣泛應(yīng)用于原核生物菌種改造和基因功能性研究[14]。Gaida 等[15]同時過表達(dá)sRNA(DsrA、ArcZ、RprA)顯著地提高了大腸桿菌在對數(shù)期對酸的耐受和抗氧化脅迫能力。Man等[16]通過分析大腸桿菌中自身固有sRNA的共同結(jié)構(gòu)特征，開發(fā)了一套能沉默革蘭氏陰性菌中特定基因的人工設(shè)計反式作用小RNA的設(shè)計原理。合成的sRNA有效地抑制了大腸桿菌中外源增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和內(nèi)源uidA的表達(dá)。但應(yīng)用人工設(shè)計sRNA/microRNA的反式作用sRNA競爭性結(jié)合sRNA，阻斷sRNA對靶基因的沉默效果的研究尚少。

本研究通過運用人工設(shè)計micA的反式作用sRNA(anti-micA)，bprO和omU阻斷micA對ompA的沉默，從而阻斷sigma E 介導(dǎo)的細(xì)胞自溶途徑,實現(xiàn)了細(xì)胞存活力以及普魯蘭酶產(chǎn)量的提高，并初步討論了影響人工設(shè)計sRNA反義sRNA(anti-RNA)干擾效率的影響因素，為anti-RNA的合理設(shè)計提供可參考的意見，為進(jìn)一步研究RNA功能提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α 和BL21(DE3)分別作為質(zhì)粒的克隆宿主和表達(dá)宿主，均為本實驗室保藏。表達(dá)載體pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB和pET28(a)-pelB-pul均為本實驗室保存。本研究中使用的所有質(zhì)粒和菌株如表1所示。

表1 研究使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑和儀器

胰蛋白胨和酵母粉均購自安琪酵母股份有限公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，限制性內(nèi)切酶NcoI、NheI、SmaI、AflIII均購自NEB公司；T4 DNA連接酶，rTaqDNA聚合酶，總RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR ExTaqTMII定量試劑盒均購自TaKaRLa 公司；實驗所用引物，PCR產(chǎn)物純化及質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素(Amp)均購于上海生工生物工程股份有限公司。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白及SDS-PAGE凝膠配置試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。熒光定量PCR儀為美國伯樂Bio-RADiCycler CFX96TM，微量紫外分光光度計為美國Quawell Q5000，常規(guī)分光光度計為美國MAPADA UV-1800，臺式離心機(jī)為美國Thermo Scientific FRESCOL-7。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，瓊脂粉 15，pH 7.0。

1.2 方法

然而挑戰(zhàn)同時存在，這一年Wine-Searcher經(jīng)歷了變革：網(wǎng)站創(chuàng)始人馬丁·布朗（Martin Brown）不再參與公司運營。“我們擁有不少優(yōu)秀的員工，經(jīng)歷了這件事情后，還要確保大家能像往常一樣高標(biāo)準(zhǔn)地工作，對我而言是很大挑戰(zhàn)?！盌avid說道?，F(xiàn)在，他們也在期盼著新的團(tuán)隊可以對網(wǎng)站進(jìn)行一系列的完善與推進(jìn)。

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

sRNAmicA及人工設(shè)計的sRNA，bprO和omU放置于T7啟動子下游轉(zhuǎn)錄起始位點和T7終止子之間形成各自完整的轉(zhuǎn)錄單元，并在每個轉(zhuǎn)錄單元上游和下游分別加NheI和AflIII酶切位點，sRNA完整轉(zhuǎn)錄單元的基因合成由北京金維智有限公司完成，將合成的基因分別插入質(zhì)粒pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB的NheI和AflIII酶切位點之間獲得pUC18-micA、pUC18-bprO和pUC18-omU質(zhì)粒。用NcoI 和AflIII限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB，膠回收試劑盒回收載體目的條帶，純化后的產(chǎn)物后加入T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性并測序正確的轉(zhuǎn)化子，即獲得 pUC18載體。

用上游引物pul-F：5′-TCCCCCGGGCGATCCCGCGAAATTAATACG-3′(加下劃線序列為SmaI酶切位點)，下游引物pul-R：5′-CTAGCTAGCGGAGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC-3′(加下劃線序列為NheI酶切位點)，以質(zhì)粒pET-28(a)-pul為模板擴(kuò)增pul完整的轉(zhuǎn)錄單元片段，獲得的PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pUC18、pUC18-bprO和pUC18-omU分別用酶SmaI、NheI限制性內(nèi)切酶酶切，回收PCR產(chǎn)物與載體的目的條帶，純化后的PCR產(chǎn)物分別與純化后的載體pUC18、pUC18-bprO和pUC18-omU產(chǎn)物按比例混合后加入T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別挑選陽性并測序正確的轉(zhuǎn)化子，即得表達(dá)載體pUC18-pul，pUC18-bprO-pul和pUC18-omU-pul。質(zhì)粒構(gòu)建流程圖見圖1。

1.2.2 培養(yǎng)條件

將保藏于-80 ℃的1 mL攜帶不同質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)甘油菌株分別接種到25 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，230 r/min條件下預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)中后期(D600 nm約為3)，取250 μL預(yù)培養(yǎng)種子液在分別接種至裝有25 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基錐形瓶中培養(yǎng)至對數(shù)初期(D600 nm在0.3～0.5之間)，加入終濃度為100 μmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)sRNA及外源蛋白表達(dá)，并把添加誘導(dǎo)劑時刻的培養(yǎng)時間記為0 h。分別在發(fā)酵培養(yǎng)的0 h、6 h、12 h、24 h和36 h時間點取適量發(fā)酵液用于測量光密度值(D600 nm)和平板涂布計數(shù)(CFU)，12 h樣品同時測量micA、ompA基因相對表達(dá)量，外膜蛋白(OmpA)表達(dá)量和普魯蘭酶(Pullulanase)酶活。本研究中發(fā)酵培養(yǎng)的條件與種子培養(yǎng)條件一致，所有的培養(yǎng)均需要添加氨芐青霉素(Amp)至終濃度60 μg/mL(使用0.22 μm醋酸纖維過濾膜過濾除菌)。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig 1 The construction of plasmids

1.2.3 檢測光密度值(D600 nm)和菌落形成單位(CFU)

用LB液體培養(yǎng)基稀釋發(fā)酵液樣品至適當(dāng)OD值，并作為測量光密度值的空白校準(zhǔn)液，用紫外分光光度計測量稀釋后發(fā)酵液D600 nm檢測菌體生物量；使用0.01 mol/L PBS(pH 7.4) 以10倍倍比梯度稀釋發(fā)酵液，選取合適稀釋倍數(shù)稀釋液100 μL涂布于LB瓊脂糖平板，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，統(tǒng)計活菌數(shù)并計算菌落形成單位(CFU)。

1.2.4 總RNA提取和實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測基因表達(dá)水平

取適量體積發(fā)酵液(含5×106～107個細(xì)胞)8000 r/min 4℃離心3 min，棄上清；按照TaKaRa RNAiso Plus總RNA提取試劑操作說明書提取E.coli細(xì)胞樣品中總RNA。通過測定D260 nm/D280 nm值和甲醛變性凝膠電泳檢驗總RNA 的質(zhì)量和純度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑 (PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)和(Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR?qRT-PCR)說明書去除基因組DNA后把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，去除基因組DNA反應(yīng)體系及步驟：總RNA 500 ng；5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL；gDNA Eraser 1.0 μL；RNase Free dH2O補足至10 μL，42 ℃反應(yīng)2 min。mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及步驟：去除基因組反應(yīng)液5 μL；PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL；RT Primer Mix 2.0 μL；5×PrimeScript Buffer2(for Real Time)2.0 μL；RNase Free dH2O 1.0 μL補足至10 μL，37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃ 5 s。sRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及步驟：去除基因組反應(yīng)液 3.75 μL；mRQ Enzyme 1.25 μL；mRQ Buffer (2×) 5 μL。使用TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)定量試劑反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix Ex TaqTM II(2×)5 μL；PCR Forward Primer(10 μM)0.3 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.3 μL；cDNA模板1 μL；Sterile ddH2O 3.4 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。根據(jù)2-△△Ct計算方法使用Excel對實時熒光定量PCR實驗結(jié)果進(jìn)行分析，計算基因相對表達(dá)豐度。Quantitative Real-time PCR反應(yīng)用到的引物如表2所示。

表2 實時定量PCR引物Table 2 primers used in quantitative real-time PCR

16S rRNA 為mRNA檢測內(nèi)參基因；5S rRNA 為sRNA檢測內(nèi)參基因

1.2.5 檢測外膜蛋白A(OmpA)表達(dá)水平

發(fā)酵液8000 r/min 4 ℃離心3 min，棄上清，菌體沉淀用等體積0.01 mol/L，PBS(pH 7.4)重懸，使用超聲破碎儀破碎菌體。超聲破碎儀程序：工作2 s，停1 s，工作時間10 min，功率20%。將獲得菌體破碎液8000 r/min 4℃離心5 min，取上清保存在-80 ℃低溫冰箱。按照上海生工改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明書中的方法測定菌體破碎上清液中蛋白的含量。通過15% SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍(lán)(G250)染色檢測外膜蛋白A (OmpA)表達(dá)水平，電泳時每泳道蛋白上樣量為8 μg。

1.2.6 普魯蘭酶酶活測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定普魯蘭酶活性，該法常用于測定還原性糖含量?；驹硎瞧蒸斕m酶將普魯蘭糖水解為還原性糖，DNS與還原性糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物。測定方法：將100 μL粗酶液(菌體破碎液)與200 μL含1%普魯蘭糖的0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液混勻，在60 ℃條件下反應(yīng)10 min，立即加入450 μL 3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)并移至沸水中反應(yīng)10 min，測定在540 nm處光密度值(D540 nm)并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原碳水化合物的毫克數(shù)，其還原力相當(dāng)于產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.2.7 RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用RNA Folding Form(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)在線預(yù)測sRNA(bprO和omU)的二級結(jié)構(gòu)和最小吉布斯自由能。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)sRNAs(micA、bprO和omU)對菌落形成單位和菌體生物量的影響

在大腸桿菌中，OmpA通過與胞壁質(zhì)脂蛋白、肽聚糖相連脂蛋白等外膜組分相互作用維持細(xì)胞外膜完整性，菌體脅迫耐受和存活力[9]。micA對ompAmRNA的翻譯表具有負(fù)的調(diào)控作用并且micA的表達(dá)具有生長期依賴性[17]。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)入穩(wěn)定初期后，micA開始逐漸在細(xì)胞內(nèi)積累，與ompAmRNA 5′端非翻譯區(qū)核糖體結(jié)合位點以非嚴(yán)格堿基配對的方式誘導(dǎo)mRNA的降解，造成細(xì)胞外膜缺陷、菌體裂解[5,18]。在本研究中，我們應(yīng)用一種類似于真核生物RNA干擾的方法沉默micA基因。

因此，我們過表達(dá)人工設(shè)計micA的反義sRNA(anti-micA)阻斷micA介導(dǎo)的OmpA表達(dá)量下調(diào)，來提高菌體存活力和生物量。結(jié)果表明，過表達(dá)bprO與omU菌株D600 nm均高于pUC18菌體，但過表達(dá)micA并沒有降低發(fā)酵液D600 nm，并且pUC18-micA菌株的D600 nm值稍微高于pUC18對照菌株(圖2)，即高水平的micA并沒有引起細(xì)胞自溶，這是一個與目前報道不相符的結(jié)果[18]。但同時我們也發(fā)現(xiàn)在對數(shù)期末和穩(wěn)定期初，過表達(dá)micA顯著降低了菌株菌落形成單位(CFU)，過表達(dá)bprO與omU均提高了菌株菌落形成單位。如圖3所示，與pUC18菌株相比pUC18-micA菌株菌落形成單位降低了約5個數(shù)量級，pUC18-bprO和pUC18-omU菌株的菌落形成單位分別提高了0.5和1個數(shù)量級，在穩(wěn)定期的中后期pUC18-bprO、pUC18-omU和pUC18菌株菌落形成單位均逐漸降至約109，pUC18-micA菌株菌落形成單位逐步增長至107，我們推測可能是由于pUC18-micA菌株中存在突變株生長的原因?qū)е聀UC18-micA菌株活細(xì)胞數(shù)目增長。以上結(jié)果表明：過表達(dá)bprO和omU均能提高菌體的生物量和菌落形成單位(CFU)，過表達(dá)micA能顯著降低菌體生存能力，但不影響菌體的生物量。

圖2 菌株光密度值曲線Fig 2 The curve of D600 nm of strains

圖3 菌株菌落形成單位變化曲線Fig 3 The curve of colony forming unit of strains

2.2 比較不同菌株間基因和蛋白表達(dá)量的差異

上文2.1的研究結(jié)果表明，在對數(shù)期末和穩(wěn)定初期，過表達(dá)micA、bprO和omU對CFU有顯著的影響。

然而我們想進(jìn)一步知道是否是由于過表達(dá)sRNAs造成micA、ompA及OmpA蛋白表達(dá)量變化的緣故，因此我們通過實時定量PCR和SDS-PAGE電泳測定發(fā)酵12 h菌體中micA和ompA相對表達(dá)水平及蛋白OmpA水平。micA相對表達(dá)水平如圖4所示，與對照pUC18菌株相比，pUC18-micA菌株的micA相對表達(dá)水平提高了4倍，pUC18-bprO和pUC18-omU菌株的micA相對表達(dá)水平分別降低了66%和54%。ompA相對表達(dá)水平如圖5所示，與對照pUC18菌株相比，pUC18-bprO和pUC18-omU菌株的ompA表達(dá)水平分別提高了7.2倍和6.9倍，pUC18-micA菌株中沒有檢測到ompA表達(dá)量，即ompAmRNA的含量低于我們的檢測限。按照1.2.5中蛋白檢測方法檢測OmpA蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示，pUC18-bprO和pUC18-omU菌株的OmpA蛋白條帶亮度明顯高于pUC18菌株，pUC18-micA菌株中沒有檢測到OmpA蛋白條帶。以上結(jié)果表明：micA能顯著降低ompAmRNA水平，進(jìn)而導(dǎo)致OmpA含量降低；bprO和omU能通過沉默micA間接提高ompAmRNA水平進(jìn)而提高OmpA的表達(dá)量，同時也再次證實了micA對OmpA的負(fù)調(diào)控。聯(lián)系2.1和2.2得到的結(jié)果可知：bprO和omU通過提高菌體OmpA蛋白含量來提高菌體的存活力，而OmpA蛋白的缺失并沒有導(dǎo)致細(xì)胞自溶表明:OmpA可能與細(xì)胞膜的完整性有關(guān)，但對菌體的存活力是至關(guān)重要的。

圖4 對比菌株相對micA基因表達(dá)水平Fig 4 Comparing relative micA expression levels between strains

圖5 對比菌株相對ompA的表達(dá)水平Fig 5 Comparing relative ompA expression levels between strains

圖6 外膜蛋白A(OmpA)SDS-PAGE結(jié)果Fig 6 The result of SDS-PAGE of OmpA

泳道1： pUC18；泳道2： pUC18-micA；泳道3： pUC18-bprO；泳道4：pUC18-omU

2.3 共表達(dá)bprO、omU和pul對普魯蘭酶產(chǎn)量的影響

大腸桿菌被廣泛地應(yīng)用于重組外源蛋白表達(dá)，主要具有以下優(yōu)點：對培養(yǎng)條件要求低、細(xì)胞快速生長、放大發(fā)酵工藝相對簡單、易實現(xiàn)生物反應(yīng)器內(nèi)高密度細(xì)胞培養(yǎng)[19]。但是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏翻譯后修飾機(jī)制[20-21]，表達(dá)的外源蛋白往往容易形成包涵體積累在周知空間，并且表達(dá)外源蛋白會對宿主細(xì)胞本身造成代謝負(fù)擔(dān)，即外源蛋白的表達(dá)對細(xì)胞生長是一種內(nèi)源脅迫[22]。代謝負(fù)擔(dān)和包涵體的積累會啟動大腸桿菌的一系列脅迫應(yīng)激途徑，其中包括sigma E介導(dǎo)的細(xì)胞自溶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促使大部分大腸桿菌可培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成一種活的但不可培養(yǎng)的狀態(tài)(VBNC)，顯著降低細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的能力[2,4,23]。因此，我們期望能通過共表達(dá)bprO、omU和pul提高普魯蘭酶的產(chǎn)量。普魯蘭酶活測定結(jié)果如圖7所示，共表達(dá)bprO、omU和pul均提高了普魯蘭酶產(chǎn)量，與pUC18-pul菌株相比，pUC18-bprO-pul和pUC18-omU-pul菌株普魯蘭酶活分別提高了1.4倍和1.8倍。本實驗結(jié)果結(jié)合2.1中結(jié)果表明：bprO和omU通過提高單位體積可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)(具有表達(dá)外源蛋白能力細(xì)胞)提高普魯蘭酶的產(chǎn)量。

圖7 普魯蘭酶活性測定結(jié)果Fig 7 The detection results of pullulanase activity

2.4 分析sRNA結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性

由圖1、2和圖6所示的結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)， 過表達(dá)omU菌株的D600 nm、CFU和普魯蘭酶活稍高于過表達(dá)bprO菌株，我們推測以上結(jié)果可能是由于bprO和omURNA二級結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的不同造成的。因此，我們分析了bprO與omU的堿基序列和預(yù)測二級結(jié)構(gòu)之間的差異。用DNA man軟件比對分析bprO和omU的堿基序列發(fā)現(xiàn)：omU基因5′端較bprO多104 bp核苷酸，剩余的堿基序列完全相同。用RNA Folding Form(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)預(yù)測并分析omU和bprORNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：omU多出的104 bp核苷酸在omURNA二級機(jī)構(gòu)的5′端形成兩個頸環(huán)結(jié)構(gòu)，且omU二級結(jié)構(gòu)的5′端較bprO恰巧多兩個頸環(huán)結(jié)構(gòu)，兩者的功能區(qū)和終止子形成的二級結(jié)構(gòu)相似(如圖8、9所示)。我們推測可能是頸環(huán)結(jié)構(gòu)能保護(hù)omURNA免于RNase酶的降解，提高omURNA穩(wěn)定性或促進(jìn)omU與micA的相互作用，提高干擾效率。omU RNA的最小自由能(-286.04 KJ/mol)明顯小于bprORNA的最小自由能(-118.30 KJ/mol)，表明bprO更容易被降解。因此，在anti-RNA功能區(qū)前端添加具有能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的堿基序列可能有助于提高anti-RNA的穩(wěn)定性及干擾效率。

圖8 sRNA bprO二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig 8 The results of predictive sRNA bprO secondary structure

圖9 sRNA omU二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig 9 The results of predictive sRNA omU secondary structure

3 討論

不利的生長環(huán)境和外源蛋白脅迫會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，將可培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)，同時啟動一系列脅迫應(yīng)激機(jī)制去除受損傷和不可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)胞[4,24]，這將大大降低宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的能力并且影響外源蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。在大腸桿菌中，外源蛋白的表達(dá)會激活sigma E介導(dǎo)的細(xì)胞自溶途徑，導(dǎo)致可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目大量減少，細(xì)胞自溶[18,25]。但在本研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)micA并沒有引起細(xì)胞自溶，僅僅顯著降低了菌株的CFU，我們推測以上結(jié)果可能是由各研究采用的研究對象、誘導(dǎo)時間的差異或micA表達(dá)量低于引起細(xì)胞自溶最低限所致。 本研究通過對大腸桿菌中sigma E介導(dǎo)的細(xì)胞自溶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析，通過過表達(dá)人工構(gòu)建micA的反式作用RNA(bprO和omU)阻斷自溶途徑，巧妙地避開了由于基因敲除和過表達(dá)目的蛋白(OmpA)對宿主改造的弊端。bprO和omU均通過沉默micA的方式間接提高ompAmRNA水平和OmpA蛋白水平。由于OmpA對大腸桿菌的存活力是至關(guān)重要的，所以過表達(dá)bprO和omU提高了宿主細(xì)胞單位體積菌落形成單位和普魯蘭酶的表達(dá)量。Ma等研究發(fā)現(xiàn)OmpA通過啟動響應(yīng)膜脅迫的Cpx-RA雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制纖維素的生成，促進(jìn)大腸桿菌生物膜的形成[26]，此研究成果為本研究所得到結(jié)果提供了進(jìn)一步的理論支撐。我們同時也初步討論了影響人工構(gòu)建sRNA反式編碼sRNA(anti-micA)干擾效率的影響因素，為anti-RNA的設(shè)計提供參考性指導(dǎo)并且對sRNA的功能產(chǎn)生新的見解。 本文實現(xiàn)了通過人工構(gòu)建sRNA的反式作用RNA來沉默sRNA功能的研究，為RNA的功能研究提供了一個全新研究方法，具有廣闊的應(yīng)用和科研前景。本實驗僅僅以表達(dá)普魯蘭酶為例，通過過表達(dá)bprO、omU提高活細(xì)胞數(shù)目促進(jìn)普魯蘭酶的高表達(dá)。因此，過表達(dá)bprO、omU還可應(yīng)用于提高其他外源蛋白表達(dá)水平，并在分子進(jìn)一步水平上闡明細(xì)胞自溶抗性機(jī)理以及為重組外源蛋白的高水平表達(dá)奠定科學(xué)理論基礎(chǔ)。

[2]CARNEIRO S, FERREIRA E C, ROCHA I. Metabolic responses to recombinant bioprocesses inEscherichiacoli[J]. J Biotechnol, 2013, 164(3):396-408.

[3]BURY-MONé S, NOMANE Y, REYMOND N, et al. Global analysis of extracytoplasmic stress signaling inEscherichiacoli[J]. PLoS Genet, 2009, 5(9):e1000651.

[4]NITTA T, NAGAMITSU H, MURATA M, et al. Function of the sigma(E) regulon in dead-cell lysis in stationary-phaseEscherichiacoli[J]. J Bacteriol, 2000, 182(18):5231-5237.

[5]Udekwu K I, Darfeuille F, Vogel J, et al.Hfq-dependent regulation ofOmpAsynthesis is mediated by an antisense RNA [J]. Genes Dev, 2005, 19(19):2355-2366.

[6]UDEKWU K I, WAGNER E G. Sigma E controls biogenesis of the antisense RNAMicA[J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35(4):1279-1288.

[7]SARAMAGO M, BRRIA C, DOS SANTOS R F, et al. The role of RNases in the regulation of small RNAs [J]. Curr Opin Microbiol, 2014, 18:105-115.

[8]NAGAMITSU H, MURATA M, KOSAKA T, et al. Crucial roles ofMicAandRybBas vital factors for sigma-dependent cell lysis inEscherichiacolilong-term stationary phase [J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2013, 23(3):227-232.

[9]WANG Y. The function ofOmpAinEscherichiacoli[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 292(2):396-401.

[11]VOGT S L, RAIVIO T L. Hfq reduces envelope stress by controlling expression of envelope-localized proteins and protein complexes in enteropathogenicEscherichiacoli[J]. Mol Microbiol, 2014, 92(4):681-697.

[12]UDEKWU K I. Transcriptional and post-transcriptional regulation of theEscherichiacoliluxS mRNA; involvement of the sRNAMicA[J]. PLoS One, 2010, 5(10):e13449.

[13]GROSSHANS H, FILIPOWICZ W. Molecular biology: the expanding world of small RNAs [J]. Nature, 2008, 451(7177):414-416.

[14]KANG Z, ZHANG C, ZHANG J, et al. Small RNA regulators in bacteria: powerful tools for metabolic engineering and synthetic biology [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(8):3413-3424.

[15]GAIDA S M, AL-HINAI M A, INDURTHI D C, et al. Synthetic tolerance: three noncoding small RNAs,DsrA,ArcZandRprA, acting supra-additively against acid stress [J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(18):8726-8737.

[16]MAN S, CHENG R, MIAO C, et al. Artificial trans-encoded small non-coding RNAs specifically silence the selected gene expression in bacteria [J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(8):e50.

[17]RASMUSSEN A A, ERIKSEN M, GILANY K, et al. Regulation ofompAmRNA stability: the role of a small regulatory RNA in growth phase-dependent control [J]. Mol Microbiol, 2005, 58(5):1421-1429.

[18]MURATA M, NOOR R, NAGAMITSU H, et al. Novel pathway directed by sigma E to cause cell lysis inEscherichiacoli[J]. Genes Cells, 2012, 17(3):234-247.

[19]MAKINO T, SKRETAS G, GEORGIOU G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria [J]. Microb Cell Fact, 2011, 10:32.

[20]SAHDEV S, KHATTAR S K, SAINI K S. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies [J]. Mol Cell Biochem, 2008, 307(1-2):249-264.

[21]CHEN R. Bacterial expression systems for recombinant protein production:E.coliand beyond [J]. Biotechnol Adv, 2012, 30(5):1102-1107.

[22]SILVA F, QUEIROZ J A, DOMINGUES F C. Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production byEscherichiacoli[J]. Biotechnol Adv, 2012, 30(3):691-708.

[23]COLWELL R R, GRIMES D J. Nonculturable microorganisms in the environment [M]. London: Chapman and Hall, 1997: 6, 20-28.

[24]NOOR R, MURATA M, YAMADA M. Oxidative stress as a trigger for growth phase-specific sigma E-dependent cell lysis inEscherichiacoli[J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2009, 17(4):177-187.

[25]CHABA R, GRIGOROVA I L, FLYNN J M, et al. Design principles of the proteolytic cascade governing the sigma(E)-mediated envelope stress response inEscherichiacoli: keys to graded, buffered, and rapid signal transduction [J]. Genes Dev, 2007, 21(1):124-136.

[26]MA Q, WOOD T K. OmpA influencesEscherichiacolibiofilm formation by repressing cellulose production through the CpxRA two-component system [J]. Environ Microbiol, 2009, 11(10):2735-2746.

Overexpression of artificial sRNA anti-micAenhancingEscherichiacoliviability and pullulanase production

AN Zhan-fei1,2, LI Ya-mei1,2, YANG Yan-kun1,2, BAI Zhong-hu1,2

(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology;2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Escherichiacoliis frequently influenced by various stresses in the process of exogenous protein expression and established various stress signaling systems that sensing and responding to specific stimuli. Recently it has been identified that many small non-coding RNAs (sRNA) have an important role in regulating mRNA translation by influencing the stability and translation efficiency of mRNA. In this research, in order to block sigma E-mediated cell lysis signal pathway, we studied the effect of overexpressing anti-micAson the tolerance ofE.colito ethanol, pullulanase production and the trans-coded RNA interference efficiency, by using artificial trans-coded sRNAs ofmicAanti-micAs (bprOandomU) to silencemicA. Moreover, the influencing factors of function of artificial trans-coded sRNAs were also discussed. Research found that inbprOandomUoverexpression strains, the colony forming units (CFU) were raised by half and one order of magnitude, respectively; theompAmRNA levels were improved by 7.2-fold and 6.9-fold, respectively and the content ofOmpAprotein was also significantly increased; pullulanase production was enhanced by 1.4-fold and 1.8-fold, respectively. Moreover, the effect ofomUoverexpression onEscherichiacoliwas slightly larger than that ofbprO.

stress; artificial sRNA; viability; cell lysis; pullulanase

2016-03-30；

2016-04-14

863項目(2015AA020802)；973項目(2013CB733602)；國家自然科學(xué)基金項目(31570034)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(JUSRP51401A)

安展飛，碩士，主要從事發(fā)酵工程研究，E-mail: 2541447869@qq.com

楊艷坤，副教授，主要從事發(fā)酵工程領(lǐng)域科研工作，E-mail: yangyankun@jiangnan.edu.cn;白仲虎，教授，主要從事發(fā)酵工程領(lǐng)域科研工作，E-mail：baizhonghu@jiangnan.edu.cn

Q786

A

2095-1736(2017)01-0016-07

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.016