白明生??+石新衛(wèi)??+張艷新??

摘要：對四合木1株內(nèi)生真菌四合木鏈格孢進(jìn)行液體發(fā)酵，提取發(fā)酵液和菌絲體代謝產(chǎn)物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，通過抑菌試驗檢測各萃取相抑制植物病原菌活性。結(jié)果表明，發(fā)酵液和菌絲體代謝產(chǎn)物均具有抑制植物病原菌活性，其中發(fā)酵液中乙酸乙酯相和正丁醇相抑菌效果最明顯。菌絲體各萃取相抑菌活性弱于發(fā)酵液，其中乙酸乙酯相抑菌效果最明顯，說明發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物主要存在于乙酸乙酯相和正丁醇相中，菌絲體中活性代謝產(chǎn)物主要存在于乙酸乙酯相中，研究結(jié)果為進(jìn)一步分離抗植物病原菌活性成分和保護(hù)四合木這一瀕危珍稀植物提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：四合木；四合木鏈格孢；發(fā)酵產(chǎn)物；抗植物病原菌活性

中圖分類號： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0192-03

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指在健康植物寄主的各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌。幾乎所有植物內(nèi)部都存在內(nèi)生真菌。植物內(nèi)生真菌的種、屬多樣性極為豐富，是一種新興的微生物資源，它對植物某些活性成分的形成有重要影響[1]。近年來，植物內(nèi)生真菌本身及其次生代謝產(chǎn)物應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)方面的研究逐漸成為熱點(diǎn)。這些內(nèi)生菌在植物體內(nèi)能產(chǎn)生多種生物學(xué)作用，可以提供植物所需要的營養(yǎng)物，參與植物的防衛(wèi)功能，能夠促進(jìn)植物快速生長，增強(qiáng)植物抗逆境、抗病害、抗動物危害的能力[2]。

四合木（Tetraena mongolica Maxim.），蒺藜科，落葉小灌木，是中國特有孑遺單種屬植物，草原化荒漠的群種之一，為強(qiáng)旱生植物，是最具代表性的古老殘遺瀕危珍稀植物，被譽(yù)為植物的“活化石”和植物中的“大熊貓”。其分布范圍非常狹窄，屬國家二級保護(hù)植物[3]。四合木是一種具有抗生性的植物，病蟲害發(fā)生較少，可能含有某種特殊的次生代謝產(chǎn)物。高雯芳等研究了四合木提取物對14 種植物病原菌的生物活性，結(jié)果表明，四合木提取物在100 g/L 濃度下對部分病菌的生長表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用[4]。植物內(nèi)生真菌通常會產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的生理活性物質(zhì)[2，5]。本研究對1株分離自四合木的內(nèi)生真菌四合木鏈格孢[6]進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究其代謝產(chǎn)物對多種植物真菌病害病原菌的抑制作用，以便為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用和保護(hù)四合木這一瀕危珍稀植物提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株及來源菌株四合木鏈格孢分離自寧夏石嘴山采集的四合木莖中，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定法確定為鏈格孢屬一新種[6]（編號PSN AAFS356608），由寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物病害標(biāo)本室提供。

供試病原菌：由寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究室提供，斜面保藏于4 ℃冰箱中，備用。

1.1.2培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基選用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然，121 ℃、30 min 滅菌。

液體培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖 20 g，常水1 000 mL，pH自然，121 ℃、30 min滅菌。

1.2試驗方法

1.2.1菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)母種先接種于PDA斜面上，后轉(zhuǎn)接于PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，用打孔器打孔接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)液（PDA培養(yǎng)基）的250 mL三角燒瓶，靜置2 d，于25 ℃、120 r/min旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)3 d作為種子，以10%量接種于裝有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)液）的500 mL三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)5 d，終止發(fā)酵。

1.2.2發(fā)酵液的萃取將發(fā)酵菌液經(jīng)4層紗布過濾，得菌絲體和發(fā)酵液。發(fā)酵液濃縮后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，萃取液進(jìn)行減壓濃縮得各萃取物的浸膏。

1.2.3菌絲體的提取及萃取將菌絲體洗滌后75 ℃下烘干，然后粉碎，用甲醇浸提5次，每次1 d，然后合并5次提取液，濃縮至干浸膏，加水懸浮，裝入分液漏斗中，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對懸浮液依次萃取，然后再濃縮得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏。

1.2.4抑菌效果測定

1.2.4.1菌懸液的制備及病原菌活化將病原菌轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)室[溫度（25±1） ℃，光—暗周期12 h—12 h]連續(xù)培養(yǎng)3代后，在試驗前3～5 d再轉(zhuǎn)接1次培養(yǎng)備用。

1.2.4.2抑制植物病原菌活性測定將內(nèi)生真菌的菌絲體和發(fā)酵液的粗提物配成50 mg/mL液，測定其對病原菌菌絲生長的抑制作用。抑制菌絲生長速率法：將1 mL供試藥劑與 9 mL 融化的培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成培養(yǎng)基平面。培養(yǎng)基凝固后，在每個培養(yǎng)基平面放入1個供試菌菌餅（直徑為5 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)72～96 h后，用十字交叉法測定供試菌菌落生長直徑，按公式（2）計算抑制率。

[JZ（]菌落直徑（mm）=測定菌落平均直徑-5.0 mm；[JZ）][JY]（1）

[HS2]菌絲生長抑制率=[SX（]對照菌落直徑-處理菌落直徑〖〗對照菌落直徑[SX）]×100%。[JY]（2）

2結(jié)果與分析

2.1菌株發(fā)酵液各萃取相對植物病原菌的抑制作用

由表1可見，內(nèi)生菌發(fā)酵液各萃取相在50 mg/mL濃度下對這8種植物病原菌都有一定的抑制作用，其中，石油醚相對辣椒疫霉菌的抑制率最高，為68.27%，其次是小麥赤霉菌，抑制率58.35%；乙酸乙酯相對番茄灰霉菌的抑制率最高，為98.26%，其后依次是辣椒疫霉菌、馬鈴薯晚疫病菌、小麥赤霉菌、棉花枯萎菌、梨黑斑病菌、蘋果黑星病菌、蘋果炭疽菌，抑制率分別為 93.13%、86.28%、71.60%、68.85%、5872%、56.39%、 52.54%；正丁醇相除梨黑斑病菌、辣椒疫霉菌和蘋果炭疽菌外，對其他5種植物病原菌的抑制作用非常明顯，其中對番茄灰霉菌抑制率最高，為95.65%，然后依次是小麥赤霉菌87.46%、馬鈴薯晚疫病菌80.90%、蘋果黑星病菌78.58%、棉花枯萎菌 78.20%；水相對馬鈴薯晚疫病菌和番茄灰霉菌的抑制作用較為明顯，抑制率分別為6952%和67.12%?？傮w分析，乙酸乙酯相的抑制作用最明顯，對這8種植物病原菌的抑制率都超過50%，正丁醇相對5種植物病原菌的抑制率都超過50%，說明發(fā)酵液的抑菌活性代謝產(chǎn)物主要集中在乙酸乙酯相和正丁醇相中，后續(xù)的研究中，應(yīng)主要從這兩相中分離抗植物病原菌活性成分。

2.2菌株菌絲體提取物各萃取相對植物病原菌的抑制作用

由表2可見，內(nèi)生菌發(fā)酵的菌絲體各萃取相在50 mg/mL濃度下對這8種植物病原菌都有一定的抑制作用。石油醚相對這8種植物病原菌抑制率作用均小于50%；乙酸乙酯相對辣椒疫霉菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為96.52%，其后依次是馬鈴薯晚疫病菌、棉花枯萎菌、番茄灰霉菌、蘋果黑星病菌、小麥赤霉菌，抑制率分別為 91.29%、89.88%、75.24%、73.74%、68.25%；正丁醇相對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為79.38%，其次是番茄灰霉菌，抑制率為 69.18%，而對梨黑斑病菌和蘋果炭疽菌有微弱的促進(jìn)生長的作用；水相對馬鈴薯晚疫病菌有一定的抑制作用，抑制率為63.21%，對梨黑斑病菌和蘋果炭疽菌有微弱的促進(jìn)生長的作用。菌絲體各萃取相中乙酸乙酯相的抑制植物病原菌的作用最明顯，對其中的6種病原菌的抑制率都大于50%，而其他萃取相的抑菌作用都弱于發(fā)酵液各萃取相，有的有一定的促進(jìn)作用。

3結(jié)論與討論

內(nèi)生菌發(fā)酵液各萃取相在50 mg/mL濃度下對供試的8種植物病原菌都有一定的抑制作用，其中石油醚相對辣椒疫霉菌的抑制率最高，為68.27%；乙酸乙酯相對番茄灰霉菌的抑制率最高，為98.26%；正丁醇相對番茄灰霉菌的抑制率最高，為95.65%；水相對馬鈴薯晚疫病菌的抑制率最高，為 69.52%。乙酸乙酯相的抑制作用最明顯，對這8種植物病原菌的抑制率都超過50%，正丁醇相對5種植物病原菌的抑制率均超過50%。

菌絲體各萃取相在50 mg/mL濃度下對供試的8種植物病原菌的抑制作用都相對弱于發(fā)酵液各萃取相。石油醚相對這8種植物病原菌抑制率作用均小于50%；乙酸乙酯相對辣椒疫霉菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為96.52%；正丁醇相對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為79.38%，而對梨黑斑病菌和蘋果炭疽菌有微弱的促進(jìn)生長的作用；水相對馬鈴薯晚疫病菌有一定的抑制作用，對梨黑斑病菌和蘋果炭疽菌有微弱的促進(jìn)生長的作用。菌絲體各萃取相中乙酸乙酯相的抑制植物病原菌的作用最明顯，對其中的6種病原菌的抑制率大于50%，而其他各萃取相的抑菌作用都弱于發(fā)酵液各萃取相。

植物體內(nèi)廣泛存在著具有抗菌活性的菌株，它們對病原真菌、細(xì)菌等引起的植物病害有著不同程度的防治作用[7]，通過不同的生防機(jī)制，使植物免受或減輕危害，有的還對植物生長有促進(jìn)作用。植物內(nèi)生菌生長在植物組織細(xì)胞間隙，其中部分內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相關(guān)的活性成分[2]。高雯芳等研究發(fā)現(xiàn)四合木提取物對部分病菌的生長表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用[4，8]。 胡佳續(xù)等從四合木莖葉石油醚提取物中分離出了抗蟲活性成分[9]。試驗結(jié)果表明，四合木內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對植物病原菌有一定的抑制作用，在發(fā)酵液中乙酸乙酯相和正丁醇相的抑菌效果最佳，菌絲體中乙酸乙酯相抑菌效果最佳，說明抑菌活性代謝產(chǎn)物主要在發(fā)酵液中乙酸乙酯相和正丁醇相及菌絲體的乙酸乙酯相中，因此，進(jìn)一步的研究可以集中在這些部分，從中分離純化獲得單體化合物，研究各個單體化合物的抑菌活性，尋找具有抗植物病原真菌活性的次生代謝產(chǎn)物，可將內(nèi)生真菌用于生物防治或作為對環(huán)境無害農(nóng)藥的一個新來源，同時對四合木這一瀕危植物的保護(hù)具有重要意義。

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