吳圣楠隗黎麗李海軍付建平劉 毅

(1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330022; 2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 南昌 330045)

三角帆蚌熱休克蛋白70基因克隆及其表達(dá)分析

吳圣楠1隗黎麗2李海軍1付建平1劉 毅1

(1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330022; 2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 南昌 330045)

對三角帆蚌HSP70基因序列進(jìn)行全長克隆及其分子生物學(xué)分析, 并檢測其在不同水溫刺激下鰓組織中的表達(dá)變化。通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序獲得三角帆蚌HSP70基因(HcHSP70)長片段, 采用3′ RACE對其進(jìn)行了3′末端克隆, 經(jīng)拼接得到HcHSP70 cDNA全長序列。采用多種分子生物學(xué)軟件對HcHSP70 cDNA全長序列進(jìn)行了特征分析, 采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測了其組織分布, 并結(jié)合Western-blot技術(shù)檢測蚌鰓中該基因mRNA與蛋白經(jīng)不同水溫刺激后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示, HcHSP70 cDNA全長為2298 bp, 其中開放閱讀框?yàn)?974 bp, 編碼657個氨基酸。預(yù)測分子量大小為71.6 Ku, pH7.0時的理論等電點(diǎn)為5.61。氨基酸序列分析表明, HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3個標(biāo)簽序列(I9DLGTTYS16、I197FDLGGGTFDVSIL210和I336VLVGGSTRIPKVQK350), 與長牡蠣及泥蚶的HSP70同源性最高(91%)。實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示, HcHSP70在鰓、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5種被檢組織中均有表達(dá), 以肝胰腺中的表達(dá)水平最高。實(shí)時熒光定量PCR與Western-blot技術(shù)檢測皆表明, 蚌鰓組織中HcHSP70基因與蛋白的表達(dá)量在37℃時達(dá)到最高, 而在40℃水溫刺激下表達(dá)水平下調(diào)至正常值, 表明其在適應(yīng)高溫刺激時發(fā)揮了重要作用。

三角帆蚌; 熱休克蛋白70; 序列分析; 基因表達(dá); 水溫刺激

熱休克蛋白家族(Heat shock proteins, HSPs)是一類應(yīng)激反應(yīng)性蛋白, 通常作為危險信號以提高機(jī)體適應(yīng)熱的能力及對抗多種壓力刺激。在感染、缺氧、饑餓和缺水等條件刺激下也能誘導(dǎo)出該蛋白, 故也稱之為熱應(yīng)激蛋白[1]。HSPs結(jié)構(gòu)高度保守,通常執(zhí)行管家基因功能和保護(hù)功能, 包括細(xì)胞骨架保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡等多種功能[2,3]。根據(jù)相對分子量大小, HSPs成員分為4個主要家族: HSP90、HSP70、HSP60及小HSP家族[4]。研究表明, HSP70家族分子在幫助機(jī)體細(xì)胞應(yīng)對各種不利環(huán)境中起關(guān)鍵作用[5,6]。HSP70具備分子伴侶功能, 可幫助細(xì)胞內(nèi)多肽保持未折疊狀態(tài), 保障其順利通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體膜, 以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的正確組裝[7]。作為熱休克蛋白家族中最保守的蛋白, HSP70廣泛存在于各種生物體內(nèi), 迄今已從植物[8]、動物[9]及微生物[10]體內(nèi)成功克隆出HSP70基因的全長。

無脊椎軟體動物缺少獲得性免疫系統(tǒng), 其對外界感染的防御只能基于先天免疫系統(tǒng)來識別異己分子, 最終實(shí)現(xiàn)機(jī)體的自我保護(hù)[11,12]。為抵御外界不利環(huán)境脅迫, 軟體動物體內(nèi)的HSP70分子所發(fā)揮的免疫保護(hù)作用十分關(guān)鍵。迄今已成功從合浦珠母貝(Pinctada martensii)[13]、南極帽貝(Laternula elliptica)[14]及福壽螺(Pomacea canaliculata)[9]等多種軟體動物中克隆出HSP70全長序列。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國最重要的淡水育珠蚌, 其培育的珍珠產(chǎn)量占淡水育珠產(chǎn)量的95%以上[15]。近年來由于病害影響, 給我國淡水育珠業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。深入開展三角帆蚌HSPs分子的分子生物學(xué)研究, 將有助于其病害防治。在之前的工作中, 作者曾報道三角帆蚌熱休克蛋白60的相關(guān)研究[16]。本文將對三角帆蚌HSP70基因序列進(jìn)行全長克隆及其分子生物學(xué)分析, 并檢測其在不同水溫刺激下鰓組織中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用三角帆蚌購自南昌市人民公園菜市場, 長度為(14.5±0.5) cm。洗凈后暫養(yǎng)于盛有曝氣自來水的水族箱(100 cm×60 cm×45 cm)中。使用充氣泵充氣飼養(yǎng), 每天換水1次, 暫養(yǎng)1周確認(rèn)蚌體健康無病后開始實(shí)驗(yàn)。三角帆蚌飼養(yǎng)條件同文獻(xiàn)[16]。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

使用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA, 操作過程中所用琉璃器皿及金屬器械經(jīng)180℃高溫烘烤6h以上使RNase徹底失活, 使用Thermo公司的無RNase離心管及槍頭, 具體總RNA提取過程參考試劑盒的操作說明進(jìn)行。

以提取的RNA為模板, 使用Oligo-dT為逆轉(zhuǎn)錄引物及Clontech公司Power-ScriptTMReverse Transcriptase合成cDNA第一鏈, cDNA合成按TaKaRa Prime-ScriptTMReverse Transcriptase Kit操作手冊進(jìn)行。

1.3 HcHSP70 cDNA全長的獲得

由轉(zhuǎn)錄組高通量測序獲得始于HcHSP70 cDNA 5′末端的一段長序列(2298 bp), 轉(zhuǎn)錄組測序工作由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。根據(jù)此序列,采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(BD, Biosciences Clontech)獲得該基因的3′端序列。根據(jù)已知的局部HSP70 cDNA序列設(shè)計(jì)出兩條正向引物HSP70F1和HSP70F2 (表 1)。

首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS primer A對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 使用試劑盒中的Long引物和Short引物, 按比例1∶3混合為通用引物UPM。使用引物HSP70-F1和UPM, 以上面合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增; 將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍, 然后用引物HSP70F2和UPM進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增, 將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并用Tiangen公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收cDNA目的片段后對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化, 純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)檢測后挑取陽性克隆測序,最后進(jìn)行全長序列拼接, 得到HcHSP70 cDNA全長序列。用于HcHSP70基因擴(kuò)增與表達(dá)的引物見表 1。

表 1 用于HcHSP70擴(kuò)增和表達(dá)的引物Tab. 1 Primers used in amplification and expression of HcHSP70

1.4 HcHSP70基因序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用NCBI上的BLAST (http://www.ncbi.nlm. gov/BLAST/)進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列分析。利用ExPASy (http://expasy.pku.edu.com)上軟件分析HcHSP70氨基酸序列與開放閱讀框(ORF); 采用NCBI BLASTp進(jìn)行序列同源基因搜索。采用Clustal W 2.1和Mega 5.0軟件比較HcHSP70與其他物種HSP70氨基酸序列同源性, 使用鄰接法(N-J法)構(gòu)建基于氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 并采用自展法對其可靠性進(jìn)行分析驗(yàn)證(1000個假重復(fù)數(shù))。用于氨基酸比對和進(jìn)化樹構(gòu)建的基因名稱及其 GenBank序列登錄號見表 2。

1.5 HcHSP70 mRNA在不同組織中的表達(dá)

從暫養(yǎng)蚌的水族箱中選取3個蚌, 取鰓(Gi)、性腺(Go)、肝胰腺(He)、外套膜(Ma)及肌肉(Mu)等5種組織, 用Trizol法提取總RNA, 用紫外分光儀(UV-5100)測定濃度并統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL, 各取2 μL反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測室溫下(25℃) HcHSP70在三角帆蚌不同組織中的表達(dá)。

HcHSP70各個樣本的cDNA使用BIO-RAD CFX系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)已獲得的HcHSP70 cDNA全長, 設(shè)計(jì)出特異引物HSP70-F和HSP70-R(表 1), 用于擴(kuò)增出HcHSP70基因3′端99 bp的片段。根據(jù)三角帆蚌β-actin基因(HM045420.1)設(shè)計(jì)出可得到129 bp的內(nèi)參β-actin基因的引物β-actin F和β-actinR(表 1)。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為: Real Master Mix SYBR Green 9 μL, 各引物0.5 μL, 50× ROX Reference Dye 0.5 μL, cDNA 1 μL,去離子水8.5 μL。擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性3min, 95℃ 10s, 55℃ 20s, 72℃ 20s, 40個循環(huán); 末次延伸72℃, 5s; 在每個循環(huán)的延伸階段同步多次采集熒光。PCR擴(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析, 以驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。從65℃上升到95℃保持增長速度為0.5 ℃/s。各樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 鰓組織HcHSP70在不同水溫刺激后的表達(dá)變化

實(shí)時熒光定量PCR將蚌分成6組(每組放置3個), 分別于25℃(對照組), 28℃、31℃、34℃、37℃及40℃水溫放置2h, 正常水溫下恢復(fù)1h后取其鰓組織。Trizol法提取各組織的總RNA, 利用實(shí)時熒光定量PCR法檢測HcHSP70基因水平在鰓組織中的表達(dá)變化, PCR擴(kuò)增條件同1.5, 選擇三角帆蚌β-actin作為內(nèi)參基因。所用引物見表 1。

Western blot利用Western blot技術(shù)檢測鰓組織中HcHSP70蛋白在不同水溫刺激后的表達(dá)變化。取-80℃凍存的鰓組織, 加入裂解緩沖液(1.0% NP-40 in 50 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF)冰上勻漿。勻漿后冰上靜置30min后4℃, 12000 r/min離心30min, 離心分離掉不溶性細(xì)胞碎片收集上清, 制得蛋白樣品。使用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(金斯瑞, 南京)采用10% SDS-PAGE凝膠體系將蛋白樣品電泳分離, 再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后使用5%脫脂奶粉封閉2h, 加入HSP70一抗(1∶1000, 金斯瑞) 4℃孵育過夜。HSP70一抗所用的免疫原為多肽, 肽與KLH的偶聯(lián)物, 序列為CHMKSTVEDQNLKDK。使用TBST (TBST: 0.1% Tween-20, 50 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl)洗膜三次, 每次5—10min。然后加入羊抗兔HRP二抗(1∶5000, 金斯瑞)室溫孵育1h, TBST漂洗后, 使用NBT/BCIP避光顯色, 使用Chemi Doc XRS(BIO-RED, 美國)自動曝光采集Western雜交圖像。以β-actin蛋白作為內(nèi)參蛋白, 實(shí)驗(yàn)過程與HSP70相同。

1.7 數(shù)據(jù)分析

熒光定量實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)使用比較Ct方法, 根據(jù)熒光曲線的Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線使用SPSS 15.0進(jìn)行單因素方差分析, P＜0.05 (*)。

2 結(jié)果

2.1 HcHSP70 cDNA全長及推導(dǎo)的氨基酸序列特征

通過3′RACE-PCR拼接得到三角帆蚌HSP70基因cDNA(GenBank登錄號: AHN82525.1)的全長為2298 bp, 其中5′端非翻譯區(qū)76 bp, 3′端末端248 bp,有典型的加尾信號(AATAAA)和PolyA尾巴。該基因開放閱讀框?yàn)?974 bp, 編碼657個氨基酸, 預(yù)測分子量大小為71.6 Ku, 當(dāng)pH為7.0時的理論等電點(diǎn)為5.61。

HcHSP70氨基酸序列含有三個HSP70家族典型的標(biāo)簽序列: 9—16 (IDLGTTYS), 197—210 (IF DLGGGTFDVSIL)以及336—350 (IVLVGGSTRIP KVQK)。并且具有ATP酶結(jié)構(gòu)域131—137 (AEAY LGK)以及雙向核定位信號246—262 (KRKHKR DMKDNKRAVRR), 該信號位點(diǎn)可能涉及HcHSP70選擇性易位進(jìn)入核仁中。同時發(fā)現(xiàn)縮氨酸結(jié)合位點(diǎn)299—305 (RARFEEL), 兩個糖基化位點(diǎn)360—363 (NKSI)和487—490 (NVSA), 以及其他典型的重復(fù)位點(diǎn)GGXP在 622—633的位置上。此外, 高保守的細(xì)胞質(zhì)HSP70羧基末端保守區(qū)域EEVD位于654—657位氨基酸上。

多重比對結(jié)果證明HcHSP70符合HSP70s所有特征。使用SignalP 4.0預(yù)測HcHSP70無信號肽, TMHMM預(yù)測HcHSP70無跨膜區(qū)。

2.2 HcHSP70序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過BLAST同源搜索, 發(fā)現(xiàn)推導(dǎo)出的三角帆蚌HSP70的氨基酸序列與其他物種相應(yīng)的序列顯示出較高的親緣性。從基因庫中選取13個物種的HSP70或HSC70氨基酸序列, 分別來自軟體動物:長牡蠣(Crassostrea gigas)、泥蚶(Tegillarca granosa)、海灣扇貝(Argopecten irradians)和櫛孔扇貝(Azumapecten farreri), 脊索動物: 草魚(Ctenopharyngodon idella)與銅魚(Coreius guichenoti), 節(jié)肢動物: 二化螟(Chilo suppressalis)、小地老虎(Agrotis ipsilon)與豆髯須夜蛾(Hypena tristalis), 哺乳動物:小家鼠(Mus musculus)、綿羊(Ovis aries)與人(Homo sapiens), 扁形動物: 三角渦蟲(Dugesia japonica)。比對結(jié)果顯示HcHSP70與長牡蠣和泥蚶同源性最高, 達(dá)到91%, 而與人的同一性最低, 僅為33%。通過鄰接法構(gòu)建HcHSP70系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn), HcHSP70與4種軟體動物(長牡蠣、泥蚶、海灣扇貝和櫛孔扇貝)聚為一支(圖 1)。

2.3 HcHSP70組織表達(dá)

使用實(shí)時熒光定量PCR分析HcHSP70 mRNA在不同組織間特異性地表達(dá)情況, 結(jié)果表明在室溫條件下HcHSP70 mRNA在全部5種被檢組織中均有表達(dá), 以肝胰腺中的表達(dá)水平最高, 其次為性腺, 而在鰓、外套膜及肌肉等3種組織中相對較低(圖2)。

2.4 在不同水溫刺激下鰓HcHSP70 mRNA及其蛋白的表達(dá)變化

經(jīng)不同水溫刺激2h后, 鰓HcHSP70基因表達(dá)量隨水溫上升出現(xiàn)上調(diào), 相比對照組(25℃), 28℃、31℃、34℃水溫刺激后分別出現(xiàn)1.8倍、2.0倍及2.2倍上調(diào)(圖 3a)。而當(dāng)刺激水溫為37℃時, HcHSP70基因表達(dá)量急劇上升, 為對照組的14.4倍, 顯著高于其他溫度。水溫為40℃時, 其表達(dá)量又急劇下降, 僅為對照組的2.3倍。

圖 1 HSP70基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on HSP70 gene使用ClustalW 2.1軟件進(jìn)行序列比對, MEGA 5.0按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)點(diǎn)處數(shù)值代表1000評估的自舉檢驗(yàn)置信度Full-length amino acid sequences were aligned using ClustalW 2.1 and a phylogenetic tree was constructed using Neighbor-Joining algorithm with MEGA 5.0 (1000 bootstrap)

圖 2 HcHSP70在三角帆蚌不同組織中的表達(dá)Fig. 2 The expression of HcHSP70 in different tissues of H. cumingiiqRT-PCR法檢測HcHSP70在鰓(Gi)、性腺(Go)、肝胰腺(He)、外套膜(Ma)及肌肉(Mu)5種組織中的相對表達(dá), 以β-actin作內(nèi)參qRT-PCR was performed to detect the expression of HcHSP70 in 5 different tissues including gonad (Go), gill (Gi), hepatopancreas (He), mantle (Ma) and muscle (Mu). β-actin was used as an inner control to normalize the samples

Western blot檢測結(jié)果也顯示, 當(dāng)刺激水溫為37℃時, HcHSP70蛋白表達(dá)量達(dá)到最高, 明顯高于其他水溫刺激后的表達(dá)量(圖 3b)。

3 討論

HSP70作為熱休克蛋白家族中最保守的蛋白廣泛存在于各種生物體內(nèi)[17]。以貝類動物為例, 合浦珠母貝[13]、南極帽貝[14]、福壽螺[9]等物種HSP70分別編碼652、653和653個氨基酸。本研究克隆得到的三角帆蚌HSP70基因開放閱讀框?yàn)?974 bp, 編碼657個氨基酸, 與貝類其他物種十分接近。序列分析結(jié)果顯示, HcHSP70含有HSP70家族的典型標(biāo)簽序列, 包括: 3個保守簽名序列(IDLGTTYS、IFD LGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)、ATPase功能域、底物肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C末端區(qū)域存在3個連續(xù)重復(fù)的4肽序列和EEVD序列以及其他HSP家族特征性功能結(jié)構(gòu)域[18—20]。同源性分析表明, HcHSP70與其他軟體動物HSP70基因具有很高的同源性, 與泥蚶和長牡蠣同一性最高, 達(dá)91%, 而與人HSP70同一性僅為33%。在系統(tǒng)發(fā)育樹中, 脊椎動物、軟體動物及節(jié)肢動物HSP70s序列各自分開并形成可信度較高的簇, HcHSP70與其他4種軟體動物HSP70(長牡蠣、泥蚶、海灣扇貝和櫛孔扇貝)聚為一支, 可以確認(rèn)本研究所獲序列為HSP70家族成員。

圖 3 三角帆蚌鰓組織中HcHSP70經(jīng)不同水溫刺激后的表達(dá)變化Fig. 3 Expression of HcHSP70 under different water temperaturea. 實(shí)時熒光定量qRT-PCR方法檢測三角帆蚌鰓組織中Hc-HSP70經(jīng)6種不同水溫刺激后的表達(dá)變化, 刺激水溫分別為25、28、31、34、37及40℃。以β-actin作為內(nèi)參。星號(*)表示熱激后HcHSP70 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(25℃) (P＜0.05)(n=3); b. Western blot法檢測三角帆蚌鰓組織中Hc-HSP70蛋白經(jīng)不同水溫刺激后的表達(dá)變化, 以β-actin蛋白作為內(nèi)參a. qRT-PCR was performed to detect the expression of HcHSP70 in 6 different temperature of gill (Gi) from H. cumingii under 25, 28, 31, 34, 37 and 40℃. β-actin was used as an internal control to normalize the samples. The asterisks indicate the values which were significantly different from control (P＜0.05); b. Expression of the HcHSP70 protein in response to high temperature detected by Western blot. The intensities of HcHSP70 protein bands were normalized against the β-actin protein

盡管HSP70廣泛存在于各類生物體內(nèi), 但各物種HSP70的表達(dá)具有組織特異性。近江牡蠣HSP70在外套膜、鰓、消化腺、肌肉及心臟中均有表達(dá),在肌肉中表達(dá)量最高[21]。褶紋冠蚌HSP70在鰓組織中的表達(dá)量較高, 其次是肌肉[22]。本研究發(fā)現(xiàn)HcHSP70在不同組織中也均有表達(dá), 而以肝胰腺中的表達(dá)最高, 其次是性腺, 而在鰓、外套膜及肌肉中的表達(dá)量較低(圖 2)。此結(jié)果與縊蟶Hsc70的組織表達(dá)情況相似[23]。

作為一種應(yīng)激蛋白, HSP70可幫助生物體迅速適應(yīng)環(huán)境變化以抵御外界不良損害[4]。曲凌云等檢測到熱刺激可使櫛孔扇貝鰓組織中HSP70表達(dá)明顯升高, 而在肌肉、外套膜及性腺組織中未檢測到變化[24]。此外, 鰓組織因與水環(huán)境直接接觸, 對水溫變化較為敏感, 更容易發(fā)生熱休克反應(yīng)[25]。本研究利用實(shí)時熒光定量PCR和Western-blot技術(shù)從mRNA和蛋白質(zhì)水平分別檢測不同溫度刺激對三角帆蚌鰓組織中HSP70表達(dá)的影響。結(jié)果顯示, 鰓組織中HcHSP70表達(dá)量隨水溫上升而上調(diào), 且當(dāng)刺激水溫度到達(dá)37℃時, HcHSP70 mRNA和蛋白表達(dá)量皆急劇上升(圖 3)。此結(jié)果與其他研究類似, 雄性福壽螺PcHSP70也在39℃水溫刺激下表達(dá)量最高[26]。而牡蠣的鰓與外套膜組織中HSP70表達(dá)量在35℃時即達(dá)到最高[27]。

值得注意的是, 當(dāng)刺激水溫達(dá)到40℃時, HcHSP70 mRNA和蛋白的表達(dá)量又急劇下降并恢復(fù)至正常水平。此結(jié)果與西伯利亞鱘[25]、福壽螺[26]和牡蠣[27]等物種HSP70的研究結(jié)果相似, 當(dāng)刺激水溫不斷升高時HSP70表達(dá)量都出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象。推測較高水溫刺激下的三角帆蚌機(jī)體內(nèi)與HcHSP70相關(guān)的免疫應(yīng)答水平也受到極大的抑制,具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

[1]Santoro M G. Heat shock factors and the control of the stress response [J]. Biochemical Pharmacology, 2000, 59(1): 55—63

[2]Pramod S. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity [J]. Nature Reviews Immunology, 2002, 2(3): 185—194

[3]Benarroch E E. Heat shock proteins: multiple neuroprotective functions and implications for neurologic disease [J]. Neurology, 2011, 76(7): 660—667

[4]S Lindquist A, Craig E A. The heat-shock proteins [J]. Annual Review of Genetics, 1988, 22(2): 631—677

[5]Sung D Y, Kaplan F, Guy C L. Plant Hsp70 molecular chaperones: Protein structure, gene family, expression and function [J]. Physiologia Plantarum, 2001, 113(4): 443—451

[6]Yoshimi T, Hiroshige O Y. Induction profile of HSP70-cognate genes by environmental pollutants in Chironomidae [J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2009, 28(2): 294—301

[7]Jiang X R, Yang J. Molecular chaperone and protein folding [J]. Anhui Institute of Education, 2001, 19(3): 55—56 [姜先榮, 楊杰. 分子伴侶與蛋白質(zhì)折疊. 安徽教育學(xué)院學(xué)報, 2001, 19(3): 55—56]

[8]Fei J, Wang Y S, Zhou Q, et al. Cloning and expression analysis of HSP70 gene from mangrove plant Kandelia obovata under cold stress [J]. Ecotoxicology, 2015, 24(7): 1—9

[9]Song H M, Mu X D, Gu D E, et al. Molecular characteristics of the HSP70 gene and its differential expression in female and male golden apple snails (Pomacea canaliculata) under temperature stimulation [J]. Cell Stress & Chaperones, 2014, 19(4): 1—11

[10]Ohta T, Saito K, Kuroda M, et al. Molecular cloning of two new heat shock genes related to the hsp70 genes in Staphylococcus aureus [J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(15): 4779—4783

[11]Bachère E, Gueguen Y, Gonzalez M, et al. Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: the penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas [J]. Immunological Reviews, 2004, 198(1): 149—168

[12]Schmid-Hempel P. Variation in immune defence as a question of evolutionary ecology [J]. Proceedings Biological Sciences, 2003, 270(1513): 357—366

[13]Huang G J, Qu N N, Yu D H, et al. Molecular cloning and expression of HSP70 genes from Pinctada martensii [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(5): 726—732 [黃桂菊, 曲妮妮, 喻達(dá)輝, 等. 合浦珠母貝熱休克蛋白hsp70基因的克隆與表達(dá)分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(5): 726—732]

[14]Hyun P, In-Young A, Hye Eun L. Expression of heat shock protein 70 in the thermally stressed antarctic clam Laternula elliptica [J]. Cell Stress & Chaperones, 2007, 12(3): 275—282

[15]Li J l, Qian R H, Bao B L, et al. RAPD analysis on genetic diversity among the stocks of Hyriopsis cumingii from the five large lakes of China [J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 2005, 14(1): 1—5 [李家樂, 錢榮華,鮑寶龍, 等. 中國五大湖三角帆蚌群體遺傳多樣性的RAPD分析. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2005, 14(1): 1—5]

[16]Wu S N, Liu D W, Liu Y, et al. Cloning and expression of heat shock protein 60 gene from Hyriopsis cumingii [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(5): 897—902 [吳圣楠, 劉大偉, 劉毅, 等. 三角帆蚌熱休克蛋白60基因克隆及其表達(dá)分析. 水生生物學(xué)報, 2014, 38(5): 897—902]

[17]Boorstein W R, Ziegelhoffer T, Craig E A. Molecular evolution of the HSP70 multigene family [J]. Journal of Molecular Evolution, 1994, 38(1): 1—17

[18]Boutet I, Tanguy A, Moraga D. Organization and nucleotide sequence of the European flat oyster Ostrea edulis heat shock cognate 70 (hsc70) and heat shock protein 70 (hsp70) genes [J]. Aquatic Toxicology, 2003, 65(2): 221—225

[19]Isabelle B, Arnaud T, Sabrina R, et al. Molecular identification and expression of heat shock cognate 70 (hsc70) and heat shock protein 70 (hsp70) genes in the Pacific oyster Crassostrea gigas [J]. Cell Stress & Chaperones, 2003, 8(1): 76—85

[20]Hamdoun A M, Cheney D P, Cherr G N. Phenotypic Plasticity of hsp70 and hsp70 gene expression in the pacific oyster (Crassostrea gigas): implications for thermal limits and induction of thermal tolerance [J]. Biology Bulletin, 2003, 205(2): 160—169

[21]Zhang Z, Zhang Q. Molecular cloning, characterization and expression of heat shock protein 70 gene from the oyster Crassostrea hongkongensis responding to thermal stress and exposure of Cu(2+) and malachite green [J]. Gene, 2012, 497(2): 172—180

[22]Xie Y H, Hu B Q, Wen C G. Cloning and expression analysis of HSP70 gene from Cristaria plicata [J]. Journal of Nanchang University (Natural Science), 2011, 35(5): 457—463 [謝彥海, 胡寶慶, 文春根. 褶紋冠蚌熱休克蛋白HSP70基因的克隆及表達(dá)研究. 南昌大學(xué)學(xué)報: 理科版, 2011, 35(5): 457—463]

[23]Feng B B, Niu D H, Zhong Y M, et al. Molecular characteristics and expression analysis of ScHsc70 cDNA in Sinonovacula constricta [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(1): 33—44 [馮冰冰, 牛東紅, 鐘玉民,等. 縊蟶ScHsc70 cDNA的分子特性和表達(dá)分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19(1): 33—44]

[24]Qu L Y, Xiang J H, Shun X Q, et al. Expression analysis of HSP70 in Various tissues of Chlamys farreri under thermal stress [J]. High Technology Letters, 2005, 15(5): 96—100 [曲凌云, 相建海, 孫修勤, 等. 溫度刺激下櫛孔扇貝不同組織熱休克蛋白HSP70的表達(dá)研究. 高技術(shù)通訊, 2005, 15(5): 96—100]

[25]Tian Z H, Xu S G, Wang W, et al. Effects of acute thermal stress on HSP70 mRNA, physiology and nonspecific immunity in Siberian Sturgeon (Acipenser baerii) [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(2): 344—350 [田照輝, 徐紹剛, 王巍, 等. 急性熱應(yīng)激對西伯利亞鱘HSP70 mRNA表達(dá)、血清皮質(zhì)醇和非特異性免疫的影響. 水生生物學(xué)報, 2013, 37(2): 344—350]

[26]Song H M, Mu X D, Gu D E, et al. Molecular characteristics of the HSP70 gene and its differential expression in female and male golden apple snails (Pomacea canaliculata) under temperature stimulation [J]. Cell Stress & Chaperones, 2014, 19(4): 1—11

[27]Piano A, Asirelli C, Caselli F, et al. Hsp70 expression in thermally stressed Ostrea edulis, a commercially important oyster in Europe [J]. Cell Stress & Chaperones, 2002, 7(3): 250—257

CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 GENE FROM HYRIOPSIS CUMINGII

WU Sheng-Nan1, WEI Li-Li2, LI Hai-Jun1, FU Jian-Ping1and LIU Yi1
(1. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2. College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In the present study, the cDNA sequence of Hyriopsis cumingii HSP70 (HcHSP70) was cloned by 3′rapid amplification of cDNA ends methods (3′-RACE) based on a long chain sequence of HcHSP70 and it was determined by high flux sequencing for transcriptome of H. cumingii blood cells, and its expression in the different tissues was detected with quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results showed that the full-length of HcHSP70 cDNA was 2298 bp long including a 1974 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 657 amino acids that estimated molecular mass of 71.6 Ku and an isoelectric point of 5.67. Sequence comparison indicated that HcHSP70 shares the highest identity (91%) with HSP70 of Tegillarca granosa and Crassostrea gigas. HcHSP70 mRNA expressed in all 5 detected tissues (hepatopancreas, gonad, gill, mantle, muscle) with the highest expression in hepatopancreas. Both mRNA and protein level of HcHSP70 in gill significantly up-regulated at 37℃ and rapidly reduced to normal level under 40℃.

Hyriopsis cumingii; Heat shock protein 70; Cloning; Gene expression; Thermal stress

Q344+.1; S917

A

1000-3207(2017)01-0050-06

10.7541/2017.7

2016-02-01;

2016-06-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060359); 江西省自然科學(xué)基金(20122BAB204017)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31060359); the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (20122BAB204017)]

吳圣楠(1992—), 女, 江西鷹潭人; 碩士研究生; 主要從事分子免疫學(xué)研究。E-mail: wusn2013@163.com

劉毅, E-mail: yiliusan@sina.com