崔寧 明亮 王云龍,2 劉紅春 王萬海 李玉林 王繼創(chuàng)

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南 鄭州 450052； 2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 河南 鄭州 450121；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心 河南 鄭州 450001)

·論 著·

D-二聚體膠體金免疫層析定量檢測方法的初步建立

崔寧1明亮1王云龍1,2劉紅春1王萬海1李玉林3王繼創(chuàng)3

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南 鄭州 450052； 2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 河南 鄭州 450121；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心 河南 鄭州 450001)

目的 建立一種檢測D-二聚體的膠體金免疫層析定量檢測方法，為臨床檢測D-二聚體提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。方法 根據(jù)免疫學(xué)中雙抗體夾心和免疫層析的原理，研制定量檢測樣本中D-二聚體的膠體金試紙條，在金標(biāo)定量儀上建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從靈敏度、特異性、線性、精密性、穩(wěn)定性和方法學(xué)對(duì)比等方面對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 本試紙條的線性范圍為0.156 25～10 μg/ml，回歸方程Y=92.907X+307.88，R2=0.982 68；批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為3.78%和2.81%，批間變異系數(shù)(CV)為4.95%和4.07%；與纖維蛋白原無交叉反應(yīng)性；在37 ℃條件下保存1周；與IL公司ACL-TOP700檢測系統(tǒng)免疫比濁法的相關(guān)性良好，回歸方程Y=0.959 64X+0.026 45，相關(guān)系數(shù)R2=0.985 93。結(jié)論 本研究初步建立了檢測D-二聚體的膠體金免疫層析定量檢測方法，為臨床檢測D-二聚體提供了一種新的技術(shù)和方法。

D-二聚體；膠體金免疫層析；定量

D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白(Fb)經(jīng)纖溶酶作用后的特異降解產(chǎn)物，可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物[1]，是唯一反映凝血和纖溶的理想指標(biāo)。D-二聚體正常參考值范圍為0～243 ng/ml，臨床上一般以0.5 μg/ml作為判斷D-二聚體是否增高的臨界值[2-4]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來血栓及肺栓塞性疾病、DIC、心腦血管疾病及惡性腫瘤等疾病發(fā)病率有逐年增高的趨勢。研究表明，在這些疾病中，均會(huì)有凝血及纖溶系統(tǒng)的異常，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)D-二聚體水平的升高，其升高程度與病情進(jìn)展程度密切相關(guān)[4-7]。因此，檢測樣本血漿中D-二聚體的含量可以輔助診斷以上疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其在肺栓塞和深靜脈血栓的排除診斷中，D-二聚體具有極其重要的臨床排除診斷價(jià)值[3，8]。此外，也有研究表明，D-二聚體的升高與急性胰腺炎、糖尿病血管性病變及急慢性蕁麻疹等疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有極其密切的聯(lián)系[9]。因此，檢測樣本血漿中D-二聚體的含量具有極其重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

隨著方法學(xué)的不斷進(jìn)步，D-二聚體的檢測方法日趨完善[6，10]，目前臨床上應(yīng)用最多的是免疫比濁法。免疫比濁法雖有定量準(zhǔn)確、靈敏度高、試劑重復(fù)性好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但不能實(shí)現(xiàn)快速檢測，需要大型的特殊儀器設(shè)備，這使其不能在基層和社區(qū)醫(yī)院普及。膠體金免疫層析法具有快速、操作簡便、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了免疫比濁法的不足。隨著膠體金免疫層析法的不斷發(fā)展和成熟，其已從定性發(fā)展為定量，既能定性，又能定量，并越來越廣泛地應(yīng)用于多種物質(zhì)的檢測。在D-二聚體的定量檢測中，一直缺少一種簡便快速的檢測方法，這使得膠體金免疫層析定量檢測方法以其獨(dú)特的優(yōu)勢有望應(yīng)用于D-二聚體的定量檢測中。本課題就D-二聚體的膠體金定量檢測方法的建立進(jìn)行了相對(duì)深入全面的研究，初步建立了D-二聚體膠體金免疫層析定量檢測方法。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 金標(biāo)定量儀購自天根生物科技有限公司；HM3030型三維平面點(diǎn)膜噴金儀購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；CT300型截條機(jī)購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；TG16-W微量高速離心機(jī)購自長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.1.2 試劑 抗D-二聚體單克隆抗體(包被用和標(biāo)記用)、羊抗鼠IgG均由河南省生物工程中心提供。

1.2 材料 硝酸纖維素膜(型號(hào)：CN140)：賽多利斯(sartorius Stedim)；玻璃纖維棉購自上海良信生物科技有限公司；吸水紙由上海金標(biāo)生物科技有限公司提供。

1.3 標(biāo)本

1.3.1 樣本 正常人全血標(biāo)本(乙肝、丙肝、梅毒及人類免疫缺陷病毒均為陰性，且無脂血、溶血)和D-二聚體全血樣本均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.3.2 室內(nèi)參考品 由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.4 方法[8-11]

1.4.1 免疫金墊的制備

1.4.1.1 膠體金溶液的制備 采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金，氯金酸溶液與檸檬酸鈉溶液的體積比為100 μl∶150 μl。

1.4.1.2 最佳標(biāo)記pH的確定 將制備好的膠體金溶液用1.5 ml的離心管分裝8管，每管1.0 ml。用0.02 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH分別至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每管加入6 μl標(biāo)記用D-二聚體單克隆抗體，混勻。30 min后，在上述各管中加入0.1 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl溶液，觀察各管顏色變化。以溶液顏色不再變化的最小碳酸鉀量為最佳碳酸鉀量，其所對(duì)應(yīng)的pH為最佳pH。

1.4.1.3 最適標(biāo)記濃度的確定 設(shè)置以下5個(gè)濃度的最佳量標(biāo)記蛋白：0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml，按照本課題D-二聚體金標(biāo)工藝制備成5種試紙條，用D-二聚體室內(nèi)參考品檢測以上5種試紙條的線性，線性最優(yōu)的標(biāo)記濃度即膠體金標(biāo)記的最佳標(biāo)記蛋白濃度。

1.4.1.4 免疫金的制備 取1.5 ml離心管若干支，每管加入1 ml膠體金溶液；每管加入最佳量的0.02 mol/L K2CO3，混勻；再向每管加入6 μl最佳濃度D-二聚體標(biāo)記抗體，混勻，室溫靜置5 min；每管中加入質(zhì)量為數(shù)為10% BSA 15 μl，混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/min離心10 min，棄上清；向每管中加入1 ml洗液使沉淀充分溶解，混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清；向每管中加入200 μl金標(biāo)保護(hù)液，使沉淀充分溶解，混勻，即得到實(shí)驗(yàn)所需免疫金。

用以下兩種方法對(duì)免疫金進(jìn)行鑒定：①用紫外分光光度計(jì)測定免疫金的吸光度值，并與未標(biāo)記膠體金溶液的吸光度值進(jìn)行比較，以吸光度值是否增加判斷是否標(biāo)記成功；②用此免疫金按照本課題D-二聚體金標(biāo)工藝制備D-二聚體試紙條，用D-二聚體陽性標(biāo)本和生理鹽水在試紙條上檢測，以試紙條顯色與否判斷是否標(biāo)記成功。

1.4.1.5 免疫金墊的制備 打開三維平面點(diǎn)膜噴金儀，取合適長度10 mm寬的玻璃纖維棉，按照40 μl/cm的噴金量將制備的免疫金均勻噴于玻璃纖維棉上，置于37 ℃烘箱內(nèi)干燥4 h，備用。

1.4.2 包被

1.4.2.1 最佳硝酸纖維素(NC)膜的選擇 選取賽多利斯(Sartorius Stedim)公司CN140、CN95、JN90 3種硝酸纖維素膜，用D-二聚體參考品分別檢測由以上3種NC膜制備而成的試紙條，以爬行速度、顯色背景、有無非特異性反應(yīng)及線性為考察標(biāo)準(zhǔn)，以爬行速度最快、背景最清晰、無非特異性反應(yīng)且線性最優(yōu)的NC膜為最佳NC膜。

1.4.2.2 最適包被濃度的確定 設(shè)置以下5種濃度的D-二聚體包被抗體：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml。按照本課題D-二聚體膠體金試紙條制備工藝制備出此5個(gè)包被濃度的試紙條，用D-二聚體參考品檢測此5種試紙條的線性，線性最優(yōu)的包被濃度即為試紙條檢測線的最佳包被濃度。

1.4.2.3 包被 用0.02 mol/L pH 7.8的磷酸鹽緩沖液將包被用D-二聚體單克隆抗體稀釋至最適濃度，將羊抗鼠IgG多克隆抗體稀釋至1.0 mg/ml，分別作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)。用三維平面點(diǎn)膜噴金儀以1 μl/cm的速度將稀釋好的抗體包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上，置于37 ℃干燥4 h后備用。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.4.3.1 參考品的稀釋 用生理鹽水對(duì)40 μg/ml的D-二聚體參考品做倍比稀釋，得到以下濃度的一系列室內(nèi)參考品：40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 μg/ml，現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。

1.4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件的最優(yōu)結(jié)果制備D-二聚體試紙條，用此試紙條和一系列參考品在金標(biāo)定量儀上測定，每個(gè)濃度的參考品檢測3次，取其平均值。以平均值為橫坐標(biāo)，以金標(biāo)定量儀上的參數(shù)area為縱坐標(biāo)建立曲線。將偏離線性的高值和低值剔除，直至出現(xiàn)最寬的線性和最大的R2值，并保證曲線所覆蓋的濃度值至少為6個(gè)。線性范圍的低值不小于0.312 5 μg/ml，同時(shí)R2值達(dá)到0.98以上的曲線為最終的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 試紙條性能評(píng)價(jià)

1.4.4.1 特異性評(píng)價(jià) 將濃度大于10 mg/ml的纖維蛋白溶液、濃度大于5.63 mmol/L的甘油三酯溶液和濃度大于343 μmol/L的膽紅素溶液各取75 μl滴加到試紙條上，15 min內(nèi)觀察顯色情況。

1.4.4.2 精密性評(píng)價(jià) 用5 μg/ml和2.5 μg/ml這兩個(gè)濃度的參考品分別對(duì)試紙條進(jìn)行批內(nèi)精密性和批間精密性檢測。①批內(nèi)精密性：抽取同一批試紙條20條，用上述兩個(gè)濃度的參考品進(jìn)行檢測，每種參考品測10條，分別計(jì)算每個(gè)濃度參考品測量結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式：CV=SD/M×100%計(jì)算出變異系數(shù)(CV)。結(jié)果應(yīng)達(dá)到CV≤15%。②批間精密性：連續(xù)制備3批試紙條，每批抽取20條，用上述兩個(gè)濃度的參考品進(jìn)行測定，每個(gè)濃度的參考品每批測10條，每個(gè)濃度的參考品共測30條，分別計(jì)算每個(gè)濃度參考品的測量結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式CV=SD/M×100%計(jì)算變異系數(shù)(CV)。結(jié)果應(yīng)達(dá)到CV≤15%。

1.4.4.3 穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 用各個(gè)最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件制備一批試紙條，從中抽取100條置于37 ℃存放1周，選取0.156 25、2.5、10 μg/ml 3個(gè)濃度參考品進(jìn)行檢測，每間隔1 d檢測1次，考察試紙條的線性、特異性和精密性是否符合要求。

1.4.5 方法學(xué)對(duì)比 用本課題建立的檢測方法對(duì)已用美國IL公司ACL-TOP700檢測系統(tǒng)(免疫比濁法)定值的55份臨床標(biāo)本中的D-二聚體含量進(jìn)行測定，將檢測結(jié)果與IL公司的檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算兩種檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2值，比較其相關(guān)性。

2 結(jié)果與方法學(xué)對(duì)比

2.1 最佳標(biāo)記pH的確定 pH為7.5、8.0、8.5、9.0(對(duì)應(yīng)K2CO3量依次為12、15、20、25 μl)時(shí)膠體金溶液顏色未發(fā)生改變，選取最小K2CO3量(12 μl)對(duì)應(yīng)的pH為最佳標(biāo)記pH。見圖1。

圖1 不同pH條件下膠體金的穩(wěn)定性

2.2 最適標(biāo)記濃度的確定 標(biāo)記濃度在1.5 mg/ml時(shí)線性最優(yōu)，故選取1.5 mg/ml為最佳標(biāo)記蛋白濃度。見表1。

2.3 免疫金鑒定結(jié)果 膠體金溶液標(biāo)記后比標(biāo)記前吸光度值增大，見圖2。D-二聚體陽性標(biāo)本和生理鹽水的檢測結(jié)果中，陽性標(biāo)本質(zhì)控線和檢測線均顯色，陰性標(biāo)本質(zhì)控線顯色，見圖3。以上均說明標(biāo)記成功。

圖2 標(biāo)記前后膠體金溶液吸光度變化

圖3 標(biāo)記后陰陽性標(biāo)本檢測

2.4 最佳硝酸纖維素(NC)膜的選擇 3種NC膜中，CN140的顯色速度最快，顯色背景最清晰，線性范圍最寬，R2最大且無非特異性反應(yīng)，故選取NC膜CN140為D-二聚體膠體金定量試紙條的最佳NC膜。見表2。

2.5 最適包被濃度的確定 包被濃度為 1.5 mg/ml時(shí)，試紙條的線性范圍最寬、R2最大，故選取1.5 mg/ml為D-二聚體膠體金定量試紙條檢測線的最佳包被濃度。見表3。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 10個(gè)濃度參考品的檢測信號(hào)值見表4。原始曲線見圖4。調(diào)整后的最終標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0.156 25～10 μg/ml，回歸方程Y=92.907X+307.88，R2=0.982 68，見圖5。

表1 5種標(biāo)記蛋白濃度線性檢測結(jié)果

2.7 試紙條性能評(píng)價(jià)

2.7.1 特異性評(píng)價(jià) 將濃度大于10 mg/ml的纖維蛋白溶液、濃度大于5.63 mmol/L的甘油三酯溶液及濃度大于343 μmol/L的膽紅素溶液滴加到試紙條的樣品墊上后，結(jié)果均為陰性，均無交叉反應(yīng)，說明該試紙條特異性強(qiáng)。見圖6。

表3 5種不同包被濃度檢測結(jié)果

表4 10個(gè)濃度參考品測定信號(hào)值A(chǔ)rea(mm·mV)

圖4 D-二聚體膠體金免疫層析法定量檢測原始曲線

圖5 D-二聚體膠體金免疫層析法定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

1：纖維蛋白； 2：甘油三酯；3：膽紅素。

2.7.2 精密性評(píng)價(jià) 批內(nèi)和批間精密性均達(dá)到了滿足批內(nèi)CV%<15%、批間CV%<15%的要求。見表5。

表5 D-二聚體試紙條精密性檢測結(jié)果

2.7.3 穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 本課題研制的D-二聚體試紙條在37 ℃條件下存放7 d，線性、特異性和精密性均在可接受范圍內(nèi)。見表6。

2.8 方法學(xué)對(duì)比 本課題建立的檢測方法與美國IL公司的ACL-TOP700檢測系統(tǒng)免疫比濁法相比，兩者相關(guān)性良好，回歸方程：Y=0.959 64X+0.026 45，R2=0.985 93。見圖7。

表6 37 ℃條件下穩(wěn)定性檢測結(jié)果

圖7 D-二聚體試紙條與免疫比濁法相關(guān)性比較

3 討論

3.1 金標(biāo)定量儀上3個(gè)參數(shù)的選擇 本課題使用的金標(biāo)定量儀中，可反映檢測線和質(zhì)控線信號(hào)強(qiáng)弱的有3個(gè)參數(shù)：Intensity、Height和Area。Intensity指曲線中峰的峰谷距離X軸的距離，與待測物質(zhì)的含量成負(fù)相關(guān)；Height指整個(gè)峰高的高度，與待測物質(zhì)含量成正相關(guān)；Area指整個(gè)峰所占的面積值，也與待測物質(zhì)含量成正相關(guān)。本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)用以比較這3個(gè)參數(shù)在反映線性方面的優(yōu)劣性及科學(xué)性。結(jié)果顯示，在3個(gè)參數(shù)中，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線都是以Area為參數(shù)時(shí)的線性最好(同等條件下線性范圍最寬，R2最大)，也最能反映信號(hào)強(qiáng)度的最大值，故本課題選取Area為縱軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 最佳檢測時(shí)間的確定 加樣完畢距離開始檢測的時(shí)間也是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。最佳的檢測時(shí)間最能反映質(zhì)控線和檢測線的最大信號(hào)值，因此需要實(shí)驗(yàn)探索本檢測方法的最佳檢測時(shí)間。本課題研究，運(yùn)用了兩種方法，檢測出了最佳檢測時(shí)間。具體方法如下：①用同一個(gè)試紙條加樣后將其放置于金標(biāo)定量儀相應(yīng)位置，5～20 min內(nèi)每間隔1 min檢測1次，將此16個(gè)信號(hào)值和時(shí)間做曲線，結(jié)果顯示信號(hào)值在加樣后的5～13 min內(nèi)已達(dá)到最大、最穩(wěn)定，隨后逐漸下降。②另取10個(gè)濃度室內(nèi)參考品和5組(每組10條)試紙條在金標(biāo)定量儀上檢測。分別在加樣后的3、5、10、13、15 min后檢測，計(jì)算并比較這5個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)的線性。結(jié)果顯示在加樣后5 min和10 min的線性最優(yōu)。由此說明，在加樣后5～10 min檢測最佳。為使所建立試劑盒實(shí)現(xiàn)快速測定，選擇在加樣后5 min測定。

3.3 線性范圍的確定 目前，業(yè)內(nèi)公認(rèn)為較權(quán)威的美國IL公司ACL-TOP700檢測系統(tǒng)免疫比濁法的參考區(qū)間0～243 ng/ml為D-二聚體的健康人群參考區(qū)間。本課題建立的檢測方法線性范圍的確定就是以此為依據(jù)，故線性范圍的最低值至少不能高于243 ng/ml。本課題建立的檢測方法的線性范圍的最低值為0.156 25 μg/ml，符合要求。

從結(jié)果分析看，D-二聚體定量檢測試紙的靈敏度、特異性、精密性、穩(wěn)定性和線性等指標(biāo)均滿足臨床要求，且與美國IL公司的ACL-TOP700檢測系統(tǒng)(免疫比濁法)相關(guān)系數(shù)R2=0.985 9，兩者相關(guān)性良好。此外，本課題建立的D-二聚體定量檢測方法的線性范圍比已有的研究[11-12]寬，且檢測速度更快(5 min)，這使臨床上可以及時(shí)、快速檢測出更寬濃度范圍的D-二聚體，為臨床提供更高的參考價(jià)值。

本研究初步建立了D-二聚體膠體金免疫層析定量檢測方法，為進(jìn)一步研制D-二聚體試劑盒奠定了基礎(chǔ)。然而，本課題僅對(duì)55份臨床樣本進(jìn)行了測定，如進(jìn)行新藥報(bào)批和臨床應(yīng)用，需進(jìn)行大量標(biāo)本的臨床實(shí)驗(yàn)研究。

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Establishment of the quantitative detection method of colloidal gold immunochromatography for D-Dimer

Cui Ning1， Ming Liang1， Wang Yunlong1,2， Liu Hongchun1， Wang Wanhai1， LI Yulin3， Wang Jichuang3

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China; 2.ZhengzhouVocationalandTechnicalCollege,Zhengzhou450121,China; 3.Henanbioengineeringtechnologyresearchcenter,Zhengzhou450001,China)

Objective To establish a quantitative detection method based on the principle of immune chromatography, which provides a new detection method for detecting D-Dimer that is fast,accurate,simple and convenient. Methods According to the principle of double antibody sandwich and immune chromatography in immunology, a quantitative detection of the colloidal gold test strip of D-Dimer was created. And standard curve on gold standard quantitative instrument have been established. Besides, the method was evaluated by the sensitivity, specificity, linearity, precision, stability and methodology comparison. Results The linear range was 0.156 25～10 μg/ml, and the regression equation wasY=92.907X+307.88,R2=0.982 68. The intra-group variation coefficients were 3.78% and 2.81%, and the inter-group variation coefficients were 4.95% and 4.07%. Otherwise, the test strip had no cross reactivity with fibrinogen and the stability. The test strips could be stored for 144 h at 37 ℃. The correlation between the method we have established and the immunoturbidimetry of IL company was good, and the regression equation wasY=0.959 64X+0.026 45,R2=0.985 93. Conclusion In this study, we have initially and successfully established the colloidal gold immune chromatography assay for the quantitative detection of D-Dimer. We provide a new technique and method for clinical detection of D-Dimer.

D-Dimer; colloidal gold immune chromatography; quantitative ness

王云龍，E-mail：biowyl@126.com。

R-331

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.02.001

2016-05-26)