陳 霞, 厲建中, 嵇承棟

(1. 同濟大學附屬楊浦醫(yī)院 上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院，上海 200090;2. 第二軍醫(yī)大學 腫瘤研究所，上海 200433)

肝癌中EPHA3受體SAM結構域缺失突變體的發(fā)現(xiàn)

陳 霞1,2, 厲建中2, 嵇承棟1

(1. 同濟大學附屬楊浦醫(yī)院 上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院，上海 200090;2. 第二軍醫(yī)大學 腫瘤研究所，上海 200433)

酪氨酸蛋白激酶受體(RTKs)具有調節(jié)細胞生長、分化和遷移的能力，是一類多功能的跨膜糖蛋白。EPH受體家族蛋白高度保守，成員眾多，是RTKs中最大的一個分支。大量的研究表明，EPH家族蛋白不僅在胚胎發(fā)育過程中具有調節(jié)細胞間黏附或排斥、細胞遷移、軸突導向以及血管形成等多方面作用，并且在一些惡性腫瘤的血管生成、腫瘤轉移與侵襲等腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后過程中也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。在研究EPHA3受體對肝癌轉移的作用過程中，發(fā)現(xiàn)Epha3在肝癌組織中具有一種新的突變體，該突變體在其胞內部分缺失了96 bp并提前終止翻譯而缺少SAM結構域，推測其可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起調控作用。

EPHA3；突變；腫瘤；酪氨酸激酶受體

酪氨酸蛋白激酶受體(RTKs)是能夠調節(jié)細胞生長、分化和遷移能力的I型跨膜糖蛋白。EPH受體是酪氨酸激酶受體中(RTKs)最大的一個分支，成員眾多，在結構上高度保守[1]。依據其結構相似性和配體結合的專屬性，EPH受體及其ephrin配體均可分成A和B兩個亞類：即EPHA、EPHB受體與ephrinA、ephrinB配體。通常，EPH和ephrin蛋白在成年組織中的表達量除了腦部相對較高外[2]，在其他組織中的含量往往比在胚胎組織中要低很多。研究顯示，這些低表達的EPH受體或ephrin蛋白在維持血管、腎臟及腸道等組織的結構上發(fā)揮著一定的作用[3-4]。最近越來越多的研究資料顯示，EPH家族在一些惡性腫瘤中的表達存在異常變化：EPHA1作為第一個明確的受體，在肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌等多種實體瘤中過度表達[5-7]；EPHA2在人黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌中表達水平增高[8-11]，這類表達異常與腫瘤的血管生成、腫瘤轉移和侵襲及腫瘤的惡性程度密切相關[8, 12-13]，提示EPH分子有望成為抗腫瘤藥物的新靶點。

EPHA3受體最初是從前B淋巴白血病細胞表面作為抗原分離鑒定而得，在一些造血系統(tǒng)腫瘤和淋巴細胞腫瘤中存在著過度表達[14]。在正常成體黑色素細胞中EPHA3受體缺失，而在75%～80%的黑色素瘤樣本中EPHA3的表達呈陽性，且EPHA3的表達水平在遠端轉移的黑色素瘤細胞系比原位腫瘤中更高[15]。通過免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，EPHA3在膽管癌[16]、前列腺癌[17]中陽性表達率升高，且表達水平的升高與腫瘤發(fā)生或轉移有關。另有研究發(fā)現(xiàn)，EPHA3在肺、腺癌中的突變率達到了5%～10%[18]，在多組肺癌組織中該基因缺失，拷貝數(shù)明顯減少而使表達水平明顯下降[19]。在小細胞肺癌中過量表達EPHA3可以增加腫瘤細胞凋亡率和G0/G1期細胞周期阻滯，從而降低對化療藥物的抵抗[20]。

肝癌是常見的惡性腫瘤，是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。盡管多個研究顯示EPH家族在多種惡性腫瘤中表達異常，但對它們在肝癌中的表達情況及發(fā)揮的作用研究較少，對EPHA3在肝癌中的表達分布及其作用方面的研究更是只有少數(shù)幾例[21-22]。其中有研究表明，EPHA3在肝癌中的表達高低與肝癌的腫瘤大小、腫瘤轉移、分級及存活率密切相關[21]。另有一項研究發(fā)現(xiàn)，Epha3在肝癌中發(fā)生了多種突變，包括1個錯義突變和2個單核苷酸多態(tài)性突變[22]。EPHA3在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不明確。我們在從肝癌組織或細胞系中分離克隆Epha3的過程中意外發(fā)現(xiàn)，該基因在肝癌中存在96 bp的缺失，并在缺失后緊接著引入一個終止密碼而使得其原有的SAM結構域(sterile alpha motif)缺失，我們推測此為一種新型突變體——SAM結構域缺失體。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

肝正常細胞系L02、肝癌細胞系Hep3B為本實驗室保存。肝癌組織標本取自上海市長海醫(yī)院手術病人。PrimeStar HS DNA Polymerase試劑盒、PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis試劑盒購自TaKaRa公司；LATaqDNA polymerase試劑盒購自Promega公司；限制性內切酶BamH I,XhoI和SpeI購自TaKaRa公司；pGEM-T Easy Vector Systems系統(tǒng)購自Promega公司；RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 RNA提取與cDNA逆轉錄

根據試劑盒說明書進行。

1.3 引物設計

用引物設計軟件PrimerPremier 5.0，以Epha3轉錄本1(NM_005233)的編碼序列為模板設計引物(表1)，在引物兩頭分別引入BamH I和XhoI限制性酶切位點以方便克隆。由于Epha3序列過長，需將其分成兩段(Epha3-1和Epha3-2)分別進行擴增和克隆。利用基因序列中間1595位SpeI限制性酶切位點，分別向兩個方向設計引物，便于最后克隆連接。

1.4 PCR反應條件

使用TaKaRa PrimeStar高保真DNA聚合酶系統(tǒng)，以肝正常細胞系L02或癌旁組織cDNA為模板。98℃預變性3 min；98℃變性10 s，58℃退火5 s，72℃延伸100 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物進行膠回收后，再用LATaq酶系統(tǒng)，72℃延伸10 min，在3′端加上A堿基尾以便于進行TA克隆。

表1 本文所用引物Table 1 Primers used in this paper

1.5 克隆連接

PCR產物加A并回收后，與pGEM-T easy vector(Promega)載體按照說明書進行連接，轉化宿主TG1大腸桿菌。第2天進行克隆挑選培養(yǎng)，并用TIANprep Mini Plasmid Kit(北京天根生化科技有限公司)進行質粒提取，用EcoR I酶切鑒定。帶有目的片段的質粒送上海杰李生物技術有限公司測序，結果使用InforMax公司VectorNTI軟件進行序列比對驗證。

1.6 半定量PCR反應條件

使用GoTaq Green Master Mix試劑盒(Promega)，以多組肝癌及癌旁組織cDNA為模板,以Epha3-3F、Epha3-2R為引物。95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存或直接進行DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結果

2.1 PCR擴增

首先以肝正常細胞系L02的cDNA為模板，分別以Epha3-1F、Epha3-1R；Epha3-2F、Epha3-2R為引物進行擴增，分別得到Epha3-1(1614 bp)和Epha3-2(1393 bp)片段(圖1)。

圖1 肝細胞系L02中Epha3片斷擴增結果Fig 1 PCR amplification results of Epha3-1(1-2) andEpha3-2(5-6) from L02 cell line

1、2：Epha3片斷1(Epha3-1)；5、6：Epha3片斷2; 3、4：DL2000

2.2 克隆連接

PCR產物加A并割膠回收后，與pGEM-Teasy載體進行連接得到pGEM-T-Epha3-1和pGEM-T-Epha3-2，轉化大腸桿菌宿主TG1并進行質粒提取，用限制性內切酶EcoR I進行酶切鑒定。DNA電泳結果顯示pGEM-T-Epha3-1的1、3號克隆以及pGEM-T-Epha3-2的7號克隆具有目的大小片段(圖2)。

圖2 pGEM-Teasy 載體連接產物EcoR I酶切鑒定結果Fig 2 EcoR I digestion fragments of the plasmids from pGEM-T-Epha3-1(1-4) and pGEM-T-Epha3-2(7-9) colonies

1～4：pGEM-T-Epha3-l克隆質粒；7～9：pGEM-T-Epha3-2克隆質粒；5、6：DL2000

圖3 測序鑒定從肝細胞系L02中分離得到的Epha3序列Fig 3 Sequence verification of the amplified fragments from L02

2.3 序列比對

將pGEM-T-Epha3-1的1號克隆和pGEM-T-Epha3-2的7號克隆質粒送至上海杰李生物技術有限公司進行測序驗證，運用InforMax公司的VectorNTI Align X序列比對軟件進行比對，結果顯示Epha3-1為正確克隆，而Epha3-2則在3′端缺失了96 bp(圖3)，并在缺失后緊接著引入一個終止密碼，從而形成了一種新的突變體——SAM結構域缺失體。針對這種情況，我們再次以其他的cDNA文庫如肝癌細胞系Hep3B,肝癌組織cDNA為模板，進行Epha3-2的PCR擴增和克隆，結果發(fā)現(xiàn)在高轉移性肝癌細胞系Hep3B及肝癌組織中均存在著此96堿基對的缺失，而從癌旁組織中擴增得到的序列為Epha3的完整序列(圖4)。通過設計缺失片段兩側特異引物(Epha3-3F、Epha3-2R)作半定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在多組肝癌及癌旁組織中均存在Epha3的缺失突變現(xiàn)象，且野生型(321 bp)與缺失型(225 bp)同時被擴增(圖5)，我們推測這種缺失可能是一種普遍現(xiàn)象，兩者之間具有相互作用進而影響肝癌的發(fā)生與發(fā)展。SAM結構域可以介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用，有助于穩(wěn)定EPHA3二聚體的形成及其磷酸化和激酶活性[23]。因此，肝癌中SAM結構域的缺失可能削弱EPHA3的二聚體及多聚體的形成能力并影響EPHA3激酶活性的發(fā)揮，從而降低EPHA3對肝癌的抑制作用。

圖4 肝癌細胞系Hep3B及肝癌組織癌(HCC1&HCC2)、 癌旁(Side1&Side2)中Epha3序列比對Fig 4 Sequences alignment of the amplified fragments from Hep3B and HCC tissues

圖5 半定量PCR方法檢測肝癌組織中Epha3的表達情況Fig 5 Expression levels of Epha3 in HCC tissues

T：腫瘤組織；S：癌旁組織

3 討論

Epha3基因位于3號染色體3p11.2區(qū)域，該區(qū)域在多種不同的腫瘤組織中都存在著突變[24]。 研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌、結直腸癌及膠質瘤等腫瘤組織中EPH家族受體基因存在著不同程度的突變[18，25-27]。多項研究顯示，Epha3在肺癌和結直腸癌等多種腫瘤組織中存在著異常高表達，且在其基因內部存在多個位點的突變[18，22,25]。2009年，BAE等為了弄清Epha3突變是否在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起作用，運用單鏈構型多態(tài)性分析(SSCP)和測序等方法研究了73例肝癌組織中Epha3的突變情況，發(fā)現(xiàn)在肝癌中存在1個錯義突變和2個單核苷酸多態(tài)性突變(SNPs)，這兩個SNPs位于SAM結構域中[22]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)EPH家族另一成員EPHA10具有3種亞型結構，其中一種亞型即缺乏SAM結構域[28]。

研究表明，SAM結構中的酪氨酸殘基是使受體信號分子聚集的必需位點[29]，它為啟動下游反應及為結合小分子質量磷酸酶提供適宜的接觸部位。SAM結構域在EPH蛋白家族中高度保守，甚而在生物的進化過程中也是一個相當保守的結構[30]。EPH受體與配體結合后，受體的激活程度取決于配體的聚合狀態(tài)，與大多數(shù)酪氨酸激酶受體二聚化后激活不同，EPH受體的激活依賴更高的聚合程度，提示SAM結構域為EPH受體發(fā)揮功能所必需。研究報道，將SAM結構域去除后的EPHA3突變體形成二聚體的能力降低，其磷酸化水平和激酶活性均受到影響[23]。將腫瘤相關的EPHA3突變體(G187R、G766E)與野生型EPHA3共表達，明顯降低了野生型EPHA3的磷酸化水平，與促進細胞凋亡，抑制腫瘤生長的能力[19]。

我們在克隆該基因的過程中意外發(fā)現(xiàn)該基因在肝癌中普遍存在一種SAM結構域失活的新突變。通過半定量PCR擴增實驗發(fā)現(xiàn)，這種突變不僅在肝癌組織中存在，在癌旁組織中也有此突變體的轉錄，并且其中野生型和突變型同時被擴增。那么這種突變體為什么會在肝癌及癌旁中都存在？它們的作用是什么？它們在體內是否與野生型EPHA3具有相互作用？是否對野生型EPHA3的活性與功能產生影響？是否在肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮功能？這都有待于進一步深入研究。

總之，我們發(fā)現(xiàn)了EPHA3受體的一種新的突變體，但其具體的作用和意義還有待于進一步研究。我們推測SAM結構域缺失可能干擾野生型EPHA3受體的抑癌功能，是使EPHA3受體在肝癌組織中失活的一種獨特的調控方式。同時，該種缺失突變在其他腫瘤中的分布情況及在腫瘤轉移中的作用及機制還有待于更進一步的研究。

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Identification of a novel SAM-deletion mutation of the receptor tyrosine kinase EPHA3 in liver cancer

CHEN Xia1,2, LI Jian-zhong2, JI Cheng-dong1

(1. Shanghai Yangpu District Central Hospital, Yangpu Hospital, Tongji University, Shanghai 200090;2. The International Joint Cancer Institute, The Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

EPHA3 is a member of the ephrin receptor family, which composes the largest subgroup of the known receptor tyrosine kinases. EPH receptors and their ephrin ligands are essential for a variety of biological processes such as cell adhesions and repulsion, cell migration, axon guidance and angiogenesis et al, and they are implicated in cancer metastasis and invasion. In this study, a novel mutation ofEpha3 gene was unexpectedly discovered in liver cancer, where its cytoplasmic SAM domain was incomplete. It is supposedly a novel way forEpha3 regulation in liver cancer.

EPHA3; tumour; cancer; receptor tyrosine kinase

2016-03-01；

2016-06-15

國家自然科學基金青年項目(81101574)

陳 霞，助理研究員，博士，主要研究方向為腫瘤轉移機制，E-mail: chenxxchen@hotmail.com

R735.7

A

2095-1736(2017)01-0001-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.001