葛重宇，龐 慧，李 楠，鄭 潔，何昌隆，楊 歡#，沈玉萍（1.無(wú)錫市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇無(wú)錫14000；.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 101；.鎮(zhèn)江市藥品檢驗(yàn)所，江蘇鎮(zhèn)江 1050）

·藥品監(jiān)督·

18家企業(yè)阿膠中氨基酸的含量分析與比較研究Δ

葛重宇1＊，龐 慧2，李 楠3，鄭 潔2，何昌隆2，楊 歡2#，沈玉萍2（1.無(wú)錫市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇無(wú)錫214000；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市藥品檢驗(yàn)所，江蘇鎮(zhèn)江 212050）

目的：為阿膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。方法：采用全自動(dòng)氨基酸分析儀分別測(cè)定18家企業(yè)共18批次阿膠中17種氨基酸的含量，再對(duì)含量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和聚類(lèi)分析，以了解各種氨基酸之間的聯(lián)系，并將相似的阿膠產(chǎn)品進(jìn)行集合與分類(lèi)。結(jié)果：除1批次阿膠外，其余17批次均含有17種目標(biāo)氨基酸，包括蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）和賴(lài)氨酸（Lys）7種人體必需氨基酸，尤其以甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro）的含量較高；氨基酸總含量介于66.1%～82.0%之間，相差較大。主成分分析提取得到4個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到89.578%，并認(rèn)為Pro、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、Leu、Ile、Thr是市售阿膠的特征氨基酸。聚類(lèi)分析得到表征3張市售阿膠樹(shù)系圖，歐式距離系數(shù)均在0～25之間變動(dòng)。結(jié)論：市售阿膠中氨基酸總含量相差較大，且不同企業(yè)阿膠中各種氨基酸的含量也有一定差異。阿膠中蛋白質(zhì)成分主要為膠原蛋白，可以利用測(cè)定氨基酸含量來(lái)監(jiān)控阿膠質(zhì)量。

阿膠；氨基酸；主成分分析；聚類(lèi)分析

膠類(lèi)中藥應(yīng)用歷史悠久，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]中即載有阿膠、鹿角膠為上品。該類(lèi)藥具有補(bǔ)血止血、滋陰潤(rùn)燥等功效，尤以滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用最為突出[2]。阿膠是馬科動(dòng)物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠[3]，由于其價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上的偽品和混淆品較多，常用廉價(jià)的明膠、豬皮膠（新阿膠）、黃明膠、雜皮膠等仿冒正品阿膠[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)阿膠的研究較少，研究者通常采用理化方法對(duì)阿膠進(jìn)行檢測(cè)，例如測(cè)定微量元素[5]和甘氨酸（Gly）等個(gè)別氨基酸[6-7]的含量，但尚不足以比較全面反映阿膠的內(nèi)在質(zhì)量以及作為阿膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。

本研究分析了18家企業(yè)各1批市售阿膠的氨基酸含量，并根據(jù)氨基酸含量差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括主成分分析（PCA）和聚類(lèi)分析（HCA）[8-9]，以期為阿膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

S-433D型氨基酸分析儀（德國(guó)Sykam公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；RVC 2-18型真空離心濃縮儀（德國(guó)Christ公司）；NUII-40L型純水機(jī)（南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品[包括苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）、Gly、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、門(mén)冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、賴(lài)氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、組氨酸（His），中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140624-200805]；甲醇、鹽酸、硼酸、氯化鋰、氫氧化鋰、辛酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、三水乙酸鈉、醋酸鉀、茚三酮、苯酚等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氮?dú)鉃楦呒兊獨(dú)?；水為超純水?8批次市售阿膠商品置于陰暗處保存，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 18家企業(yè)18批次市售阿膠商品信息Tab 1 Information of 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

2 方法

2.1 溶液的配制

緩沖液A（pH 2.90）、B（pH 4.20）、C（pH 8.00）與再生液、樣品稀釋液（pH 2.20）按表2方法配制，最后均用超純水定容至1.0 L。緩沖液A用0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，緩沖液B、C和再生液、樣品稀釋液均用0.45 μm水系濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液于4℃保存。

鈉鉀緩沖液的配制[pH為（5.51±0.03）]：精密稱(chēng)取272.0 g三水醋酸鈉和196.0 g醋酸鉀，加入少量超純水溶解，之后緩慢加入200 mL乙酸，直至醋酸鈉完全溶解，冷卻至室溫，最后用超純水定容至1.0 L。溶液用0.45 μm水系濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液于密封玻璃瓶中室溫保存。

2.2 氨基酸測(cè)定方法與分析條件

將各批次阿膠樣品粉碎后過(guò)60目篩，精密稱(chēng)取30.0 mg粉末，放入安瓿瓶中，加入5 mL的6 mol/L鹽酸溶液，充入高純氮?dú)獠⒀杆儆脟姛舴饪?，然后置?10℃恒溫干燥箱內(nèi)，水解24 h。取出，冷卻至室溫，打開(kāi)封口，將水解液過(guò)濾至25 mL量瓶中，用超純水沖洗安瓿瓶，合并濾液，定容至刻度。精密吸取0.5 mL濾液于離心管內(nèi)，以真空離心濃縮儀去除溶劑，溫度60℃，重復(fù)蒸干1～2次。加入1.0 mL樣品稀釋液復(fù)溶，震蕩混勻，用0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾后，供上機(jī)測(cè)定使用。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照中國(guó)食品藥品檢定研究院出具的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行配制。設(shè)定氨基酸參數(shù)，以茚三酮柱后衍生-氨基酸分析儀法測(cè)定阿膠中17種氨基酸含量，選用440 nm波長(zhǎng)檢測(cè)Pro，選用570 nm波長(zhǎng)測(cè)定Gly等其余16種氨基酸。

表2 各緩沖液配制方法Tab 2 Buffer preparation method

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 由于測(cè)得的各種氨基酸含量的差異很大，故選用Z得分方法[10]進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理的變量權(quán)重相同、均值都為0、方差均為1，然后采用SPSS 16.0分析軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和HCA。

2.3.2 PCA PCA是根據(jù)變量變換的思想，用少數(shù)相互獨(dú)立的新的綜合變量來(lái)描述各變量之間的關(guān)系，從而達(dá)到簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)的目的。本研究以氨基酸含量為指標(biāo)，對(duì)18批市售阿膠中17種氨基酸進(jìn)行了PCA。以原始數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣、方差貢獻(xiàn)率及累積方差貢獻(xiàn)率為依據(jù)，對(duì)主成分進(jìn)行選擇[11]，可以更為簡(jiǎn)便地觀察阿膠中各種氨基酸之間的聯(lián)系。

2.3.3 HCA HCA是統(tǒng)計(jì)學(xué)中研究“物以類(lèi)聚”的一種有效方法，能將一批樣品數(shù)據(jù)按照其性質(zhì)上的親密程度將相似性個(gè)體自動(dòng)集合，并進(jìn)行分類(lèi)。本研究主要對(duì)18批市售阿膠進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，采用Ward法，聚類(lèi)距離采用歐式距離方法，將相似的阿膠進(jìn)行集合與分類(lèi)。

3 結(jié)果

3.1 氨基酸含量

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1所示。

由圖1可見(jiàn)，在檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm和440 nm下，分析時(shí)間60 min內(nèi)，各種氨基酸能夠較好地分離。此后，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀分別測(cè)定18個(gè)廠家18批次市售阿膠中17種氨基酸的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，阿膠樣品的分析圖譜見(jiàn)圖2。

圖1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig 1 Chromatograms of amino acid standard mixture

由表3可見(jiàn)，在已測(cè)定的氨基酸中，Gly和Pro在阿膠中含量較高，Ala、Arg和Asp次之，而Cys的含量最低。樣品中Gly的含量，尤其是Pro的含量較高，進(jìn)一步證明阿膠中蛋白質(zhì)類(lèi)化學(xué)成分主要由膠原蛋白構(gòu)成。除桃源阿膠外，其余17批次均含有17種目標(biāo)氨基酸，包括Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe和Lys 7種人體必需氨基酸，氨基酸總含量介于66.1%～82.0%之間。阿膠是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的補(bǔ)益類(lèi)中藥，本研究發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)所生產(chǎn)的阿膠中氨基酸種類(lèi)和含量均較為豐富。

3.2 PCA結(jié)果

采用相關(guān)系數(shù)矩陣直觀檢驗(yàn)，根據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣中相關(guān)系數(shù)的大小所反映出變量之間的線性相關(guān)程度來(lái)進(jìn)行適用性檢驗(yàn)。由分析軟件計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣可知，氨基酸含量之間既存在正相關(guān)也存在負(fù)相關(guān)，并且多數(shù)氨基酸含量間的相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于0.3，表明氨基酸含量之間有較強(qiáng)的相關(guān)性[11]。

表3 18家企業(yè)18批次阿膠中17種氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 Contents of 17 amino acids in 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

以氨基酸含量為分析指標(biāo)，對(duì)18批市售阿膠中17種氨基酸進(jìn)行了PCA，計(jì)算出主成分特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率；依據(jù)累積貢獻(xiàn)率大于85%的原則，選取了4個(gè)主成分，使得累積貢獻(xiàn)率達(dá)到89.578%。18個(gè)廠家18批次阿膠中17種氨基酸主成分的全部方差解釋結(jié)果見(jiàn)表4。

如表4所示，第一主成分特征值為10.885，貢獻(xiàn)率為64.030%，即反映了18批市售阿膠中17種氨基酸含量全部性狀的64.030%的信息；第二主成分特征值為2.076，反映了全部性狀的12.213%的信息；主成分三的特征值為1.393，解釋了總變異的8.192%；主成分四的特征值為0.874，解釋了總變異的5.144%。以上表明，前4個(gè)主成分可較為全面地反映阿膠中17種氨基酸的綜合性狀。

在成分矩陣中，給出了主成分載荷矩陣，每一列載荷值都顯示了各變量與有關(guān)主成分的相關(guān)系數(shù)。18個(gè)廠家18批次阿膠中17種氨基酸PCA中的成分矩陣結(jié)果見(jiàn)表5。

從表4和表5可以看出，總方差50%以上的貢獻(xiàn)率來(lái)自第一主成分，而第一主成分的主要指標(biāo)變量是含量較高的Pro、Ala、Glu與含量相對(duì)較低的Asp、Leu、Ile、Thr。因?yàn)檫@些氨基酸與第一主成分高度正相關(guān)，所以認(rèn)為Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Thr是市售阿膠的特征氨基酸。

3.3 HCA結(jié)果

對(duì)18家企業(yè)生產(chǎn)的阿膠產(chǎn)品進(jìn)行聚類(lèi)，得到聚類(lèi)樹(shù)系，見(jiàn)圖3。

圖2 阿膠樣品的色譜圖（東阿阿膠，批號(hào)：110223）Fig 2 Chromatogram of Ejiao sample（Dong’e Ejiao，B/N：110223）

表4 18家企業(yè)18批次阿膠中17種氨基酸主成分的全部方差解釋結(jié)果Tab 4 Total variance explanation of 17 amino acids principal components in 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

以水平放置的樹(shù)形結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)分析形圖呈現(xiàn)了聚類(lèi)分析中每一次類(lèi)合并的情況。取18批市售阿膠的平均圖譜，基于歐式距離對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到表征3張市售阿膠樹(shù)系圖，歐式距離系數(shù)均在0～25之間變動(dòng)。結(jié)果如圖3所示，供試品可大致劃分為3個(gè)表征群。由此可見(jiàn)，雖然這些阿膠的產(chǎn)地均為山東，但是不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量仍然存在一定差異。

4 討論

4.1 膠原蛋白

阿膠是富含蛋白質(zhì)的補(bǔ)益類(lèi)中藥，可以利用氨基酸含量測(cè)定監(jiān)控阿膠質(zhì)量。本研究測(cè)定了阿膠中17種氨基酸，發(fā)現(xiàn)其氨基酸種類(lèi)和含量較為豐富，尤其是Gly和Pro的含量較高，表明阿膠中蛋白質(zhì)類(lèi)化學(xué)成分主要由膠原蛋白構(gòu)成。

表5 18家企業(yè)18批次阿膠中17種氨基酸PCA中的成分矩陣結(jié)果Tab 5 Component matrix of principal component analysis of 17 amino acids in 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

圖3 18家企業(yè)阿膠產(chǎn)品的聚類(lèi)樹(shù)系圖Fig 3 Clustering tree of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

4.2 特征氨基酸

PCA表明，Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Thr是市售阿膠的特征氨基酸。此外，市售阿膠中總氨基酸含量相差較大，可能是由于各廠家的制備工藝存在一定的差異所致，參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[3]中阿膠的制法，其中驢皮原料、料液比、煎煮時(shí)間、濃縮方法（減壓濃縮、常壓濃縮）[12]、輔料的比例未統(tǒng)一規(guī)定是造成這一差異的主要因素。

4.3 研究不足之處

本研究只選取了18家企業(yè)的市售阿膠進(jìn)行氨基酸的含量測(cè)定，而同一企業(yè)的不同批次產(chǎn)品可能存在一定差異，因此在下一步研究中，將擴(kuò)大樣本測(cè)定范圍，以加強(qiáng)研究的系統(tǒng)性和深入性，使研究結(jié)果更具有實(shí)用價(jià)值。此外，本研究以臨床常用膠類(lèi)中藥之一阿膠為分析對(duì)象，而龜甲膠、鹿角膠、鱉甲膠、黃明膠、新阿膠等膠類(lèi)中藥的氨基酸組成是否與阿膠有所區(qū)別也尚待研究。

[1] 王子壽，薛紅.神農(nóng)本草經(jīng)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2008：164-165.

[2] 艾偉霞，鄭虹.阿膠與易混淆品的鑒別[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015，15（27）：171.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：189-190.

[4] 徐瑩，陳晨，沈玉萍，等.動(dòng)物藥鑒定的研究現(xiàn)狀與對(duì)策探討[J].中草藥，2014，45（4）：578-581.

[5] 馮夏紅，康廷國(guó)，齊國(guó)柱.動(dòng)物膠類(lèi)藥材中無(wú)機(jī)元素的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1998，9（6）：520-521.

[6] 陳萍紅，王書(shū)芳，龔行楚.柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定阿膠中13種氨基酸[J].中草藥，2013，44（14）：1995-1999.

[7] 謝誼，易艷，劉陽(yáng)，等.柱前衍生HPLC測(cè)定阿膠中17種水解氨基酸含量[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（5）：46-49.

[8] Yi T，Zhu L，Peng WL，et al.Comparison of ten major constituents in seven types of processed tea using HPLCDAD-MS followed by principal component and hierarchical cluster analysis[J].LWT-Food Science and Technology，2015，62（1）：194-201.

[9]Wang ZH，Wang DM，Zheng SH，et al.Ultra-performance liquid chromatography quadrupole/time of flight mass spectrometry with multivariate statistical analysis for exploring potential chemical markers to distinguish between raw and processed Rheum palmatum[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2014（14）：302-305.

[10] 劉小芳，薛長(zhǎng)湖，王玉明，等.刺參中無(wú)機(jī)元素的聚類(lèi)分析和主成分分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（11）：3119-3122.

[11] 賈成友，趙鳳平，李微，等.HPLC指紋圖譜結(jié)合共有模式識(shí)別評(píng)價(jià)重慶市售青蒿飲片質(zhì)量的一致性[J].中國(guó)藥房，2015，26（27）：3828-3831.

[12] 張貴鋒，劉濤，王前，等.阿膠生產(chǎn)工藝中膠原蛋白降解過(guò)程研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（10）：1211-1215.

Content Analysis and Comparative Study of Amino Acids in Ejiao from 18 Manufacturers

GE Chongyu1，PANG Hui2，LI Nan3，ZHENG Jie2，HE Changlong2，YANG Huan2，SHEN Yuping2（1.Dept.of Pharmacy，Wuxi Third People’s Hospital，Jiangsu Wuxi 214000，China；2.School of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China；3.Zhenjiang Institute for Drug Control，Jiangsu Zhenjiang 212050，China）

OBJECTIVE：To provide reference for quality evaluation of Ejiao.METHODS：The contents of 17 amino acids in 18 batches of Ejiao from 18 manufacturers were analyzed by automatic amino acid analyzer；the content data was processed by principal component analysis（PCA）and hierarchical clustering analysis（HCA），in order to understand the relationship among these amino acids and categorize the Ejiao products.RESULTS：Except for a batch of Ejiao，the other 17 batches contained 17 various amino acids，including 7 necessary amino acids（Thr，Val，Met，Ile，Leu，Phe and Lys）for human being，especially the contents of Gly and Pro were higher.The total content of amino acids was arranged from 66.1%to 82.0%，showing great difference.Four main components were extracted by PCA，the cumulative contribution of which was 89.578%，and accordingly it may be considered that Pro，Ala，Glu，Asp，Leu，Ile and Thr were characteristic amino acids of Ejiao products.In hierarchical clustering analysis，3 tree figures of commercial Ejiao product were achieved and Euclidean distance was varied among 0-25.CONCLUSIONS：There is great difference in total control of amino acid in commercial Ejiao product；Ejiao products from various manufacturers differ in their amino acid contents.Ejiao is rich in collagen，and therefore，using amino acid determination would be helpful to monitor its quality.

Ejiao；Amino acids；Principal component analysis；Hierarchical clustering analysis

R282

A

1001-0408（2017）01-0122-05

2016-04-26

2016-08-16）

（編輯：余慶華）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81303174）；江蘇省科技項(xiàng)目（No.BK20150463）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（No.2016M590425）；江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目（No.14A457）

＊主管藥師。研究方向：中藥分析。E-mail：56057702@qq.com

#通信作者：副教授。研究方向：中藥分析。E-mail：yanghuan-1980@ujs.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.32