蒼小鑫，趙小明，鐘潤濤，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕

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基于液滴微流控的殼寡糖植物免疫誘導劑熒光檢測

蒼小鑫1,2，趙小明2，鐘潤濤3，王文霞2，尹 恒2，朱靖博1，丁 燕1※

（1. 大連工業(yè)大學食品學院，大連 116034；2. 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023；3. 大連海事大學環(huán)境科學與工程學院，大連 116026）

為了建立基于液滴微流控芯片平臺的植物免疫誘導劑的熒光信號檢測技術，該文設計制作了具有液滴生成結構的芯片，制備包裹煙草（BY-2）細胞的液滴，并對包裹了細胞的液滴數(shù)目進行統(tǒng)計分析。將包裹細胞的液滴孵育一氧化氮探針后使用質量濃度為50g/mL殼寡糖處理，在熒光顯微鏡下觀測其產(chǎn)生的熒光，利用熒光酶標儀對比采用96孔板和液滴承載的細胞的熒光變化趨勢。結果顯示，水相流速為100L/h，油相流速為300L/h時，微流控芯片產(chǎn)生的液滴尺寸適合包裹細胞，其中液滴包裹單細胞的比例達22.9%。經(jīng)殼寡糖處理后的細胞在生成的液滴中產(chǎn)生了明顯的熒光，且用96孔板和液滴承載的細胞的熒光變化趨勢一致。研究結果為開發(fā)基于液滴微流控技術的植物免疫誘導劑的高通量篩選平臺提供參考。

微流控；包裹；熒光；植物免疫誘導劑；煙草細胞；殼寡糖

0 引 言

植物免疫誘導劑是通過激發(fā)植物自身的防衛(wèi)反應，進而達到控制植物病害效果的新型生物農(nóng)藥。國際上已經(jīng)應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)商品化的植物免疫誘導劑有烯并異噻唑、過敏蛋白、殼寡糖等[1]。植物免疫誘導劑不僅能夠激發(fā)農(nóng)作物的免疫抗病性，還可以誘導其抗寒、抗旱，增加產(chǎn)量并改善品質[2]。將植物免疫誘導劑與化學農(nóng)藥混用，可以顯著降低化學農(nóng)藥的施用量，并提高作物降解農(nóng)藥殘留的能力，對解決食品安全問題有重要作用。盡管現(xiàn)階段已成功研發(fā)了一些植物免疫調(diào)節(jié)劑，但農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中病害種類繁多，現(xiàn)有的植物免疫誘導劑產(chǎn)品種類不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復雜情況，生產(chǎn)上需要研發(fā)新的植物免疫誘導劑。但是，植物免疫誘導劑是通過激發(fā)植物自身的免疫反應發(fā)揮功能，其本身對病原菌沒有直接的殺菌作用，傳統(tǒng)的殺菌劑篩選方法不適合植物免疫誘導劑產(chǎn)品，因此亟需新的技術應用于植物免疫誘導劑的篩選。

對于植物免疫誘導劑活性篩選，國際上報道的很少，Cheong等[3]用大豆子葉法測定葡寡糖誘導劑的活性，該法被其他研究者應用測定其他誘導劑的活性，被認為是比較經(jīng)典的測定寡糖誘導劑活性的方法。但該方法比較煩瑣，費時間，測定結果的誤差比較大。隨著植物免疫機理研究的發(fā)展，對植物免疫誘導劑篩選技術研究逐漸開展。Franco等[4]以菜豆離體葉片組織胼胝質積累為指標，用多孔細胞培養(yǎng)皿法篩選不同分子量殼聚糖誘導活性，該法周期長，檢測繁瑣，不能高通量。Schreiber等[5]將擬南芥種在96孔板上，以植物病原丁香假單胞菌（）引起擬南芥白化癥狀為指標，篩選了200個可以激發(fā)擬南芥植物免疫活性的化合物，篩選到三種有活性的磺胺類物質，該法直觀、簡單，但周期長需要15～20 d，難于規(guī)模化。隨著分子生物學發(fā)展，McCann等[6]以6種病原細菌為材料，利用生物信息學方法，分析病原菌基因組保守性特征分子，推測病原菌存在的誘導劑，再接種鑒定，篩選到56個肽鏈植物免疫誘抗劑。該法需要了解病原菌基因組，主要是針對蛋白類誘導劑，存在很大局限性，難于作為篩選平臺。Noutoshi等[7]根據(jù)病原菌誘導劑誘導植物細胞程序性死亡和伊文思藍染色死細胞原理，以擬南芥懸浮細胞為材料，用96孔板法篩選具有植物免疫誘導劑活性化合物5個，該法接近高通量，但該法只檢測一個指標，不適合沒有誘導細胞死亡的誘導劑，容易造成漏篩。能否開發(fā)出操作相對簡單，成本相對低廉的高通量篩選系統(tǒng)成為植物免疫篩選領域的重要問題?；谖⒘?、高通量、大規(guī)模、平行性等特點，近年來迅速發(fā)展起來的微流控芯片（microfluidics）被認為是解決此問題的有力武器。

微流控技術是一種利用微流體力學，把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、培養(yǎng)、反應、分離、檢測等操作單元高度集成[8]，用以實現(xiàn)各種生物或化學試驗的技術，具有高通量、高靈敏度、低試劑量消耗、無交叉污染、反應速度快的優(yōu)點[9]。其中的液滴微流控技術以離散的微小液滴為流動主體，每一個形態(tài)穩(wěn)定的液滴均可視為獨立的微反應器，減少了交叉污染，且便于操控，因此是單細胞分析[10-13]，分子生物學[14]，藥物分選[15-16]，材料合成[17-22]、化學反應[23-26]等領域的理想選擇。利用液滴微流控技術的上述優(yōu)勢，將植物細胞包裹到含有熒光探針和待考察的植物激發(fā)子的液滴中，檢測并比較不同種類待考察的植物激發(fā)子誘導植物細胞產(chǎn)生NO和Ca2+等植物抗性相關信號分子的能力[27-30]，是一種新的實現(xiàn)植物免疫誘導劑高通量篩選的技術手段。

為研究利用液滴微流控芯片進行植物免疫誘導劑高通量篩選的可行性，本文考察了使用微流控芯片生成包裹煙草細胞所需要的流體力學參數(shù)，并對加載一氧化氮熒光探針和殼寡糖的煙草細胞液滴進行熒光檢測，為進一步研發(fā)基于液滴微流控的植物免疫誘導劑高通量篩選的技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KW-4A型勻膠機：美國Chemat公司；EH20A plus熱板：美國Lab Tech公司；URE-2000/35型紫外深度光刻機：中國科學院光電技術研究所；PDC-32G-2等離子體清洗器：美國Harrick公司；IX73熒光倒置顯微鏡：日本Olympus公司；Image-Pro Plus圖片處理軟件：美國Media Cybernetics公司；TJ-2A注射泵：保定蘭格恒流泵有限公司；Gemini EM熒光酶標儀：美國分子儀器公司；752N紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；CR21N離心機：日本日立公司。

液滴形成油：美國Biorad公司；Sylgard184聚二甲基硅氧烷（PDMS, polydimethylsiloxane）：美國Dow Corning公司；SU-8 3035光刻膠：美國Micro Chem公司；乳酸乙酯：天津市光復精細化工研究所；異丙醇：天津博迪化工有限公司；濃H2SO4、H2O2：天津市科密歐化學試劑有限公司；莧菜紅：上海Aladdin公司；三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷：美國sigma公司；FC-40油：美國Santa Cruz公司；KOH、KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4：均為國產(chǎn)分析級純；離析酶R-10、纖維素酶R-10：日本Yakult 公司； NO熒光探針（DAF-FM DA）：上海碧云天生物技術有限公司；殼寡糖由大連中科格萊克生物科技有限公司制備，脫乙酰度>95%，聚合度2～10；BY-2煙草細胞：中科院大連化物所天然產(chǎn)物與糖工程研究組提供。

1.2 聚二甲基硅氧烷（PDMS）液滴微流控芯片制備

芯片模板采用標準軟刻蝕工藝加工[31]。SU-8玻璃模板的制作：在H2SO4-H2O2中清洗過的70 mm×70 mm玻璃基片以第一轉速為500 r/min，10 s；第二轉速為960 r/min，30 s的速率旋涂SU-8 3035光刻膠，經(jīng)過加熱前烘后，利用曝光成像將掩膜上的圖案設計刻錄到光刻膠上，再將刻錄有圖案的光刻膠玻璃基片放在95 ℃的熱板上加熱烘烤，冷卻到25 ℃后，在乳酸乙酯中顯影，用異丙醇淋洗干凈，轉移至熱板180 ℃堅膜，冷卻至25 ℃；PDMS芯片澆注成型：將PDMS預聚液與固化劑按體積比10:1混合均勻，倒入SU-8模板，利用真空泵抽走小氣泡，80 ℃固化成型后揭下，切割、打孔，與涂有PDMS的載玻片在等離子腔內(nèi)照射，取出，迅速封接，隨后在80 ℃烘箱加固封接。

1.3 莧菜紅液滴的制備及液滴大小的測量

試驗采用流動共聚焦[32]的PDMS芯片形成油包水的液滴（芯片結構如圖1所示），油相為液滴形成油，水相為飽和的莧菜紅水溶液。使用注射泵調(diào)節(jié)流體的速率（油相流速分別為200、300、400L/h；水相流速為100L/h）。將水相流速固定為100L/h，油相流速為200L/h時，將生成的液滴收集并在顯微鏡下觀察，利用圖像處理軟件隨機拍攝10個視野，每個視野10個液滴，并測量這100個液滴的直徑，取平均值，得到該流速下液滴的大小，并計算誤差范圍。按照同樣的方法，獲得油相為300、400L/h時液滴的尺寸。

1.4 制備BY-2煙草細胞懸液

取處于對數(shù)生長期的懸浮培養(yǎng)的BY-2細胞100mL，用封口膜封住瓶口，置于25 ℃左右的黑暗條件下酶解去除細胞壁，酶為纖維素酶（10 000 u/g）和離析酶（3 000 u/g），酶解時間約3～5 h。一般在3～4 h后，用倒置顯微鏡進行觀察，待足量的原生質體游離下來以后即可繼續(xù)進行下面的操作。用槍將含有原生質體的酶液通過300目的鎳絲網(wǎng)，過濾到15 mL的離心管中，除去未被酶液消化的細胞。濾液用離心機離心，500 r/min，約3 min，使完整的原生質體沉淀用吸管除去酶液，添加洗滌液（0.6 mol/L甘露醇，3.5 mmol/L CaCl2，0.7 mmol/L KH2PO4，pH值為5.6），小心將原生質體懸浮，待懸浮液充分混勻后，再一次進行離心。使用0.33 mol/L蔗糖溶液（煙草細胞的等滲濃度）懸浮細胞。

1.5 制備包裹BY-2細胞的液滴

利用與BY-2煙草細胞等滲濃度的蔗糖溶液配置成不同光密度（OD, optical density）值的細胞懸浮液。油相為伯樂油，流速為300L/h；水相為細胞懸浮溶液，流速為100L/h。利用液滴生成芯片生成液滴。

1.6 單細胞包裹率的統(tǒng)計及分析

單細胞包裹率是指包裹單個細胞的液滴數(shù)目占液滴總數(shù)目的比例。在顯微鏡下觀察微液滴包裹細胞的情況。隨機選取視野，使每個視野中包含至少10個液滴，對這10個液滴的包裹情況進行統(tǒng)計分析。

1.7 一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）的孵育及殼寡糖的誘導

取對數(shù)生長期的BY-2懸浮細胞2 mL加入10 mL離心管中，然后加入1L 5mmol/L DAF-FM DA，25 ℃，120 r/min黑暗孵育1 h，將細胞沉淀，用200L移液槍吸除上清液，用新鮮細胞培養(yǎng)液清洗去除多余的探針三次，再加入8 mL新鮮的培養(yǎng)基，黑暗室溫120 r/min孵育30 min，然后將細胞混勻，加入6孔板中，每孔2 mL細胞懸液，用熒光顯微鏡觀測NO的產(chǎn)生情況（激發(fā)波長488 nm；發(fā)射波長510 nm），以50g/mL質量濃度殼寡糖處理孵育探針的細胞30 min后，用熒光顯微鏡觀察NO熒光產(chǎn)生情況。

1.8 制備包裹殼寡糖刺激后的細胞液滴

結合操作1.5和1.7，將一氧化氮探針孵育并受到殼寡糖預處理后的細胞微液滴在熒光顯微鏡下觀察，對觀察到的熒光強弱的差別給予評價。

1.9 液滴中與96孔板中細胞的熒光強度對比

結合1.7中所述的方法，孵育一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）的煙草細胞和液滴中的細胞置于黑色96孔板中，利用熒光酶標儀對其1 h內(nèi)的熒光強度變化進行測定并對比。

2 結果與分析

2.1 液滴生成芯片設計

本研究應用帶有通道匯流結構區(qū)域的微流控芯片以制備微液滴。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)的煙草細胞其直徑為60～240m，考慮到懸浮培養(yǎng)的煙草細胞易于成團生長，較大的微流控通道寬度不易造成通道阻塞，因此將芯片的通道寬度設定為350m；液滴生成區(qū)域的通道寬度設定為250m；通道加工深度為120m（如圖1所示）。油相注入到芯片后，細胞懸液被油相在十字型匯流縮口處被油相的剪切力夾斷，形成連續(xù)的液滴。

2.2 液滴生成芯片中油相流速的調(diào)節(jié)

對于通道寬度和高度已確定的芯片，可以通過調(diào)節(jié)油相和水相的流速來控制液滴的大小。以溶有莧菜紅染料的水相進行液滴生成模擬試驗，將莧菜紅水溶液流量固定為100L/h，調(diào)節(jié)油相流速，如表1所示，分別為400、300、200L/h，以考察不同流動相比例對生成液滴直徑尺寸的影響。液滴生成效果如圖2所示。通過圖2b和表1中的數(shù)據(jù)結合分析可以得出，當水相為100L/h，油相為300L/h時，生成的液滴大小及頻率最為穩(wěn)定，最適合BY-2煙草細胞的包裹。

表1 液滴大小與油相流量的關系

a. 莧菜紅液滴的生成過程

a. Formation of amaranth droplets

2.3 液滴中單細胞包裹率的統(tǒng)計及分析

利用酶解法去除懸浮培養(yǎng)的煙草細胞（100 mL）的細胞壁，然后用300目鎳絲網(wǎng)過濾，將得到的濾液在25 ℃，1 000r/min，5min條件下離心，細胞沉淀后用200L移液槍去除上清液，得到一定量沉淀的細胞后，用等滲濃度的蔗糖溶液進行稀釋，通過調(diào)控加入蔗糖溶液體積的方法將細胞配置成不同濃度的細胞懸液，并用紫外分光光度計測定其OD值。參考莧菜紅溶液試驗結果，將一定OD值的細胞懸液以100L/h，油相為300L/h的流速在微流控芯片中進行包裹。將生成的液滴在顯微鏡下觀測拍照，如圖3a、3b所示。并對每個視野內(nèi)的10個液滴的包裹進行計數(shù)，結果顯示，包裹了單細胞的液滴符合泊松分布，當細胞的OD值為1.375時，單細胞的包裹率為5.7%，空細胞為90.0%，兩個或兩個以上的包裹率為4.3%。當OD值為1.478時，將單個細胞包裹在直徑為300m，體積為84.78 nL的微液滴中（液滴可視為球體），單細胞的包裹率可達22.9%，空細胞的包裹率為70.0%，兩個或兩個以上細胞的包裹率為7.1%，結果如圖3c所示。

2.4 殼寡糖誘導煙草細胞中一氧化氮的產(chǎn)生及熒光檢測

將一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）孵育到BY-2煙草細胞中，并用50g/mL的殼寡糖水溶液進行誘導。前期的試驗已證明50g/mL的殼寡糖誘導煙草植株抗病效果較好[29]，可以顯著激發(fā)植物細胞產(chǎn)生一氧化氮等信號分子。因此，本研究對50g/mL的殼寡糖處理煙草細胞時一氧化氮的產(chǎn)生情況進行研究，考察細胞經(jīng)殼寡糖處理后產(chǎn)生熒光的情況。結果如圖4所示，殼寡糖預處理后的煙草細胞經(jīng)過一氧化氮探針的檢測，在顯微鏡下可以觀察到顯著的熒光。

c. 液滴中BY-2細胞的泊松分布圖

c. Poisson distribution of BY-2 cells in droplets

注：圖b紅色箭頭指向的是液滴中包裹到的煙草細胞

Note: Fig. b Red arrow point to BY-2 cell encapsulated in a droplet

圖3 空液滴和包裹細胞液滴的對比圖

Fig.3 Contrast figure of empty droplets and encapsulated cells in droplets

2.5 液滴中細胞熒光的檢測

將BY-2細胞懸液經(jīng)過一氧化氮探針孵育并使用50g/mL殼寡糖誘導后，包裹于微液滴中，在熒光顯微鏡下進行觀測，如圖5所示。未經(jīng)一氧化氮探針孵育和殼寡糖預處理的細胞沒有發(fā)射出熒光；經(jīng)過一氧化氮探針孵育而未經(jīng)殼寡糖預處理的細胞在激發(fā)光源的激發(fā)下，也沒有顯示出顯著的熒光；在經(jīng)一氧化氮探針孵育并接受殼寡糖預處理后的細胞，在激發(fā)光源的作用下，發(fā)射出明顯的熒光。結果顯示，微液滴包裹的細胞經(jīng)探針孵育并受到激發(fā)子的誘導作用后，其產(chǎn)生的一氧化氮與探針結合，在激發(fā)光源的作用下可以發(fā)射出明顯的熒光。

2.6 微液滴與96孔板中BY-2細胞受殼寡糖誘導后的熒光對比

將經(jīng)過50g/mL殼寡糖刺激后的BY-2細胞分別包裹在液滴中和置于黑色96孔板中，利用熒光酶標儀檢測各自熒光強度的變化趨勢。由圖6中可見，1 h內(nèi)兩者的熒光強度變化趨勢基本相符，由此可見在96孔板及液滴中BY-2細胞被殼寡糖誘導后產(chǎn)生的反應趨勢基本一致。此結果說明利用微液滴包裹細胞進行植物免疫誘導劑熒光篩選，與傳統(tǒng)的篩選方法相比具有相似表現(xiàn)效果。

3 討 論

Wang等[33]報道酵母細胞在液滴中包裹情況遵循泊松分布，即，其中代表的是每個液滴中細胞的平均個數(shù)，代表的是理想狀況下每個液滴中的細胞個數(shù)，因此當=1，=1時，即理想狀況下每個液滴中只包裹一個細胞的概率可以達到36.7%。而試驗中會因為實際包裹的物質不同而有所差別。植物細胞不同于微生物、微藻和動物細胞，它在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下，細胞是成團粘結在一起生長的，因此需要對細胞進行一系列的處理使其較為分散，得到一定濃度的懸浮液，才能利用通道芯片進行包裹。利用液滴微流控芯片對植物細胞的包裹以前并未見過報道，因此本文是第一次嘗試植物細胞的包裹并對其包裹概率進行探究，得到22.9%的植物細胞包裹率，此包裹率能夠滿足本試驗的需求，但同時也表明提高煙草細胞包裹率的方法是后續(xù)研究的重要內(nèi)容。

Zhao等[29]利用常規(guī)方法驗證了50g/mL的殼寡糖可以刺激煙草細胞產(chǎn)生免疫防御反應，從而證明了殼寡糖是一種有效的植物免疫誘導劑，可以預防煙草花葉病。本文利用液滴作為載體，利用液滴微流控芯片平臺驗證殼寡糖刺激煙草細胞發(fā)生應激反應，能夠使裝載一氧化氮熒光探針（DAF-FM DA）的BY-2細胞產(chǎn)生熒光。試驗中將液滴包裹的細胞和96孔板中細胞經(jīng)殼寡糖刺激后的熒光變化趨勢進行對比，證明96孔板和液滴微流控芯片在檢測具有一定的一致性。該試驗的側重點在于證明液滴微流控芯片平臺的可行性。對包裹不同細胞個數(shù)的液滴實現(xiàn)分離篩選以及對單細胞液滴熒光信號異質性分布還需進一步研究。

每一個液滴都是一個微小的環(huán)境，液滴內(nèi)的細胞可以和激發(fā)子快速均勻的混合，且能夠依次均勻的分布在孔板內(nèi)，而在96孔板的一個孔內(nèi)，以懸浮液存在的細胞會隨著時間延長而發(fā)生聚集的現(xiàn)象，使其在孔板內(nèi)分布不均勻，因此當熒光酶標儀的光束均勻透過孔板時，由于液滴分布均勻，檢測光束均勻照射孔中的細胞，而以細胞懸液形式存在的孔，因為細胞聚集成團，使檢測光束不能均勻完整的照射到所有細胞，因此液滴包裹的細胞的熒光會強于孔板內(nèi)只含有細胞的熒光強度，靈敏度更高。雖然存在檢測靈敏度的不同，但兩者的效應機制相同，所以熒光變化的趨勢一致。由此可見，液滴微流控芯片可以用來做殼寡糖植物免疫誘導劑熒光檢測試驗，且相比96孔板具有更高的靈敏度，是一個更有優(yōu)勢的實驗分析載體。

本試驗的目的是為了證明基于液滴微流控技術對植物免疫誘導劑高通量篩選具有可行性，在后續(xù)試驗中將制備集成液滴生成、孵育、篩選等多種功能模塊一體的芯片，同時結合NO、Ca2+等熒光探針，依靠熒光信號的反饋，最終實現(xiàn)高通量的液滴分選，為基于液滴微流控芯片技術的糖鏈植物免疫誘導劑高通量篩選平臺的研制提供參考。

4 結 論

1）基于液滴微流控技術，將單個細胞包裹在直徑為300m，體積為84.78 nL的微液滴中（液滴可視為球體），包裹率可達22.9%，并符合泊松分布。

2）將一氧化氮熒光探針孵育到BY-2煙草細胞中，并用50g/mL質量濃度的殼寡糖水溶液進行誘導。結果顯示在激發(fā)光源的作用下，液滴中的細胞發(fā)射出明顯的熒光。將液滴受殼寡糖誘導的細胞和96孔板中受相同處理的細胞熒光對比，發(fā)現(xiàn)微液滴中的BY-2細胞其熒光變化趨勢與96孔板中的細胞熒光變化趨勢相同，說明微液滴包裹植物細胞在熒光檢測的角度與傳統(tǒng)的孔板檢測結果具有一致性，且具有較高靈敏度。

本研究將植物細胞與液滴微流控芯片技術相結合，為單個植物細胞的分析研究提供了新的平臺，為基于液滴微流控芯片技術的糖鏈植物免疫誘導劑高通量篩選平臺的研制提供了參考。

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Fluorescence detection of chitosan oligosaccharides plant immune elicitors based on droplets-microfluidics

Cang Xiaoxin1,2, Zhao Xiaoming2, Zhong Runtao3, Wang Wenxia2, Yin Heng2, Zhu Jingbo1, Ding Yan1※

(1.,,116034,;2.,,116023,;3.,,116026,)

The plant immune elicitors can induce a line of defense responses in plants and are identifed as new type of biological pesticides. At present stage, new plant immune elicitor is screening with potted plants or field experiments, which is time-consuming and high-cost. The droplet microfluidic technology, which is originated from analytical chemistry and owns micro-channel network structure, has properties of high throughput, high sensitivity, low consumption of reagent, no cross contamination and rapid reaction. These advantages provide a novel platform for screening plant immune elicitors. Chitosan oligosaccharides (COS) are obtained by degradation of chitosan. It was reported that COS could activate plant innate immunity, such as: stimulate H2O2(hydrogen peroxide)production, induce defense response by NO (nitric oxide) pathway, make a synthesis of phytoalexin, impact the jasmonic acid / ethylene (JA/ET) signaling marker, trigger defense-related gene expression, cause changes in protein phosphorylation, activate mitogen-activated protein kinases (MAPKs), and possess antimicrobial activity against bacteria and fungi in plant. Because of the advantages and the high solubility, nontoxicity, and biocompatibility, COS are considered as an effective plant immune elicitor by researchers. To preliminarily applying droplet microfluidic technology in plant immune elicitor screening, integrated microfluidic chip with droplets formation structure was designed and fabricated. COS were chosen as positive reagent, and BY-2 tobacco cells played as model plant cell. The flow rate of mobile phase was measured and established for BY-2 tobacco cells droplets formation, and the single cell encapsulating efficiency was calculated. Then COS and NO probe were dumped into the droplets with BY-2 tobacco cells, and the fluorescence intensity of NO probe from droplets was detected to evaluate the feasibility of screening the plant immune elicitor COS. To make the comparative analysis, the fluorescence intensity was compared with the same reaction system in 96-well plate. The results showed that at the flow rates of 100L/h in cell suspension and 300L/h in oil, the sizes of generated droplets were suitable to encapsulate the cells. The BY-2 cell clusters could be dispersed in isotonic solution, and every droplet encapsulated single cell. The ratio of droplets encapsulating single cell was about 22.9%. The ratio conformed to Poisson distribution. The fluorescence intensity of droplets incubated with COS was detected by fluorescence microscope. The fluorescence intensity from the COS/NO probe/BY-2 cell group was significantly higher than the control groups. In the comparative analysis experiments, the fluorescence intensity of droplets showed similar trend compared with the same reaction system in 96-well plate. This result implied that the cell treated with COS in droplets showed similar trend in defense responses compared to traditional screening method with 96-well plate. Thus, the droplets with COS / NO probe / BY-2 cell show high fluorescence intensity that can be detected by fluorescence microscope, which implies that integrated with fluorescence detecting technique, droplets microfluidics and fluorescence probe can be a novel platform for screening plant immune elicitors.

microfluidic; encapsulation; fluorescence; plant immune elicitors; BY-2 tobacco cell; chitosan oligosaccharide

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042

S4

A

1002-6819(2017)-02-0302-06

2016-07-21

2016-11-18

國家自然科學基金（31370391）；中科院STS計劃（KFJ-SW-STS-143）；大連市人才項目（2016RQ064）；遼寧省教育廳項目（2016J008）

蒼小鑫，女（滿族），黑龍江雙城人，主要從事植物免疫誘導劑方向的研究。大連 大連工業(yè)大學食品學院，116034。Email：iceycang@foxmail.com

丁 燕，女，吉林白山人，博士，主要從事天然產(chǎn)物方向的研究。大連 大連工業(yè)大學，116034。Email：dingyan_515@hotmail.com

蒼小鑫，趙小明，鐘潤濤，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕. 基于液滴微流控的殼寡糖植物免疫誘導劑熒光檢測[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2017，33(2)：302－307. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042 http://www.tcsae.org

Cang Xiaoxin, Zhao Xiaoming, Zhong Runtao, Wang Wenxia, Yin Heng, Zhu Jingbo, Ding Yan. Fluorescence detection of chitosan oligosaccharides plant immune elicitors based on droplets-microfluidics[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(2): 302－307. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.02.042 http://www.tcsae.org