白仲虎, 李 璐, 戴曉峰

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室； 2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無錫 214122)

轉(zhuǎn)錄因子FOXA1在乳腺癌分子分型中的功能研究

白仲虎1,2, 李 璐1,2, 戴曉峰1,2

(1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室； 2．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無錫 214122)

乳腺癌作為高度異源性的疾病，其準(zhǔn)確的分子分型對于乳腺癌預(yù)后判斷和制定合理的治療方案都具有十分重要的臨床意義。通過前期生物信息學(xué)分析認(rèn)為foxa1在乳腺癌中具有重要的分子分型作用，利用免疫印跡法及實時定量PCR方法在涵蓋4個乳腺癌亞型的10個乳腺癌細(xì)胞株中檢測FOXA1的mRNA及蛋白表達(dá)水平情況，探索其與乳腺癌分子亞型之間關(guān)聯(lián)，以及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的意義。結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA1的mRNA和蛋白表達(dá)量在乳腺癌Luminal A型和Luminal B型中顯著高于其在Her2過表達(dá)型和三陰性型乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)量。通過對其他促進(jìn)細(xì)胞生長的重要基因表達(dá)量的關(guān)聯(lián)分析以及基因沉默實驗，發(fā)現(xiàn)FOXA1是介于GATA3和ER的關(guān)鍵調(diào)控元素，其高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖。研究提出foxa1可以作為輔助分子對乳腺癌進(jìn)行精準(zhǔn)分型，驗證了前期的生物信息學(xué)結(jié)論，推動了乳腺癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

乳腺癌；FOXA1；分子分型；轉(zhuǎn)錄因子

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，并且作為一種高度異質(zhì)性的疾病，其預(yù)后及治療方法差異很大[1]。比如，根據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(Her2)的表達(dá)情況可將乳腺癌分為Luminal A型和B型(激素受體陽性型)、Her2過表達(dá)型和三陰性型4個類型[2]；目前已經(jīng)用于臨床的靶向治療藥物Herceptin和Tamoxifen分別只針對Her2過表達(dá)和Luminal類型的乳腺癌有效。此外，傳統(tǒng)的Luminal A和Luminal B分類在患者預(yù)后有所交叉[3-4]，預(yù)示著我們目前的分類方法并不準(zhǔn)確，還需要結(jié)合其他生物標(biāo)志物進(jìn)一步提升分類的準(zhǔn)確度。我們前期通過對乳腺癌mRNA和miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分子分型分析[5]，發(fā)現(xiàn)foxa1可能是乳腺癌亞型分類的一個重要參考指標(biāo)。有研究表明FOXA1表達(dá)可以被看成為一種腫瘤低侵襲的特征[6]，說明foxa1有可能成為預(yù)后的良好標(biāo)志物。

叉頭盒蛋白A1(forkhead box A1，F(xiàn)OXA1)，也被稱為HNF3A，是一個翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，它能夠與非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的染色體結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)，并提高其他轉(zhuǎn)錄起始因子的基因表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)錄效率，以調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[7]。在許多癌癥組織中如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等激素依賴性癌癥中均可檢測到FOXA1的表達(dá)，這說明FOXA1與包括乳腺癌在內(nèi)的許多癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。FOXA1是一個由472個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄輔助因子，可特異性地與A(A/T)TRTT(G/T)RYTY序列結(jié)合[8]。FOXA1位于人類14q21.1染色體上，其結(jié)構(gòu)包括N端為FOXA1的核心區(qū)域，結(jié)構(gòu)(H1-S1-H2-H3-S2-L1-S3-L2)主要包括一個α-螺旋H，β-折疊S和2個循環(huán)形成一個螺旋狀翼，參與雙鏈的結(jié)合過程，C端為組蛋白結(jié)合區(qū)域，主要與H3/H4組蛋白結(jié)合[9]。FOXA1通過C端能使高度壓縮甚至是關(guān)閉的染色質(zhì)與其他的轉(zhuǎn)錄因子更易結(jié)合，它通常也被稱之為“先鋒因子”[10]。

本研究旨在通過對涵蓋所有亞型的10個乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行FOXA1 mRNA以及蛋白層面的表達(dá)檢測對我們前期的生物信息學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行驗證，探索其與乳腺癌分子分型、預(yù)后狀況的關(guān)系，然后結(jié)合基因沉默等實驗手段與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析對該基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中的功能進(jìn)行進(jìn)一步探索。該研究為目前乳腺癌的分子診斷方法提供理論依據(jù)，對乳腺癌的個體化針對性治療具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 實驗所用10株乳腺癌細(xì)胞系來源為ATCC(American Type Tissue Culture Collection)，見表1。其中Luminal A型2株，Luminal B型1株，Her2過表達(dá)型2株，三陰性型5株[11]，其中BRCA1(breast cancer 1，乳腺癌1號基因)突變的細(xì)胞株有HCC1937、SUM149PT、MDAMB436，屬于Basal型乳腺癌。

1.1.2 主要試劑 一抗：FOXA1(EPR10881)兔單克隆抗體購自Abcam公司；GAPDH鼠單克隆抗體購自Abcam公司。二抗：HRP標(biāo)記的二抗?？俁NA提取試劑盒購自TIANGEN公司；RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和定量PCR試劑盒SYBR?Premix Dimer EraserTMII購自TaKaRa公司。WesternBrightTMECL檢測試劑購自Advansta公司。Western及IP細(xì)胞裂解液P0013購自碧云天公司。siRNA由蘇州吉瑪公司合成。

表1 不同細(xì)胞系的表面受體表達(dá)情況Table 1 Surface receptor expression in different cell lines

ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；Her2：人類表皮生長因子受體2

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和RT-PCR反應(yīng)

消化后收獲細(xì)胞樣本，參照總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞的總RNA，并對RNA進(jìn)行定量測定。取1 μg RNA為模版，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑說明書去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，按下述反應(yīng)條件在實時定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：SYBR?Premix Dimer EraserTMII (2×) 5 μL；PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；cDNA模板1 μL；Sterile ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次。退火溫度根據(jù)不同引物有所不同。使用Sigma Plot Software對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，以gapdh為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計算基因表達(dá)豐度。gapdh引物(上游：5′-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′；下游：5′-ATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′)，foxa1引物(上游：5′-GAAGATGGAAGGGCATGAAA-3′；下游：5′-GCCTGAGTTCATGTTGCTGA-3′)，er引物(上游：5′-CAGGCATTCGGTTTGATGAGT-3′；下游：5′-TTGGACGAAGTACAGTTCCCG-3′)和gata3引物(上游：5′-GCCCCTCATTAAGCCCAAG-3′；下游：5′-TTGTGGTGGTCTGACAGTTCG-3′)由GENEWIZ公司合成。

1.2.2 蛋白的提取及Western Blot檢測

取一定量的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液和PMSF，用BCA法測定總蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂牛奶配制TBST室溫封閉1 h，一抗GAPDH(1∶5000)，F(xiàn)OXA1(1∶5000)室溫孵育80 min，相應(yīng)二抗(1∶1000)室溫孵育1 h。ECL試劑化學(xué)發(fā)光后曝光成像。

1.2.3 細(xì)胞增殖實驗

胰蛋白酶消化好的細(xì)胞懸液用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋成4×104cells/mL，在96孔板接種細(xì)胞。接種后24 h后加入CCK-8試劑在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光值。在接種后1 d、2 d、3 d和4 d分別重復(fù)檢測步驟。

1.2.4foxa1沉默實驗

選用foxa1表達(dá)量最高的乳腺癌細(xì)胞株BT474作為樣本，接種每孔約106個cells至六孔板，用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，等到細(xì)胞匯合度達(dá)到約70%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將siFOXA1和siRNA-mate加至無血清的DMEM培養(yǎng)液中混合均勻后室溫孵育。將混合好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入相對應(yīng)的孔中，輕輕晃動六孔板使其混合均勻。37℃培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，48 h后收集的細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取。細(xì)胞增殖實驗在96孔板中進(jìn)行，接種24 h后，按照基因沉默實驗的步驟加入復(fù)合物，包括foxa1沉默的實驗組與NC無序沉默的陰性對照組。在加入復(fù)合物后的1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d分別重復(fù)檢測步驟。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

Kplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析[12]，組間曲線比較用Log-Rank檢驗，取P<0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義，網(wǎng)址為http://kmplot.com/analysis/。

2 結(jié)果與討論

2.1 FOXA1蛋白以及mRNA在不同亞型乳腺癌中的表達(dá)情況

通過Western Blot檢測可得到FOXA1表達(dá)情況如下：在Luminal A型和Luminal B型乳腺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，部分Her2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，在三陰性型細(xì)胞系中表達(dá)均較低，含有BRCA1突變的基底型細(xì)胞系與其他三陰性型細(xì)胞系相比，F(xiàn)OXA1的表達(dá)無明顯差異，gapdh為內(nèi)參(圖1)。其中Her2過表達(dá)型細(xì)胞系中FOXA1表達(dá)較高的細(xì)胞株MDAMB453存在pten突變[13]，可能是導(dǎo)致FOXA1表達(dá)異常的原因。Her2過表達(dá)型乳腺癌作為一種特殊的分子亞型，如果抑癌基因發(fā)生缺失或異常表達(dá)的情況，會影響癌癥的發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移[14]。PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因)是一種具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，位于10q23.3，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為515 kb mRNA[15]。PTEN能夠使不受控制的細(xì)胞停止分裂進(jìn)入程序性死亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生。前期研究發(fā)現(xiàn)PTEN可以抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB，也稱之AKT)通路的活化[16]。PI3K和其下游AKT通路因與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)而受到廣大學(xué)者的關(guān)注，其基本作用機(jī)制為PI3K與生長因子受體或連接蛋白相互作用, 引起二聚體構(gòu)象改變而被激活。PI3K能夠催化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)在質(zhì)膜上形成第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，從而PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)的信號蛋白AKT和PDK1(phosphoinositidedependentkinase-1)結(jié)合, 促使PDK1磷酸化AKT蛋白導(dǎo)致AKT的活化，最終對細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡和遷移等產(chǎn)生一定的影響。而抑癌基因pten可以抑制PIP2到PIP3的轉(zhuǎn)化，并降解PIP3，阻礙了AKT通路的激活，抑制腫瘤的生長[15]。有研究顯示PTEN缺失和ER缺失有一定關(guān)聯(lián)[17]。ER表達(dá)陰性的乳腺癌的癌特性在很大程度上都依賴于PI3K信號[18]。在pten缺失時，PI3K/AKT通路被激活，有可能彌補(bǔ)了ER的部分功能，導(dǎo)致FOXA1的表達(dá)異常。

圖1 不同細(xì)胞系中FOXA1蛋白表達(dá)情況(GAPDH為內(nèi)參)Fig 1 Protein level of FOXA1 expression in different cell lines

實時定量PCR檢測結(jié)果顯示：FOXA1 mRNA的表達(dá)水平與蛋白的表達(dá)水平在不同乳腺癌細(xì)胞系中的情況一致，即在Luminal A型和Luminal B型細(xì)胞株中表達(dá)較高，在Her2過表達(dá)型和三陰性型細(xì)胞株中表達(dá)水平較低，在存在pten突變的細(xì)胞株MDAMB453中表達(dá)異常，而在brca1突變株與非突變株中無明顯差異 (圖2，gapdh為內(nèi)參)。

圖2 不同細(xì)胞系中FOXA1mRNA表達(dá)情況Fig 2 mRNA level of FOXA1 expression in different cell lines

本實驗顯示在三陰性型乳腺癌中抑癌基因brca1突變與否與FOXA1的表達(dá)量之間并無顯著關(guān)聯(lián)性，說明FOXA1在Luminal與非Luminal乳腺癌的區(qū)別中起到重要輔助作用，但是該作用并不拓展到包括Basal型在內(nèi)的其他亞型。

2.2 不同F(xiàn)OXA1表達(dá)水平細(xì)胞株的細(xì)胞增殖曲線

針對不同亞型的表達(dá)不同水平FOXA1的細(xì)胞株進(jìn)行了細(xì)胞增殖實驗，見圖3。我們發(fā)現(xiàn)FOXA1高表達(dá)的細(xì)胞系如MCF7和BT474細(xì)胞株具有增殖慢的特點，而FOXA1低表達(dá)的細(xì)胞系如SKBR3和SUM159PT具有增殖快的特點。這說明FOXA1很有可能抑制癌細(xì)胞的增殖。

圖3不同細(xì)胞株的增殖曲線Fig 3 Growth curves of different cell lines

2.3foxa1沉默對細(xì)胞增殖的影響

在前面實驗的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與其他細(xì)胞株相比FOXA1在BT474細(xì)胞株中mRNA相對表達(dá)量以及蛋白水平較高。所以我們以BT474為例，觀察該細(xì)胞株在foxa1沉默后生物學(xué)行為的變化。為了驗證siRNA干擾的效果，用Western Blot檢測FOXA1的表達(dá)情況，RT-qPCR檢測FOXA1的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果如圖4。

圖4 Western Blot及qPCR檢測foxa1沉默后的表達(dá)情況Fig 4 The expression of foxa1 after silencing experiments

泳道1：BT474 NC陰性對照組；泳道2：BT474 siFOXA1的實驗組；泳道3：BT474正常生長組

從圖4中可以看出，干擾RNA能夠有效地干擾FOXA1的mRNA水平以及蛋白水平的表達(dá)。同時對干擾FOXA1表達(dá)后的細(xì)胞進(jìn)行增殖曲線實驗，結(jié)果如圖5。發(fā)現(xiàn)在干擾FOXA1在乳腺癌細(xì)胞株BT474的表達(dá)后，該細(xì)胞株的增殖速度加快，說明FOXA1確實能夠抑制癌細(xì)胞的增殖。由此推測，F(xiàn)OXA1可能是Luminal型乳腺癌生存率較高的因素之一。除此之外，Xu等[19]發(fā)現(xiàn)FOXA1在TWIST1介導(dǎo)后下調(diào)可以促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲，Bernardo等[20]發(fā)現(xiàn)foxa1沉默能夠增強(qiáng)管腔癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這都與本實驗結(jié)果具有一致性。

圖5 foxa1沉默后BT474細(xì)胞增殖的變化Fig 5 The growth curves of BT474 after silencing foxa1

2.4 FOXA1表達(dá)與乳腺癌患者存活率的關(guān)系

為了進(jìn)一步研究FOXA1的表達(dá)和臨床結(jié)果的關(guān)系，我們調(diào)用了Kplan-Meier數(shù)據(jù)庫中3557名FOXA1高表達(dá)和低表達(dá)乳腺癌患者的信息。通過對數(shù)秩檢驗確定，F(xiàn)OXA1高表達(dá)有利于提高乳腺癌患者存活率(P=0.01，圖6)。Habashy等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) FOXA1 表達(dá)與腫瘤體積小(P<0.001)，有絲分裂數(shù)少(P<0.001)，Nottingham 預(yù)后指數(shù)低(NPI)和組織學(xué)分級低(P<0.001)等被認(rèn)為低危因素相關(guān)(P<0.001)。

2.5 細(xì)胞生長關(guān)鍵基因的表達(dá)及其與FOXA1的關(guān)系

有研究報道ER和GATA3在乳腺癌細(xì)胞增殖中起到重要作用[22]，因此我們在該研究中也探索了這些基因的表達(dá)情況及其與FOXA1表達(dá)量的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示ER在Luminal A型和Luminal B型乳腺癌細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平較高，而在Her2過表達(dá)型和基底型乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)很低，實驗結(jié)果與細(xì)胞系自身的表面受體表達(dá)情況一致(圖7，gapdh為內(nèi)參，以MCF7中foxa1的相對表達(dá)量為1)。除去存在pten突變細(xì)胞株的剩余9個細(xì)胞株中，雌激素受體與FOXA1的mRNA表達(dá)水平成正相關(guān)。有研究顯示，在ER參與轉(zhuǎn)錄的過程中，F(xiàn)OXA1起到調(diào)控ER的作用[23]。作為轉(zhuǎn)錄因子FOXA1能夠識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而直接或間接促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。具體的作用機(jī)制為：FOXA1先結(jié)合到特定的染色質(zhì)上的結(jié)合位點，激活染色質(zhì)的活性，促使該染色質(zhì)區(qū)域開放，臨近區(qū)域的雌激素受體反應(yīng)元件就可以與雌激素受體結(jié)合[24]。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)OXA1參與了超過50%的雌激素受體的結(jié)合，能夠上調(diào)或下調(diào)ER的靶基因轉(zhuǎn)錄水平[25]。我們的結(jié)果從基因和蛋白層面上系統(tǒng)地對上述調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了驗證。

圖6 FOXA1表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Fig 6 Kaplan-Meier survival curves for patients with breast cancer with high or low FOXA1 expression

圖7不同細(xì)胞系中ER mRNA表達(dá)情況Fig 7 ER mRNA expression level in different cell lines

Fang等[26]在2009年發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中，大部分的ER陽性細(xì)胞均表達(dá)GATA3，說明GATA3的表達(dá)與雌激素密切相關(guān)。GATA3是含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子GATA家族中的一員，其C端的手指結(jié)構(gòu)能夠緊密地特異性結(jié)合(A / T)GATA(A / G)序列，并在細(xì)胞周期、分化、增殖和侵移中扮演著關(guān)鍵的角色[27]。有研究認(rèn)為GATA3作用于編碼FOXA1的調(diào)控區(qū)，并且FOXA1在乳腺腫瘤中的表達(dá)與GATA3密切相關(guān)。通過檢測GATA3的mRNA表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)其表達(dá)趨勢與FOXA1幾乎一致，但在三陰性型乳腺癌中的表達(dá)都處于低水平(圖8，gapdh為內(nèi)參，以MCF7中foxa1的相對表達(dá)量為1)。GATA3在正常乳腺組織和乳腺癌中都發(fā)揮了重要的作用。它在乳腺癌組織中的導(dǎo)管上皮細(xì)胞和終末芽孢中高表達(dá)，導(dǎo)管上皮細(xì)胞主要依靠來自基底膜的生存信號。在GATA3缺失后，乳腺癌腔細(xì)胞不能正常轉(zhuǎn)化為肌上皮細(xì)胞，基底膜脫落導(dǎo)致這些信號消失，最終形成半胱天冬酶介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[28]。Bernardo等[29]發(fā)現(xiàn)foxa1沉默后，仍可檢測到高水平的GATA3 mRNA和GATA3。有研究結(jié)果顯示，GATA3和FOXA1在乳腺癌中的表達(dá)具有高度敏感性和特異性，特別是ER陽性Her2陽性的乳腺癌，而在三陰性型乳腺癌中的效用受到了限制。兩者綜合分析可能會增強(qiáng)乳腺癌診斷的敏感性和特異性[30]。GATA3和FOXA1表達(dá)趨勢的高度相似性說明GATA3可能是FOXA1的一個重要或直接上游調(diào)控因子。綜上所述，我們認(rèn)為GATA3調(diào)控FOXA1，F(xiàn)OXA1調(diào)控ER。

圖8 不同細(xì)胞系中GATA3 mRNA表達(dá)情況Fig 8 GATA3 mRNA expression level in different cell lines

3 結(jié)語

乳腺癌作為世界范圍內(nèi)女性高發(fā)的惡性疾病，并且是致死率排名第二的癌癥，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，并逐漸年輕化。目前雖然已經(jīng)有了一些有效的靶向治療藥物，但是他們分別只針對個別類型的乳腺癌有效，乳腺癌的高度異質(zhì)性使得不同患者對同一治療方案反應(yīng)相差極大。因此，準(zhǔn)確的亞型分類對于精準(zhǔn)治療方案的制定和有效靶向藥物的開發(fā)都具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的乳腺癌分型方法是根據(jù)ER、PR、Her2這些免疫組學(xué)標(biāo)記物的表達(dá)情況進(jìn)行判斷。但患者在后期治療的過程中即便是標(biāo)記物的表達(dá)水平相似，預(yù)后以及歸轉(zhuǎn)也會有很大的差異，且少量PR陽性ER陰性的臨床病例為僅通過激素受體來對乳腺癌進(jìn)行分型制造了難度。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌Luminal細(xì)胞系中的FOXA1表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平顯著高于Her2過表達(dá)型和三陰性型細(xì)胞系中的表達(dá)情況，因此我們認(rèn)為FOXA1是一個可以輔助傳統(tǒng)分型分子對乳腺癌進(jìn)行進(jìn)一步準(zhǔn)確分型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。我們通過基因沉默等實驗發(fā)現(xiàn)FOXA1具有抑制細(xì)胞增殖的功能。此外，我們通過對包括gata3和er在內(nèi)與增殖相關(guān)的基因進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)FOXA1是介于GATA3和ER之間的一個關(guān)鍵調(diào)控分子，并能夠增強(qiáng)乳腺癌診斷的敏感性和特異性。本研究在基因和蛋白層面上驗證了我們前期通過生物信息手段得到的結(jié)論，也為更加精確地為乳腺癌患者制定治療方案，加速精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出了貢獻(xiàn)。

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Research on function of transcription factor FOXA1 in breast cancer subtyping

BAI Zhong-hu1,2, LI Lu1,2, DAI Xiao-feng1,2

(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University;2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Breast cancer is a highly heterogeneous disease. Its accurate molecular subtyping helps us to improve the precision of breast cancer prognosis and the corresponding therapeutic decision making. By comparing the transcriptional and translational expression offoxa1 among breast cancer cell lines, the previous hypothesis that FOXA1 is a critical factor discriminating breast cancer subtypes was validated. In addition, by silencingfoxa1 and observing the subsequent proliferation and apoptosis, the roles of FOXA1 played in breast cancer occurrence, development and prognosis were explored. Analyzing the expression offoxa1 in 10 cell lines covering four subtypes by Western Blot and real-time quantitative PCR, the expression offoxa1 in Luminal A and Luminal B breast cancers was significantly higher than that in Her2 positive and Triple negative subtypes. By analyzing the expression of other genes that promote cell growth, the result showed that FOXA1 was a key regulatory factor between GATA3 and ER, which inhibited cell proliferation.

breast cancer; FOXA1; molecular subtypes; transcription factor

2016-03-29；

2016-03-31

國家自然科學(xué)基金項目(31471251)

白仲虎，教授，主要從事生物醫(yī)藥研究與開發(fā)，E-mail：baizhonghu@jiangnan.edu.cn

戴曉峰，副教授，主要從事乳腺癌分型及靶向藥物研究,E-mail：xiaofeng.dai@me.com

R737.9

A

2095-1736(2017)01-0005-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.005