蘇杜林

(甘肅省禮縣實(shí)驗(yàn)中學(xué) 742200)

植物體細(xì)胞雜交是指將不同種的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。其過程主要包括原生質(zhì)體的制備、細(xì)胞融合的誘導(dǎo)、雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)以及雜種植株的再生和鑒定等環(huán)節(jié)。

1 植物體細(xì)胞雜交的原理

植物體細(xì)胞雜交首先要使原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞；其次要把雜種細(xì)胞經(jīng)過植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育成雜種植株。細(xì)胞融合的原理是細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性，植物組織培養(yǎng)的原理是植物細(xì)胞的全能性。因此，植物體細(xì)胞雜交的原理是：利用細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性和植物細(xì)胞的全能性進(jìn)行育種。

2 如何制備原生質(zhì)體

植物細(xì)胞外面堅(jiān)硬的細(xì)胞壁是細(xì)胞融合的障礙，因此在體細(xì)胞雜交前必須除去細(xì)胞壁，獲得具有活力的原生質(zhì)體。

除去細(xì)胞壁早期的方法是機(jī)械法，即通過將材料置于高滲糖溶液中,使其發(fā)生質(zhì)壁分離,當(dāng)原生質(zhì)體收縮成球狀時(shí),切開細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體。但由于這種方法費(fèi)時(shí)、繁瑣且不易獲得完整的原生質(zhì)體,目前已基本上被酶解法取代。酶解法是用不同種類和濃度的酶處理植物細(xì)胞, 將細(xì)胞壁解離,以獲得原生質(zhì)體的方法。由于植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素、果膠等，所以酶解法去壁常用的酶主要有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。正常狀態(tài)下,細(xì)胞壁對原生質(zhì)體具有保護(hù)和支持作用。但在制備原生質(zhì)體時(shí)將細(xì)胞壁去除后, 裸露的原生質(zhì)體很可能由于其內(nèi)外滲透壓的不同而發(fā)生吸水脹破或失水皺縮。因此,在酶液中必須加滲透穩(wěn)定劑以保護(hù)原生質(zhì)體的活力和質(zhì)膜的穩(wěn)定性。此外，酶液的濃度為使細(xì)胞發(fā)生輕度的質(zhì)壁分離為宜[1]。

3 如何誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有化學(xué)誘導(dǎo)和物理誘導(dǎo)兩種?；瘜W(xué)法又可分為離子誘導(dǎo)融合法、高鈣-高pH法、PEG(聚乙二醇)法等。離子誘導(dǎo)融合法常用的鹽類離子有硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣、氯化鈣等。由于PEG法對原生質(zhì)體毒性小、易操作、成本低、不需特殊設(shè)備，融合子產(chǎn)生的異核率較高，且融合過程不受物種限制。因此，該方法在植物體細(xì)胞雜交中被廣泛使用。物理誘導(dǎo)融合方法有離心、振蕩、顯微操作和電融合等。目前,電融合法得到廣泛應(yīng)用。電融合法是在融合儀的控制下在融合小室內(nèi)進(jìn)行的，其突出的優(yōu)點(diǎn)是各種指標(biāo)都可精細(xì)調(diào)節(jié)控制，融合效率均比其他方法高[2]。

4 如何篩選異型核的雜種細(xì)胞

原生質(zhì)體間的融合是隨機(jī)的，兩個(gè)不同親本的原生質(zhì)體混合后經(jīng)誘導(dǎo)融合，實(shí)際上得到的是各種原生質(zhì)體的混合物，包括異核體(AB型)、同核體(AA和BB)以及未發(fā)生融合的雙親原生質(zhì)體(A和B)。而植物體細(xì)胞雜交的目的是要突破不同種屬的植物遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，獲得具有雙親遺傳特性的新的植物類型。因此，需要通過篩選獲得異核體即雜種細(xì)胞。

篩選雜種細(xì)胞的常用方法有：①互補(bǔ)選擇法。這種方法的原理是利用現(xiàn)成的或誘發(fā)產(chǎn)生的各種缺陷型或抗性型的突變體細(xì)胞作為融合實(shí)驗(yàn)的材料。由于突變體均不能在特定的選擇性培養(yǎng)基上生長，而能在該培養(yǎng)基上正常生長的是互補(bǔ)的雜種細(xì)胞，因此可將其篩選出來。②機(jī)械選擇法。利用兩種原生質(zhì)體的某些可見標(biāo)志(如形態(tài)、顏色等差異)，對融合產(chǎn)物進(jìn)行鑒別，篩選出雜種細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。對于在形態(tài)、顏色上難以區(qū)分的原生質(zhì)體融合形成的異核體，可利用不同熒光素分別標(biāo)記兩親本的原生質(zhì)體，然后進(jìn)行誘導(dǎo)融合，在熒光顯微鏡下選擇同時(shí)帶有兩種熒光標(biāo)記的雜種細(xì)胞[3]。③組織培養(yǎng)篩選法。根據(jù)植物細(xì)胞對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的要求與反應(yīng)不同，可作為選擇雜種細(xì)胞的依據(jù)。利用這種特性或人為地造成雜種細(xì)胞生長和分化能力的差異來進(jìn)行雜種細(xì)胞的選擇[4]。

5 如何鑒定雜種植株

在雜種植株的鑒定工作中，傳統(tǒng)方法常利用形態(tài)學(xué)特征[4]作為鑒定指標(biāo)。例如，葉片的大小、形狀、葉脈、葉柄，花朵的顏色與結(jié)構(gòu)等特征作為鑒定指標(biāo)。但這種方法很難將雜種細(xì)胞的變異與非整倍體或培養(yǎng)條件引起的體細(xì)胞克隆的無性系變異區(qū)分開來。

細(xì)胞學(xué)染色體的觀察也是鑒定雜種植株的常用方法。因?yàn)樽匀晃锓N的染色體數(shù)是恒定的。不過，通過染色體數(shù)和染色體顯帶技術(shù)來鑒定特異的染色體，往往不能排除培養(yǎng)過程中所造成的染色體丟失等變異。

在體細(xì)胞雜種鑒定中應(yīng)用最普遍的生化方法是同工酶分析法。其依據(jù)是體細(xì)胞雜種的同工酶譜可表現(xiàn)為雙親酶帶的總和，或同時(shí)出現(xiàn)雙親特有的譜帶，或者也有可能出現(xiàn)新的雜種帶和丟失部分親本帶[1]。

目前，應(yīng)用 DNA重組技術(shù)從分子水平上來鑒定雜種的方法受到很多科學(xué)家的青睞。由于每個(gè)物種都有其特定的RFLP圖譜，即限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性指紋圖譜。用物種特異的重復(fù)DNA作探針，與 DNA限制片段雜交以后，就可以根據(jù)特異的圖譜鑒定出雜種[2]植株。

6 如何確定雜種植株的染色體數(shù)目和基因型

植物體細(xì)胞雜交即兩個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，如果不發(fā)生細(xì)胞核或染色體的丟失，則不管染色體數(shù)、基因型、基因組數(shù)還是染色體組數(shù)都是兩者之和，屬于染色體變異。例如，某植物細(xì)胞含2N條染色體，2個(gè)染色體組，基因型為AaBb；另一植物細(xì)胞含有2M條染色體，2個(gè)染色體組，基因型為ccDd。則雜種植株細(xì)胞含染色體2N+2M條，含染色體組4個(gè)，屬于4倍體，其基因型為AaBbccDd。

7 雜種植株可育嗎

單從理論上分析，雜種植株是否可育，取決于其能不能正常進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)生正常的生殖細(xì)胞，如若可以則是可育的，否則就是不育。例如，兩種親本細(xì)胞都是二倍體，雜種細(xì)胞就含有雙親細(xì)胞的各兩個(gè)染色體組，能夠進(jìn)行正常的減數(shù)分裂，產(chǎn)生正常配子且是可育的；如果是兩種植物的花粉細(xì)胞雜交的雜種植株，由于染色體不能正常聯(lián)會(huì)形成正常配子，就是不育的，但若用秋水仙素處理，使染色體數(shù)目加倍，就能正常進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)生正常配子且就成為可育的了。而現(xiàn)實(shí)的情況是，雜種植株的形成過程中往往會(huì)發(fā)生細(xì)胞核或染色體的丟失等現(xiàn)象，大多不能形成正常配子且是不育的。