張 鋒，高 孟，高麗美，羅永能

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒病研究所，杭州 310013)

柯薩奇病毒A16型感染性模型的建立及其相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)和應(yīng)用的評(píng)價(jià)

張 鋒，高 孟，高麗美，羅永能*

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒病研究所，杭州 310013)

目的 建立簡(jiǎn)便和可靠的對(duì)柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CVA16)敏感的小型嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。方法 選取不同日齡長(zhǎng)爪沙鼠，腹腔接種CVA16后連續(xù)觀察14 d，篩選出對(duì)病毒敏感的最適接種日齡段；然后比較接種劑量與效應(yīng)關(guān)系，測(cè)定其50%致死劑量(LD50)；并測(cè)定感染3 d后其血液和主要組織器官中CVA16病毒滴度；最后用CVA16滅活疫苗在1日齡和11日齡免疫2針沙鼠后，在14日齡時(shí)用LD50劑量病毒攻毒，觀察并記錄沙鼠體重、癥狀及死亡率，2周后眼球采血，應(yīng)用微量中和試驗(yàn)和ELISA分別檢測(cè)中和抗體效價(jià)和總抗體水平。結(jié)果 長(zhǎng)爪沙鼠感染CVA16后出現(xiàn)活動(dòng)減少、后肢無力、麻痹癱瘓、死亡等臨床癥狀，不同日齡沙鼠對(duì)CVA16感染的易感能力和感染后發(fā)病程度不同，7日齡和14日齡沙鼠易感，28日齡沙鼠不易感染，最敏感和最合適接種日齡為14日齡，其LD50為1×104.5 CCID50，感染3 d后其血液和主要組織器官中均可檢測(cè)到高滴度的CVA16病毒，免疫兩針滅活疫苗的14日齡沙鼠用LD50劑量攻毒，存活率87.5%，疫苗免疫誘導(dǎo)沙鼠產(chǎn)生的CVA16中和抗體幾何平均值(GMT)為28.14，抗體陽性率為87.5%。 結(jié)論 長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)CVA16敏感并且病毒能在其體內(nèi)進(jìn)行有效的復(fù)制和繁殖，可作為CVA16致病機(jī)制研究、疫苗研發(fā)及藥物評(píng)價(jià)的可靠小動(dòng)物模型。

柯薩奇病毒A16型；長(zhǎng)爪沙鼠；動(dòng)物模型

柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CVA16)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是引起手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一[1]。手足口病是一種全球性的傳染病，世界各地均有不同程度的流行。尤其在亞太地區(qū)，近年來疫情呈不斷上升的趨勢(shì)[2]。由于手足口病另一主要致病原腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)自2008年后在大陸及亞太地區(qū)多次大規(guī)模暴發(fā)流行已在易感人群中建立了一定程度的免疫屏障，近幾年CVA16等其它腸道病毒感染引發(fā)的病例已呈大幅上升趨勢(shì)，國內(nèi)少數(shù)省份已有暴發(fā)流行并報(bào)告死亡病例[3]。國內(nèi)外監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)也表明CVA16引起的HFMD有逐年增加趨勢(shì)，每隔一定時(shí)間就出現(xiàn)一次高峰[3]。

手足口病至今尚無高效、特異的藥物，對(duì)癥和支持治療是主要的措施。研發(fā)疫苗對(duì)全面有效地預(yù)防控制手足口病的暴發(fā)流行有重大意義，最近我國已完成EV71滅活疫苗的臨床試驗(yàn)[4]并批準(zhǔn)上市。相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立和使用是上述疫苗研制過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)之一，目前國內(nèi)外研究CVA16主要是使用小于7日齡的小鼠乳鼠，我們先前的實(shí)驗(yàn)和他人報(bào)道均發(fā)現(xiàn)超過7日齡的小鼠乳鼠就不能感染[5,6]。然而這種小鼠乳鼠模型由于免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟等原因，在實(shí)際使用上有很大限制。因此，我們借鑒Yao等[7]建立腸道病毒71型感染長(zhǎng)爪沙鼠模型的成功經(jīng)驗(yàn)，使用CVA16 YY157株感染清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠，以期建立比小鼠乳鼠模型更加簡(jiǎn)便和可依賴的對(duì)CVA16敏感的小型嚙齒類動(dòng)物模型，用于CVA16的發(fā)病機(jī)制、疫苗研發(fā)和抗CVA16藥物評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和病毒

Vero細(xì)胞來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(american type culture collection，ATCC)；CVA16病毒YY157株由本研究所保存[8-10]。用Vero細(xì)胞培養(yǎng)繁殖CVA16 YY157株，并用微量細(xì)胞病變法測(cè)定病毒的感染性滴度。病毒上清反復(fù)凍融3次后，低溫離心(5000 r/min,離心力3900 g,20 min)取上清，0.2 μm濾膜過濾后，-80℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(浙)2014-0001]提供，1日齡，8只，體重3～3.5 g；7日齡，16只，體重6～7 g；14日齡，68只，體重10～11 g；21日齡，16只，體重15～17 g；28日齡，16只，體重20～22 g，動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(浙)2011-0166]。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選取7、14、21和28日齡清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠(各日齡8只)，各組腹腔內(nèi)分接種病毒量1×105細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(CCID50)/只，每日觀察并記錄沙鼠的臨床癥狀和存活/死亡情況，連續(xù)觀察14 d，篩選出對(duì)CVA16病毒最敏感和最合適的沙鼠日齡段。取適齡的沙鼠48只，隨機(jī)分成6組(每組8只)，各組腹腔內(nèi)分別接種CVA16(1×102、1×103、1×104和1×105CCID50/只)和對(duì)照MEM液，每日觀察并記錄沙鼠的癥狀和存活/死亡情況，連續(xù)觀察14 d，最后用Reed-Muench法計(jì)算出CVA16對(duì)沙鼠的LD50劑量, 并以此為基數(shù)確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需接種的適宜劑量。

1.3.2 臨床癥狀判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)臨床表現(xiàn)劃分5個(gè)等級(jí)：0.正常；1.毛發(fā)豎起、體重下降和行動(dòng)不便；2.后肢無力；3.單肢麻痹；4.雙肢麻痹；5.死亡。

1.3.3 感染沙鼠的血液和主要組織器官中CVA16病毒滴度測(cè)定

選擇14日齡長(zhǎng)爪沙鼠3只，腹腔內(nèi)注射接種LD50劑量(即1×104.5 CCID50)的CVA16，感染3 d后分別取血液、后肢肌肉、心臟、肝臟、肺、腦和腸道等7個(gè)組織，稱重(除血液外)后加入10倍(體積重量比)的PBS，超聲至勻漿后離心，取各上清液用MEM培養(yǎng)液作10倍梯度稀釋至10-1～10-8，分別接種于Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿單層96孔板中，置5%CO2培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7 d后，用顯微鏡觀察CPE產(chǎn)生與否，用Reed-Muench法計(jì)算血液和上述各組織提取上清液的CVA16滴度。

1.3.4 CVA16滅活疫苗制備

病毒收獲液經(jīng)離心澄清，按1∶4000的比例加入福爾馬林，37℃滅活3 d；超濾濃縮后，采用Sephacryl S-400 HR凝膠過濾層析和Source 30Q離子交換層析2步層析法純化CVA16，進(jìn)行各項(xiàng)檢定及分析合格后，再除菌過濾，2～8℃保存，用時(shí)加入鋁佐劑，稀釋成蛋白含量10 μg/100 μL的劑量。

1.3.5 CVA16滅活疫苗對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的免疫保護(hù)

新生1日齡的沙鼠腹腔內(nèi)接種CVA16滅活疫苗(蛋白含量10 μg/100 μL只)，10 d后加強(qiáng)免疫一次。等沙鼠14日齡時(shí)，用LD50病毒劑量進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄沙鼠體重、癥狀及死亡率，2周后眼球采血，用ELISA檢測(cè)血清中抗CVA16特異性抗體水平和體外微量中和試驗(yàn)檢測(cè)其抗血清中和CVA16的能力，評(píng)價(jià)CAV16滅活疫苗的免疫原性。

1.3.6 體外微量中和試驗(yàn)檢測(cè)中和抗體滴度

將沙鼠摘眼球采血，血清采用經(jīng)典體外微量中和試驗(yàn)檢測(cè)中和抗體效價(jià)。將免疫血清自1∶8開始進(jìn)行2倍系列稀釋后，分別與100 CCID50 CVA16等體積混合，接種于Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿單層96孔板中，置5%CO2培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7 d后，用顯微鏡觀察CPE，以能抑制50%細(xì)胞病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和抗體效價(jià)，每次試驗(yàn)均設(shè)細(xì)胞、病毒對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果以中和效價(jià)≥1∶8判為CVA16中和抗體陽性。

1.3.7 ELISA檢測(cè)血清中CVA16特異性抗體水平

將沙鼠血清用1%BSA液稀釋100倍后加入包被CVA16抗原的反應(yīng)孔，100 μL/孔，同時(shí)利用BSA和陰性血清設(shè)立空白對(duì)照和陰性對(duì)照，37℃孵育1 h后洗滌5次；將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 進(jìn)行1∶10000稀釋后加入反應(yīng)孔，100 μL/孔，37℃孵育30 min后洗滌5次；每孔加入100 μL OPD顯色液，37℃避光反應(yīng)15 min后加入50 μL 2 M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的吸光度值。以陰性對(duì)照孔的平均吸光度值的2.1倍為閾值判定陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism5軟件分析處理數(shù)據(jù)，組間比較采用獨(dú)立樣本Bonferroni′s Multiple Comparison Test，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CVA16病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠的敏感性試驗(yàn)

長(zhǎng)爪沙鼠感染CVA16后可出現(xiàn)活動(dòng)減少、后肢無力、麻痹癱瘓、死亡等臨床癥狀(圖1)。不同日齡長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)CVA16 感染的敏感性不同并存在明顯差異。7日齡長(zhǎng)爪沙鼠在攻毒后第3天出現(xiàn)癥狀，第8天全部死亡，存活率為0；14日齡長(zhǎng)爪沙鼠在攻毒后第4天出現(xiàn)臨床癥狀，第9天全部死亡，存活率為0；21日齡長(zhǎng)爪沙鼠也在攻毒后第4天出現(xiàn)癥狀，但臨床癥狀比7日齡和14日齡鼠輕，第7天有部分感染沙鼠死亡，第8天感染沙鼠癥狀開始減輕，存活率為62.5%；28日齡長(zhǎng)爪沙鼠在攻毒后第4天出現(xiàn)輕微臨床癥狀(毛發(fā)豎起，輕微肌無力)，第9天起逐步恢復(fù)正常，存活率為100%(圖2)。7日齡和14日齡沙鼠對(duì)CVA16 感染的敏感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，21日齡和28日齡沙鼠感染CVA16也會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀或死亡，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。按照長(zhǎng)爪沙鼠日齡、臨床評(píng)分和存活率，確定14日齡長(zhǎng)爪沙鼠為CVA16病毒感染最合適的對(duì)象，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

注：(A)正常；(B)病變。圖1 14日齡長(zhǎng)爪沙鼠感染CVA16出現(xiàn)后肢麻痹 Note.(A)normal.(B)paralysis.Fig.1 Hindlimb paralysis caused by CVA16 infection in 14-day-old Mongolian gerbils

注：組間比較，*P < 0.05。圖2 CVA16感染長(zhǎng)爪沙鼠的敏感性試驗(yàn)(n=8)Note. Compared with multiple groups，*P < 0.05.Fig.2 Sensitivity test of CVA16 infection in Mongolian gerbils

2.2 CVA16病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠的劑量與效應(yīng)關(guān)系

14日齡長(zhǎng)爪沙鼠注射不同劑量病毒，表現(xiàn)的癥狀與劑量成正相關(guān)性(P< 0.0001)。用1×105CCID50病毒量攻毒，第3天出現(xiàn)臨床癥狀，在注射第8～9天全部死亡，存活率為0。隨著病毒量減少，出現(xiàn)癥狀減輕，存活率提高，1×104CCID50病毒量，平均臨床評(píng)分2.54，存活率62.5%；1×103CCID50病毒量，平均臨床評(píng)分1.44，存活率75%；1×102CCID50病毒量，平均臨床評(píng)分0.88，存活率87.5%。1×105和1×104CCID50病毒量與對(duì)照MEM液組比較有明顯差異(P< 0.05)。最后用Reed-Muench法計(jì)算出CVA16對(duì)沙鼠的LD50劑量為1×104.5 CCID50病毒量，結(jié)果見圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05。 圖3 CVA16感染沙鼠的劑量與效應(yīng)關(guān)系(n=8) Note.Compared with control group，*P < 0.05.Fig.3 Dose-dependent consequence of CVA16 infection in Mongolian gerbils

2.3 感染沙鼠的血液和主要組織器官中CVA16病毒的復(fù)制繁殖

根據(jù)對(duì)14日齡長(zhǎng)爪沙鼠感染3 d后的血液和所選擇主要組織器官提取上清液中CVA16病毒滴度的測(cè)定結(jié)果(圖4)，CVA16病毒均有存在，在后肢肌肉和腦組織中滴度最高(達(dá)6×105CCID50)，表明CVA16確實(shí)感染了長(zhǎng)爪沙鼠并在其體內(nèi)進(jìn)行了有效的復(fù)制和繁殖。

圖4 CAV16感染14日齡長(zhǎng)爪沙鼠3 d后血液和主要組織中的病毒滴度Fig.4 Virus titers in various tissues of CVA16-infected Mongolian gerbils 3 days post-infection

2.4 CVA16滅活疫苗對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的免疫保護(hù)作用

免疫兩針CVA16滅活疫苗的14日齡沙鼠用LD50劑量攻毒，注射第5天有2只出 現(xiàn)臨床癥狀，一只癥狀較輕，另一只第7天死亡，存活率87.5%。疫苗免疫誘導(dǎo)沙鼠產(chǎn)生的CVA16中和抗體幾何平均滴度(GMT)為28.14，特異性抗體陽性率為87.5%，而且中和抗體效價(jià)高低與ELISA測(cè)定的總抗體OD值完全對(duì)應(yīng)，呈現(xiàn)正相關(guān)性(表1)。上述結(jié)果表明CVA16滅活疫苗對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠有顯著的免疫保護(hù)效果。

表1 CVA16滅活疫苗對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的免疫原性

注： GMT為28.14；中和抗體效價(jià)≥l：8判斷為抗體陽性；以陰性對(duì)照2.1倍為閾值判定陽性，cutoff值0.201。

Note. GMT to 28.14.Neutralizing antibody titer ≥1∶8 judged to be antibody positive. To 2.1 times the negative control positive determination, cutoff values for 0.201.

3 討論

柯薩奇病毒A16型是引起手足口病的主要病原體之一，近年來越來越多報(bào)道顯示CVA16除引起輕癥外，亦可導(dǎo)致心肌、心包、腦部和肺部等疾病，甚至引發(fā)致死性心肌炎、腦干腦炎和肺炎等致死性癥狀[1]，研發(fā)相應(yīng)疫苗對(duì)全面有效地預(yù)防控制手足口病的暴發(fā)流行有重大意義。動(dòng)物模型是疫苗臨床前研究階段評(píng)價(jià)保護(hù)效果等關(guān)鍵指標(biāo)的重要工具，直接影響疫苗評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。目前常用的動(dòng)物模型主要是小鼠乳鼠模型和猴體模型，小鼠乳鼠是相對(duì)敏感和常用的小動(dòng)物感染模型，但由于其感染年齡過低，感染周期短，限制了其在疫苗免疫效果評(píng)價(jià)和藥物篩選中的應(yīng)用；而最為接近人類的猴體動(dòng)物模型的研究雖然已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但由于存在動(dòng)物來源困難、飼養(yǎng)環(huán)境要求高、運(yùn)輸條件苛刻、試驗(yàn)費(fèi)用高等客觀原因，極大地限制了該模型的應(yīng)用和發(fā)展。因此，開發(fā)建立新的手足口病小動(dòng)物模型具有實(shí)際意義[7]。

長(zhǎng)爪沙鼠屬于嚙齒目、沙鼠屬動(dòng)物,1935年由日本人開始馴化和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，60年代開始作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。其對(duì)流行性出血熱病毒、幽門螺旋桿菌、寄生蟲等多種病原體易感，相比于其他嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，長(zhǎng)爪沙鼠受感染可表現(xiàn)出與人類更相似的病理學(xué)特征和臨床癥狀，因此長(zhǎng)爪沙鼠作為具有獨(dú)特生物學(xué)特性的“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已廣泛用于疫苗研制和病原感染等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[11-13]。Yao等[7]用一株臨床分離的EV71病毒感染長(zhǎng)爪沙鼠，發(fā)現(xiàn)7到28日齡沙鼠感染后展現(xiàn)后肢麻痹、行動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)失調(diào)和昏睡倦怠等癥狀并最終致死,另伴有嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)病變，28至49日齡沙鼠對(duì)EV71敏感度逐漸降低，而49日齡以上沙鼠感染EV71后沒有表觀癥狀但多數(shù)產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體。同時(shí)，他們對(duì)新生沙鼠腹腔內(nèi)接種EV71滅活疫苗(20 mg/只)并在一周后加強(qiáng)免疫一次，再隔2周后即21日齡時(shí)，用致死劑量(100倍LD50)EV71病毒進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)接種EV71滅活疫苗對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠具有完全的免疫保護(hù)效果[7]。

CVA16病毒YY157株臨床分離后未經(jīng)小鼠活體馴化傳代，前期工作中我們已測(cè)定了其基因組核酸全序列(GenBank序列號(hào)KC507895)、探索了其在Vero等[8，9]細(xì)胞中培養(yǎng)與增殖特性并確定了衣殼蛋白VP1～VP3的B淋巴細(xì)胞線性抗原表位[10]。我們將經(jīng)過體外細(xì)胞培養(yǎng)繁殖并收獲的CVA16 YY157株病毒通過腹腔注射感染長(zhǎng)爪沙鼠，后者出現(xiàn)活動(dòng)減少、后肢無力、麻痹癱瘓、死亡等臨床癥狀,對(duì)CAV16感染的敏感性與沙鼠日齡相關(guān)即鼠齡越小越敏感；在劑量與效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示癥狀和死亡率與劑量成正相關(guān)性，其LD50量與小鼠乳鼠模型接近[5]。先前在成功建立EV71 H3-TY株感染小鼠乳鼠模型基礎(chǔ)上，我們也曾嘗試建立CAV16 YY157株感染小鼠乳鼠模型，發(fā)現(xiàn)5日齡以下乳鼠才能被有效感染并展示類似的表型癥狀和劑量與效應(yīng)關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中感染CVA16使用的是7日齡以上長(zhǎng)爪沙鼠，并通過腹腔注射途徑，不同于小鼠乳鼠模型的顱內(nèi)注射，不會(huì)直接破壞神經(jīng)系統(tǒng)，更能客觀反映病毒感染特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示應(yīng)該比小鼠乳鼠模型具有更大實(shí)用價(jià)值。

在疫苗研發(fā)中，疫苗免疫原性和保護(hù)效果評(píng)價(jià)是疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。與小鼠乳鼠模型(通過免疫懷孕母鼠，對(duì)其所產(chǎn)新生乳鼠攻毒)相比,長(zhǎng)爪沙鼠模型避免了前者通過母?jìng)骺贵w間接評(píng)價(jià)疫苗模式帶來的相關(guān)問題，同時(shí)也降低了由于小鼠乳鼠日齡過小給實(shí)驗(yàn)帶來的不確定性，更能真實(shí)反映疫苗免疫保護(hù)效果。本文前述的CVA16滅活疫苗對(duì)的長(zhǎng)爪沙鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中有2只在攻毒后第5天出現(xiàn)臨床癥狀，其中1只在攻毒后第7天死亡，導(dǎo)致存活或免疫保護(hù)率不是100%，很可能與免疫劑量低(10 mg/100 mL/只)和個(gè)體差異導(dǎo)致的中和抗體滴度不高有關(guān)。但CVA16感染長(zhǎng)爪沙鼠引發(fā)的癥狀及其滅活疫苗的免疫保護(hù)作用均和EV71高度類似[7]。下一步我們將通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子水平等狀況。

總之，本實(shí)驗(yàn)利用浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心馴養(yǎng)的Z:ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠建立了簡(jiǎn)便和可靠的對(duì)CAV16敏感的又一小型動(dòng)物模型，其進(jìn)一步優(yōu)化、完善了CVA16的現(xiàn)有動(dòng)物模型，可用于CVA16病毒致病機(jī)制、感染特點(diǎn)的研究和其相關(guān)疫苗及藥物效果的評(píng)價(jià)。

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Establishment of an animal model for coxsackievirus A16 infection related immunological evaluation

ZHANG Feng, GAO Meng, GAO Li-mei, LUO Yong-neng*

(Institute of Viral Diseases, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013,China)

Objective To establish a simple and reliable experimental rodent model sensitive to coxsackievirus A16 (CVA16).Methods Mongolian gerbils with different age were selected and inoculated intraperitoneally with live CVA16, and the gerbils were observed daily until 14 days postinoculation to screen for the most optimal ages sensitive to the virus. The dose-dependent symptoms were evaluated and the 50% lethal dose (LD50) was determined. The virus titers were measured in blood and various tissues of CVA16-infected Mongolian gerbils 3 days post-infecton. Finally, the gerbils were immunized twice with inactivated CVA16 vaccine at day 1 and day 11, respectively, followed by challenge with the virus with a dose of LD50 at day 14. The gerbils were then observed for another 2 weeks to record their body weight, symptom and mortality rate. Their blood samples were collected from the eyes, and CVA16-specific neutralizing antibody titers and total antibody titers was checked by microneutralization test and ELISA, respectively. Results Various clinical symptoms, such as inactivity, hind limb weakness, paralysis and even death occurred in gerbils following CAV16 infection. 7-day-old and 14-day-old gerbils are susceptible to CVA16 infection whereas 28-day-old gerbils are resistant. The most sensitive and appropriate age is 14-day-old. The 50% lethal dose was determined to be 1×104.5 CCID50. High titers of the virus were confirmed in blood and various tissues of Mongolian gerbils contracted CAV16 3 days post-infecton. The survival rate is 87.5% for 14-day-old gerbils preimmunized with two doses of inactivated CVA16 vaccine and challenged with the virus. The geometric mean titers (GMTs) of neutralizing antibody was 28.14, and the seroprevalence was 87.5%. Conclusions Mongolian gerbils is sensitive to CVA16 and the virus reproduces actively in Vivo. Thus, it can be used as a reliable small animal model for studies of CVA16 pathogenesis, vaccine development and drug evaluation.

Coxsackievirus A16; Mongolian gerbils; Animal model

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014C37014,2016C37102)。

張鋒(1974-)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：從事醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究。E-mail：13957185700@163.com

羅永能(1966-)，男，博士，研究員，研究方向：從事醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究。E-mail：ynl101@163.com

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0037-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.008

2016-07-04