李紅敬+李曉杰+王雅平+李曉風(fēng)

摘要：為了觀察重金屬離子（Hg2+和Pb2+）對(duì)牛蛙離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的影響，探討重金屬離子Hg2+和Pb2+污染對(duì)兩棲類(lèi)動(dòng)物牛蛙的作用，制備牛蛙離體坐骨神經(jīng)干，分為Hg2+浸泡液濃度組（0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.30 mg/L）；Pb2+浸泡液濃度組（0.08、0.15、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/L）；Hg2+和Pb2+混合浸泡液濃度組（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L），用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)引導(dǎo)神經(jīng)干動(dòng)作電位，測(cè)定神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值及傳導(dǎo)速度。結(jié)果表明，Hg2+不同處理主要起增大牛蛙坐骨神經(jīng)干閾值作用，Pb2+不同處理下牛蛙坐骨神經(jīng)干閾值變化不明顯，Hg2+與Pb2+聯(lián)合則牛蛙坐骨神經(jīng)干閾值大多表現(xiàn)增大且Hg2+起主要作用。Hg2+、Pb2+以及Hg2+與Pb2+聯(lián)合時(shí)牛蛙離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度均出現(xiàn)不規(guī)律變化。

關(guān)鍵詞：重金屬離子；Hg2+；Pb2+；動(dòng)作電位；閾值；傳導(dǎo)速度

中圖分類(lèi)號(hào)：Q958.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5316-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.037

Abstract： This study was aimed at observing the effect of heavy metal ions （Hg2+ and Pb2+） on the action potential and conduction velocity of bullfrog sciatic nerve， and researching the effect of Hg2+ and Pb2+ ions pollution on amphibians bullfrog. The prepared bullfrog sciatic nerve trunk were divided into Hg2+ groups which soaked in the liquid of concentration 0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.20 mg/L，and 0.30 mg/L；the Pb2+ groups were soaked in the liquid of concentration 0.08 mg/L，0.15 mg/L，0.2 mg/L，0.40 mg/L，0.80 mg/L and 1.00 mg/L. The mixed Hg2+ and Pb2+ groups were soaked in liquid of concentration Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L， Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L and Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L. The action potential of sciatic nerve trunk was induced and detected by BL-420 system of biological function experiment. The results showed that Hg2+ presented increasing effect on the action potential threshold，while Pb2+ showed no significant effect on the action potential threshold. The joined effect of Hg2+ and Pb2+ showed increasing effect on the threshold and Hg2+ played a main role. The conduction velocity all showed irregular change whatever treated with Hg2+， Pb2+ or mixed Hg2+ and Pb2+.

Key words： heavy metal ions；Hg2+；Pb2+；action potential；threshold； conduction velocity

兩棲動(dòng)物是最原始的陸生脊椎動(dòng)物，既有適應(yīng)陸地生活的新的性狀，又有從魚(yú)類(lèi)祖先繼承下來(lái)的適應(yīng)水生生活的性狀。同時(shí)兩犧動(dòng)物是農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在控制害蟲(chóng)和無(wú)公害農(nóng)業(yè)的發(fā)展中起著重要的作用。它們的防御、擴(kuò)散、遷移的能力較弱，對(duì)環(huán)境的依賴(lài)性大。近年來(lái)，大量工農(nóng)業(yè)以及生活污染物的排放使生態(tài)環(huán)境受到了嚴(yán)重污染和破壞，給兩棲類(lèi)動(dòng)物的生存帶來(lái)了不利影響[1]。重金屬元素若進(jìn)入體內(nèi)量過(guò)大，沉積到器官或細(xì)胞內(nèi)，會(huì)使得兩棲類(lèi)動(dòng)物在行為表現(xiàn)、生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化、形態(tài)組織等各方面發(fā)生顯著變化，甚至可能導(dǎo)致死亡[1]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究報(bào)道了重金屬離子對(duì)蛙類(lèi)以及對(duì)兩棲類(lèi)的毒性，但有關(guān)Hg2+和Pb2+對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干電生理特性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)測(cè)定了在Hg2+和Pb2+的脅迫下牛蛙的坐骨神經(jīng)神經(jīng)干電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)特性，其目的在于了解Hg2+和Pb2+對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)性能的影響，并為保護(hù)兩犧類(lèi)動(dòng)物和維持生態(tài)平衡提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用牛蛙于2013年3月采自河南省信陽(yáng)市，選取體重基本一致、活性良好的牛蛙成體（雌雄不拘）置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜養(yǎng)，24 h后用于試驗(yàn)[2]。

1.2 試驗(yàn)儀器

生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（BL-420F外置式，成都泰盟軟件有限公司），神經(jīng)屏蔽盒（成都泰盟軟件有限公司）引導(dǎo)電極，刺激電極，聯(lián)想臺(tái)式計(jì)算機(jī)，常規(guī)解剖器械（解剖針、玻璃針、骨剪、鑷子），燒杯，蛙板，膠頭滴管，棉簽，移液槍及槍頭，小木塊，手套，離心管或培養(yǎng)皿。

試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：（1）尋找閾值：?jiǎn)未碳ぃㄑ訒r(shí) 5 ms，波寬0.05 ms，細(xì)電壓，刺激電壓0 V，增量0.05 V，主周期4 s，手動(dòng)停止）。（2）測(cè)量牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度：?jiǎn)未碳ぃㄑ訒r(shí)5 ms，波寬0.05 ms，細(xì)電壓，刺激電壓1 V，增量0 V，主周期10 s，停止次數(shù)8）。

1.3 藥品與試劑

標(biāo)準(zhǔn)任氏液配制：分析天平稱(chēng)取NaCl（天津市大茂化學(xué)試劑廠）32.5 g、KCl（信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠）1.4 g、CaCl2（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）1.2 g、NaHCO3（天津市大茂化學(xué)試劑廠）4 g、NaH2PO4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）1 g、葡萄糖（天津市博迪化工有限公司）2 g，加蒸餾水至1 000 mL。

Hg2+和Pb2+溶液以任氏液為溶劑配制[HgCl2分析純，相對(duì)分子質(zhì)量272，Pb（CH3COO）2分析純，相對(duì)分子質(zhì)量325]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 牛蛙離體坐骨神經(jīng)干的制備 用常規(guī)方法制備牛蛙坐骨神經(jīng)干標(biāo)本。首先用天平稱(chēng)量牛蛙，然后左手食指按壓其頭部前端，右手自?xún)裳坶g的中線(xiàn)向后劃，觸到凹陷的枕骨大孔，用解剖針先垂直向下再向前插入并攪動(dòng)破壞腦髓，在稍微退出向后插入并攪拌破壞脊髓，直至蛙后肢及肌肉完全松弛。將蛙放在蛙板上，牽拉蛙的肚皮剪開(kāi)然后在腹壁肌肉剪開(kāi)翻開(kāi)。從下往上數(shù)沿第三節(jié)脊柱兩側(cè)剪除一切內(nèi)臟和頭、胸部，保留后肢、骶脊柱及脊柱兩側(cè)的坐骨神經(jīng)。然后用玻璃針、手術(shù)剪小心剝離坐骨神經(jīng)。剪去坐骨神經(jīng)上脊柱骨帶的肉，并用棉簽擦去神經(jīng)上附帶的血管、黏膜。

制備過(guò)程避免牽拉和用金屬器械碰觸到神經(jīng)干以防損傷神經(jīng)干。待標(biāo)本制好后放入標(biāo)準(zhǔn)任氏液中平衡10 min[3]備用。

1.4.2 神經(jīng)干動(dòng)作電位的引導(dǎo) 首先將所有經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)任氏液浸泡過(guò)的坐骨神經(jīng)干標(biāo)本置于神經(jīng)屏蔽盒的電極上，在1、5、10、15、20、25 min[4，5]時(shí)分別刺激神經(jīng)中樞端由外周端導(dǎo)出動(dòng)作電位波形，測(cè)出兩引導(dǎo)點(diǎn)之間的距離（S）（測(cè)定閾值，計(jì)算動(dòng)物電位傳導(dǎo)速度，作為對(duì)照）。然后再將標(biāo)本分為3組，分別置于Hg2+浸泡液[6]（0.02、0.04、0.08、0.10、0.20、0.30 mg/L）、Pb2+浸泡液（0.08、0.15、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/L）[7]以及Hg2+和Pb2+混合浸泡液（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.080 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L）浸泡10 min后待1、5、10、15、20、25 min時(shí)刺激神經(jīng)干，分別導(dǎo)出動(dòng)作電位波形，測(cè)出兩引導(dǎo)點(diǎn)之間的距離（S），記錄數(shù)據(jù)。觀察牛蛙坐骨神經(jīng)干經(jīng)不同濃度Hg2+、Pb2+、Hg2+和Pb2+混合溶液處理后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)其動(dòng)作電位閾值和傳導(dǎo)速度的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)量神經(jīng)干接受刺激到?jīng)_動(dòng)產(chǎn)生所需的時(shí)間（t）和兩引導(dǎo)點(diǎn)之間的距離（S），計(jì)算動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度（m/s）（計(jì)算公式：動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度=S/t），數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Hg2+處理牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值和傳導(dǎo)速度

2.1.1 不同濃度Hg2+處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值 由表1可見(jiàn)，當(dāng)Hg2+濃度為0.04和0.10 mg/L時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的閾值較對(duì)照減小，其他濃度處理后其閾值較對(duì)照均增加。

2.1.2 不同濃度Hg2+處理對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的影響 由表2可見(jiàn)，不同濃度Hg2+溶液對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度有影響。在同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度Hg2+溶液處理與任氏液對(duì)照組比較均差異明顯。同一濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度呈現(xiàn)不規(guī)律的變化。在5、10、15 min時(shí)均以0.20 mg/L的Hg2+溶液處理的傳導(dǎo)速度最低。不同濃度的Hg2+處理后絕大多數(shù)在5 min時(shí)傳導(dǎo)速度達(dá)到最低值。

2.2 不同濃度Pb2+處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值和傳導(dǎo)速度

2.2.1 不同濃度Pb2+處理對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值的影響 由表3可見(jiàn)，不同濃度的Pb2+處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值變化不明顯，Pb2+0.08 mg/L處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值增大；Pb2+ 0.15、0.40和1.00 mg/L處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值無(wú)變化；Pb2+ 0.20和0.80 mg/L處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值減小。

2.2.2 不同濃度Pb2+處理對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的影響 由表4可見(jiàn)，各組相比較，1、5 min時(shí)均以Pb2+ 0.80 mg/L處理時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低；10 min時(shí)以任氏液對(duì)照組牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低；15 min時(shí)以Pb2+ 1.00 mg/L處理時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低；20 min時(shí)Pb2+ 0.40 mg/L處理時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低；25 min時(shí)以Pb2+ 0.15 mg/L處理時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低。

2.3 不同濃度Hg2+和Pb2+聯(lián)合處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值和傳導(dǎo)速度

2.3.1 不同濃度Hg2+和Pb2+聯(lián)合處理對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值的影響 根據(jù)前面Hg2+和Pb2+的單獨(dú)試驗(yàn)可知在Hg2+ 0.08 mg/L和Pb2+ 0.40 mg/L時(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定。因此在Hg2+和Pb2+聯(lián)合試驗(yàn)就采用Hg2+ 0.08 mg/L和Pb2+ 0.40 mg/L為母液分別配比出Hg2+∶Pb2+=8∶2，Hg2+∶Pb2+=6∶4，Hg2+∶Pb2+=4∶6，Hg2+∶Pb2+=2∶8即（Hg2+ 0.064 mg/L+Pb2+ 0.08 mg/L，Hg2+ 0.048 mg/L+Pb2+ 0.160 mg/L，Hg2+ 0.032 mg/L+Pb2+ 0.240 mg/L，Hg2+ 0.016 mg/L+Pb2+ 0.320 mg/L四個(gè)濃度梯度。

由表5可見(jiàn)，Hg2+和Pb2+聯(lián)合處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值大多數(shù)表現(xiàn)增大（Hg2+∶Pb2+=2∶8時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值減?。@表明Pb2+所占比例越大牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位閾值就減小，在Hg2+和Pb2+混合處理時(shí)主要起降低神經(jīng)的靈敏度并減小閾值的作用。

2.3.2 不同濃度Hg2+和Pb2+聯(lián)合處理對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度的影響 由表6可見(jiàn)，在同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度Hg2+與Pb2+混合溶液處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度與任氏液對(duì)照組相比差異明顯。Hg2+與Pb2+混合溶液處理同一濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，牛蛙神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度呈不規(guī)律的變化。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)應(yīng)用電生理方法觀察了重金屬離子（Hg2+和Pb2+）對(duì)牛蛙離體坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值和傳導(dǎo)速度的影響。結(jié)果表明，Hg2+處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值普遍增大，Pb2+處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值的變化不明顯。Hg2+和Pb2+聯(lián)合處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值普遍增大。隨著Hg2+在聯(lián)合溶液中所占比重的增大，閾值增大的趨勢(shì)也越明顯，說(shuō)明Hg2+和Pb2+聯(lián)合溶液中Hg2+起主要增大牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值的作用。

從Hg2+溶液處理后牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度可知，不同濃度的Hg2+溶液處理后大多在5 min時(shí)動(dòng)物電位傳導(dǎo)速度達(dá)到最低。比較同一時(shí)間點(diǎn)，在5、10、15 min時(shí)均以0.2 mg/L Hg2+處理的牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低。Pb2+溶液處理后，0.08及0.40 mg/L Pb2+處理均在20 min時(shí)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度達(dá)到最低。Hg2+和Pb2+聯(lián)合處理下，5、20 min時(shí)Hg2+∶Pb2+=6∶4時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位傳導(dǎo)速度最低；10、15、25 min時(shí)Hg2+∶Pb2+=8∶2時(shí)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)物電位傳導(dǎo)速度最低。比較聯(lián)合處理同一比例下，Hg2+∶Pb2+=8∶2及Hg2+∶Pb2+=4∶6時(shí)均在25 min時(shí)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低；Hg2+∶Pb2+=6∶4時(shí)在5 min時(shí)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低；Hg2+∶Pb2+=2∶8時(shí)在1 min時(shí)動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最低。

目前對(duì)重金屬的毒性作用已有眾多的研究，但是關(guān)于Hg2+和Pb2+以及兩者共同作用對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的影響機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)研究。Hg2+和Pb2+都能改變細(xì)胞酶的催化活性[9]，這可能是其影響牛蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位閾值傳導(dǎo)速度的主要原因。

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