鄭志新??+范翠麗??+孫洪生

摘要：為了探討不同因素對(duì)金蓮花初代培養(yǎng)的影響，最終篩選金蓮花初代培養(yǎng)的最適外植體、滅菌處理及誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，為金蓮花離體快繁和規(guī)模化、工廠化育苗提供理論依據(jù)。以金蓮花葉片、葉柄、根頸和根為外植體，以乙醇和HgCl2為滅菌劑，以MS為基本培養(yǎng)基，通過(guò)不同濃度的6-BA和NAA配比，進(jìn)行金蓮花初代組織培養(yǎng)研究。結(jié)果顯示，葉柄是金蓮花再生初代培養(yǎng)的最佳外植體，其通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)途徑建立再生體系，最佳的滅菌組合是75%乙醇滅菌10 s+0.1% HgCl2 滅菌4min，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；其次是根頸，以不定芽分化途徑為主，最佳滅菌組合為75%乙醇滅菌20 s+0.1% HgCl2 滅菌6 min，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

關(guān)鍵詞：金蓮花；初代培養(yǎng)；滅菌處理；葉柄；根頸不定芽；愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基；工廠化育苗

中圖分類號(hào)： S682.19文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0066-03

金蓮花（Trollius chinensis Bunge）屬毛茛科（Ranunculaceae）金蓮花屬（Trollius），別稱“金芙蓉”“金梅草”“旱蓮花”等，是稀有野生藥用植物，喜濕喜涼，多生長(zhǎng)在海拔1 800～2 700 m 的疏林或山地，集中分布在河北、山西、內(nèi)蒙和東北等地，其中以河北承德地區(qū)所產(chǎn)金蓮花藥材質(zhì)量最佳[1-5]。近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到金蓮花的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，對(duì)其大量采摘，再加上旅游、開(kāi)荒、放牧等行為，金蓮花野生資源及其生境遭到了極大的破壞，價(jià)格逐年上漲。因此，對(duì)金蓮花進(jìn)行引種馴化和人工栽培具有非常重要的意義。目前，金蓮花的人工栽培方法常見(jiàn)種子直播法和幼苗移栽法[6]。楊玉芳等采取實(shí)生播種進(jìn)行金蓮花幼苗培育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金蓮花幼苗死亡率很高，且幼苗苗期栽培管理困難，難以達(dá)到迅速培育優(yōu)質(zhì)種苗的目的[7]，而組織培養(yǎng)技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)培育大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗[8-9]。本試驗(yàn)對(duì)金蓮花的初代培養(yǎng)進(jìn)行詳細(xì)的探索，以期為金蓮花的工廠化育苗、次生代謝物生產(chǎn)等提供理論及技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

隨機(jī)選取在溫室播種的金蓮花幼苗（苗期3個(gè)月），種子購(gòu)自河北承德。

1.2試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年1—5月在河北北方學(xué)院組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1金蓮花初代培養(yǎng)外植體的篩選將金蓮花幼苗從溫室取回，用清水沖洗干凈根部基質(zhì)后置于流水中沖洗2 h，再用洗衣粉水浸泡30 min，接著用流水沖洗4 h，將金蓮花幼苗分成葉片、葉柄、根頸和根4個(gè)部分，先用75%乙醇表面消毒 10 s，再用0.1% HgCl2滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗干凈，接種于MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基上。

1.3.2滅菌劑及處理時(shí)間對(duì)金蓮花葉柄和根頸初代培養(yǎng)的影響外植體篩選出來(lái)的葉柄和根頸經(jīng)過(guò)清洗處理后，分別置于無(wú)菌瓶中，用75%乙醇和0.1% HgCl2的不同組合進(jìn)行外植體表面滅菌，篩選最佳的滅菌處理時(shí)間組合。

1.3.3培養(yǎng)基組成對(duì)金蓮花葉柄和根頸初代培養(yǎng)的影響以MS為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加不同濃度的6-BA和NAA，篩選葉柄愈傷組織誘導(dǎo)和根頸分化的最適培養(yǎng)基。

1.3.4培養(yǎng)基的制備和培養(yǎng)條件基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂3.5 g/L，于121 ℃高溫滅菌20 min，滅菌前pH值調(diào)至5.8，培養(yǎng)室溫度控制在（25±2） ℃，光照14 h/d。

1.4試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

接種1周后統(tǒng)計(jì)污染率，2周后統(tǒng)計(jì)死亡率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率等，記錄數(shù)據(jù)的同時(shí)觀察外植體生長(zhǎng)狀況并拍照。污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；成活率=成活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；死亡率=死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)愈傷組織外植體數(shù)/成活外植體數(shù)×100%；分化率=分化根頸數(shù)/成活根頸數(shù)×100%。

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、方差分析和多重比較（Duncans法）。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體的初代培養(yǎng)情況

將處理過(guò)的金蓮花幼苗分成葉片、葉柄、根頸和根4個(gè)部分，分別接種在MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA上，觀察其各自的變化情況。1周后，葉片有13.33%被污染，5000%死亡，只有16.67%有愈傷組織形成，且愈傷組織相對(duì)較多（圖1），其余的20%無(wú)生長(zhǎng)表現(xiàn)，死亡葉片最初表現(xiàn)為顏色逐漸變黑，而后死亡；葉柄的污染率和死亡率與葉片相比相對(duì)較低，分別只有7.00%、24.00%，葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，達(dá)到了52.00%，愈傷組織顏色發(fā)白，緊實(shí)度相對(duì)較差，稍顯疏松，但是愈傷組織相對(duì)很多（圖2）；葉片和葉柄均沒(méi)有不定芽分化。將根頸接入相同培養(yǎng)基，2周后只有435%出現(xiàn)污染，其余全部有新的不定芽萌發(fā)，但是沒(méi)有愈傷組織形成（圖3），可能因?yàn)楦i是作為完整植物存在的緣故。根系因?yàn)樯L(zhǎng)在基質(zhì)當(dāng)中，所含的雜菌較多，所以在相同的滅菌條件下，污染率較高，達(dá)到57.78%，但是死亡率也高，達(dá)到38.89%，其余的3.4%沒(méi)有任何生長(zhǎng)表現(xiàn)（表1）。由此可知，葉柄是金蓮花初代培養(yǎng)的最佳外植體選擇，其次是根頸，葉片也可以考慮，而根系則不能使用。

2.2滅菌時(shí)間對(duì)金蓮花初代培養(yǎng)的影響

2.2.1滅菌劑及處理時(shí)間對(duì)金蓮花葉柄初代培養(yǎng)的影響通常情況下，75%乙醇和0.1% HgCl2結(jié)合是常用的外植體滅菌組合，不同的外植體因?yàn)槠溆啄鄢潭群退鶖y帶雜菌的量不同而對(duì)具體的滅菌時(shí)間會(huì)有差別。由表2可知，在75%乙醇滅菌時(shí)間相同時(shí)，隨著0.1% HgCl2滅菌時(shí)間延長(zhǎng)，污染率下降，死亡率增加。用75%乙醇滅菌10 s時(shí)，HgCl2滅菌 4 min 和 6 min 之間的差別不大，HgCl2滅菌4 min時(shí)成活率達(dá)到7800%，只比6 min多6.00百分點(diǎn)；而當(dāng)HgCl2滅菌時(shí)間達(dá)到8 min時(shí)，污染率為0，而死亡率達(dá)到了92.00%，說(shuō)明HgCl2對(duì)幼嫩的葉柄有較強(qiáng)的毒害作用。同樣，當(dāng)HgCl2滅菌時(shí)間一致時(shí)，隨著75%乙醇表面滅菌時(shí)間的增加，葉柄污染率逐漸下降，滅菌死亡率逐漸增大，葉柄組織成活率逐漸下降，HgCl2滅菌時(shí)間為8 min，只有75%乙醇滅菌10 s的葉柄組織有成活，可知在75%乙醇和0.1% HgCl2的共同作用下，HgCl2的作用占主導(dǎo)地位。針對(duì)葉柄的組織培養(yǎng)，最佳的外植體處理組合為75%乙醇滅菌10 s+0.1% HgCl2滅菌 4 min，此時(shí)葉柄的污染率雖達(dá)到18.00%，但是死亡率最低，只有4.00%，成活率也最高，達(dá)到78.00%。

2.2.2滅菌劑及處理時(shí)間對(duì)金蓮花根頸初代培養(yǎng)的影響以根頸為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，在75%乙醇處于相同處理時(shí)，隨著HgCl2滅菌時(shí)間的增加，根頸的污染率下降，死亡率增加，這與葉柄的表面滅菌效果是一致的；當(dāng)HgCl2滅菌時(shí)間一致時(shí)，隨著75%乙醇表明處理時(shí)間的延長(zhǎng)，根頸同樣表現(xiàn)出與葉柄相同的變化趨勢(shì)（表3），可能是因?yàn)楦i底部有少量根系的存在使得其所攜帶的雜菌相對(duì)于葉柄偏多，所以根頸的最佳表面滅菌處理組合為75%乙醇20 s+0.1% HgCl2 6 min，此時(shí)的成活率達(dá)到了90.00%。

2.3培養(yǎng)基組成對(duì)金蓮花初代培養(yǎng)的影響

2.3.1培養(yǎng)基組成對(duì)金蓮花葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響表4表明，將葉柄接種在以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度 6-BA（4.0、8.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）培養(yǎng)基上，約1周后有白色愈傷組織形成，呈絮狀疏松態(tài)，10 d 左右愈傷組織逐漸增多，2周以后愈傷組織開(kāi)始變黑。具體的愈傷組織誘導(dǎo)情況和葉柄傷口的規(guī)格有著非常重要的關(guān)系，葉柄粗壯，愈傷組織出現(xiàn)得早且多，葉柄細(xì)弱，愈傷組織不出現(xiàn)或是出現(xiàn)得相對(duì)晚，這可能和葉柄內(nèi)部所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量有關(guān)，而葉柄的長(zhǎng)短對(duì)于愈傷組織誘導(dǎo)的影響不大。從表4可知，不同濃度的NAA對(duì)葉柄的初代培養(yǎng)有一定的影響，但與6-BA的結(jié)合效果則呈現(xiàn)出不一致的變化規(guī)律。當(dāng)6-BA 使用濃度為4.0 mg/L時(shí)，葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率在NAA為1.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大，隨著NAA濃度的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率開(kāi)始下降，在NAA為2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率只有25.00%，只有NAA1.0 mg/L的一半不到；當(dāng)6-BA的使用濃度為8 mg/L時(shí)，隨著NAA使用濃度的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率也一直增加，在NAA為2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率為85.00%，此時(shí)6-BA/NAA的值是一樣的，說(shuō)明細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例及使用濃度對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)都具有重要的影響，因此MS+8.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA是葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.3.2培養(yǎng)基組成對(duì)金蓮花根頸初代培養(yǎng)的影響生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配合使用，對(duì)芽的誘導(dǎo)效果好于細(xì)胞分裂素的單獨(dú)作用，也好于生長(zhǎng)素的單獨(dú)作用，即在一定濃度的細(xì)胞分裂素（或生長(zhǎng)素）的基礎(chǔ)上，添加一定濃度的生長(zhǎng)素（或細(xì)胞分裂素），對(duì)于不定芽的誘導(dǎo)，即根頸的分化有一定的促進(jìn)作用，因?yàn)樯L(zhǎng)素可促進(jìn)腋芽的生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和器官分化[10]。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，隨著 6-BA 濃度的增加，根頸分化率逐漸下降，可見(jiàn)低濃度的6-BA對(duì)于根頸的分化具有促進(jìn)作用；而當(dāng)NAA濃度為 0.5 mg/L，隨著6-BA濃度的增加，根頸分化率增加，這與NAA 濃度為0.1 mg/L時(shí)的結(jié)果正好相反（表5），可見(jiàn)6-BA/NAA的值對(duì)于根頸的分化比各自的使用濃度作用更關(guān)鍵，因此根頸分化的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

在植物的離體快繁過(guò)程中，初代培養(yǎng)的建立是快繁的第1步。在金蓮花的初代培養(yǎng)過(guò)程中，葉柄是最佳的外植體，其次是根頸；因葉柄和根頸的組織幼嫩程度及所攜帶雜菌的差異[CM（25]，各自的滅菌處理組合表現(xiàn)不同，其中葉柄以75%乙醇滅[CM）]

2滅菌6 min效果最佳；同時(shí)二者的分化途徑也有明顯的差異，葉柄以愈傷組織誘導(dǎo)途徑為主，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L，而根頸以不定芽分化途徑為主，最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

3.2討論

3.2.1外植體的選擇及滅菌對(duì)試驗(yàn)效果的影響選擇葉片、葉柄、根頸和根系分別作為外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)，在對(duì)其進(jìn)行滅菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)影響污染率的主要原因在于：如果滅菌時(shí)間短，只能鈍化部分細(xì)菌；如果滅菌時(shí)間長(zhǎng)，雖大部分細(xì)菌可被滅死，同時(shí)植物組織也會(huì)被殺死，因此在滅菌這一環(huán)節(jié)，污染是最大的障礙[11]，克服這一矛盾也是控制污染率的有效途徑。在選定的4種外植體中，葉柄表面光滑，克服這一矛盾相對(duì)容易，具有較好的愈傷組織誘導(dǎo)效果，是最佳的外植體選擇，其次是根頸，雖滅菌較葉柄難度增加，但是作為1株完整的植株存在，有不定芽的分化且具有很高的成活率，可以作為外植體的補(bǔ)充存在。

3.2.2激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響一般認(rèn)為，誘導(dǎo)愈傷組織或進(jìn)行不定芽分化的關(guān)鍵條件在于培養(yǎng)條件，而培養(yǎng)條件中的激素是最為重要的，外源激素是植物愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽分化中不可缺少的組成部分。通常情況下，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)保持愈傷組織的形成或不定芽的分化是非常必要的，尤其是二者有效結(jié)合時(shí)，對(duì)愈傷組織形成或不定芽誘導(dǎo)具有強(qiáng)烈的刺激作用[12]。本試驗(yàn)以葉柄為外植體時(shí)，在6-BA濃度為4.0 mg/L時(shí)，NAA濃度為1.0 mg/L表現(xiàn)最好；在6-BA濃度為8.0 mg/L時(shí)，NAA濃度為 2.0 mg/L 表現(xiàn)最好，雖6-BA和NAA的濃度差異很大，在其愈傷組織誘導(dǎo)率上表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，但因其6-BA/NAA的濃度比值均為20，因此表現(xiàn)出最佳的愈傷組織誘導(dǎo)率。以根頸為外植體時(shí)，因其具有不同的器官分化途徑，對(duì)于6-BA和NAA的濃度也表現(xiàn)出不同的適應(yīng)性，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為最佳的不定芽分化培養(yǎng)基，高濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)其起抑制作用。

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