管聲，梁琪*，宋雪梅，黃紹海，張炎，文鵬程

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅雪頓牦牛乳業(yè)股份有限公司，甘肅 蘭州，730050)

牦牛乳乳糖酶解及其預(yù)熱處理條件優(yōu)化

管聲1,2，梁琪1,2*，宋雪梅1,2，黃紹海3，張炎1,2，文鵬程1,2

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅雪頓牦牛乳業(yè)股份有限公司，甘肅 蘭州，730050)

針對牦牛乳熱處理和乳糖酶解問題，采用夏河鮮牦牛乳為原料，以乳糖水解速率(V0)和微生物數(shù)量為評價指標(biāo)，探究牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理參數(shù)，并以乳糖水解率為目標(biāo)對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：牦牛乳經(jīng)適宜條件熱處理能明顯增強外源乳糖酶酶解活性，65 ℃熱處理5 min后酶解乳糖，V0升高49.0%。結(jié)合實際生產(chǎn)需求，乳糖酶解前對牦牛乳分別進(jìn)行高溫短時和低溫長時巴殺處理，確定預(yù)熱處理參數(shù)為85 ℃，13 s；優(yōu)化得到酶解條件為：酶解溫度39 ℃，酶解時間2.4 h，酶添加量2.4 u/mL，乳糖水解率達(dá)(79.7±0.9)%，相比未經(jīng)熱處理牦牛乳中同等條件，酶解率升高11.2%～14.0%，且水解率達(dá)標(biāo)(≥70%)時間縮短0.75 h。

牦牛乳；熱處理；乳糖；酶解；優(yōu)化

牦牛乳是青藏高原獨特的優(yōu)質(zhì)乳源，蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分含量均高于普通牛乳，乳糖平均含量為5.03%，較荷斯坦牛乳高約10%[1-2]。我國是乳糖不耐癥人群大國，健康成年人乳糖不耐受率為92%，兒童乳糖不耐癥發(fā)生率也高達(dá)30%以上[3]，但國內(nèi)乳品工業(yè)中液態(tài)白乳低乳糖化率極低，優(yōu)質(zhì)乳源在傳統(tǒng)加工中未能發(fā)揮其優(yōu)勢和價值，因此，探索牦牛乳低乳糖化技術(shù)，提升其營養(yǎng)價值，發(fā)揮青藏高原地區(qū)牦牛乳優(yōu)質(zhì)潛力極為重要。

酶水解法是目前牛乳低乳糖化最常用的方法[4-5]。荷斯坦牛乳低乳糖化過程中蛋白組成、含量[6]以及金屬離子環(huán)境[7]等因素對外源乳糖酶酶解活性影響顯著。牦牛乳中酪蛋白含量及其膠束結(jié)構(gòu)以及乳球蛋白、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+等成分含量與荷斯坦牛乳間差異[8-9]所導(dǎo)致的二者加工特性不容忽視。

作為液態(tài)乳加工中不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，熱處理過程會導(dǎo)致原料乳發(fā)生一系列物理化學(xué)變化，例如形成不溶性復(fù)合物而產(chǎn)生鹽析，蛋白質(zhì)發(fā)生降解或與其他組分反應(yīng)等[10-11]，上述變化很可能對乳糖酶解過程產(chǎn)生影響。本試驗以甘肅夏河藏區(qū)鮮牦牛乳為原料，探究熱處理對外源乳糖酶酶解活性的影響，并以乳糖水解速率(V0)為紐帶將原料乳熱處理與酶解乳糖過程相聯(lián)系，確定牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理參數(shù)，并在此基礎(chǔ)上，對乳糖酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牦牛乳采自甘南夏河健康牦牛；鮮荷斯坦牛乳采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場；β-半乳糖苷酶(來源于乳酸克魯維酵母3 000 u/g)哈爾濱美華生物科技公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

NRY200恒溫?fù)u床，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HWS26 電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海-恒科科技有限公司；SP-754C紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；GZX-GF101 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛乳熱處理對外源乳糖酶酶解活性的影響

取鮮牦牛乳30 mL，分別在65、75、85 ℃下熱處理5 min后迅速降溫至38 ℃，添加乳糖酶(1 u/mL)進(jìn)行恒溫酶解，并測定乳樣中前20 min內(nèi)每10 min葡萄糖生成量，以葡萄糖增量即乳糖水解速率(V0)大小判定乳糖酶酶解活性。終止酶解反應(yīng)時，向乳中加入等體積12% TCA溶液[12]。相同處理條件下，荷斯坦牛乳為對照組。

1.2.2 牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理參數(shù)確定

取30 mL鮮牦牛乳，其他條件不變，分別考察溫度(70～85 ℃)和時間(8～23s)條件下熱處理對乳中微生物數(shù)量及乳糖水解速率(V0)的影響，確定最佳預(yù)熱處理參數(shù)。

1.2.3 牦牛乳乳糖酶解單因素試驗

取30 mL鮮牦牛乳，熱處理后迅速降至預(yù)定溫度，無菌添加乳糖酶，固定其他因素，分別探究酶解溫度、酶解時間、酶添加量對乳糖水解率的影響；由于乳糖酶最適pH6.5與牦牛乳pH非常接近[13]，故不進(jìn)行pH優(yōu)化。

1.2.3.1 酶解溫度對乳糖水解率的影響

酶添加量為2 u/mL，酶解時間為2.5 h，在酶解溫度分別為28、33、38、43、48 ℃條件下測定乳糖水解率。

1.2.3.2 酶解時間對乳糖水解率的影響

酶解溫度為38 ℃，酶添加量為2 u/mL，酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后測定乳糖水解率。

1.2.3.3 酶添加量對乳糖水解率的影響

酶解溫度為38 ℃，酶解時間為2.5 h，酶添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 u/mL條件下測定乳糖水解率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，依照Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，以A(溫度)、B(時間)和C(E/S)為自變量，進(jìn)行乳糖酶解條件優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

1.2.5 測定方法

葡萄糖含量：參照GB/T 16285—2008《食品中葡萄糖的測定》；菌落總數(shù)：參照GB4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢測菌落總數(shù)測定》；乳糖水解率：參照碘量法[14]測定；乳糖含量：參照SN/T 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定方法》。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.0.6軟件和SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果分析

2.1 牦牛乳熱處理對外源乳糖酶酶解活性的影響

由圖1可知，牦牛乳與荷斯坦牛乳經(jīng)65、75、85 ℃熱處理5 min后，乳糖水解速率V0均升高，牦牛乳中V0增量(26.5%～49.0%)約為荷斯坦牛乳V0增量(9.0%～18.0%)的3倍，說明不同乳源牛乳熱處理對外源乳糖酶的激活效應(yīng)存在差異，且牦牛乳中該效應(yīng)表現(xiàn)更為顯著，65 ℃熱處理5 min后V0可達(dá)1.46 μmolglucose/(mL·min)。JIMéNEZ等[12]發(fā)現(xiàn)，此激活效應(yīng)主要是由于乳清蛋白尤其是β-乳球蛋白受熱變性釋放出大量活性巰基所致。同時，經(jīng)方差分析表明，熱處理程度對牦牛乳V0影響顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，酶解乳糖前，對牦牛乳采取預(yù)熱處理，可以有效提高乳糖酶解效率。

圖1 熱處理對荷斯坦牛乳和牦牛乳中乳糖水解速率(V0)的影響Fig.1 The effect of heating on the lactose hydrolysis rate (V0) of holstein and yak milk

2.2 牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理方式的確定

目前液態(tài)乳常用熱處理方式主要有預(yù)熱殺菌、巴氏殺菌、超巴氏殺菌和UHT滅菌4種[15]。從保護(hù)牦牛乳營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)考慮，本試驗選擇如表2所示的不同條件巴氏殺菌進(jìn)行牦牛乳預(yù)熱處理。

表2 不同形式巴氏熱處理對牦牛乳乳糖水解

研究顯示，原料乳經(jīng)低溫長時和高溫短時巴氏殺菌后酶解乳糖，乳糖水解速率V0無顯著差異(P>0.05)，但相比原料乳有顯著升高(P<0.05)。結(jié)合實際生產(chǎn)需求，選擇高溫短時巴殺作為牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理方式。

2.3 牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理參數(shù)的確定

不同熱處理條件下，乳中微生物數(shù)量變化如表3所示。經(jīng)方差分析表明，熱處理溫度和時間對微生物數(shù)量影響顯著(P<0.05)。70、75、80、85 ℃下持續(xù)8 s，均可使菌落總數(shù)符合我國巴氏乳安全標(biāo)準(zhǔn)[16]。

表3 不同熱處理條件下微生物數(shù)量(對數(shù)值)的變化情況

原料乳經(jīng)不同條件巴殺處理后酶解乳糖，V0變化如圖2。單因素方差分析顯示，熱處理時間和溫度對V0均影響顯著(P<0.05)。在較短熱處理時間內(nèi)，V0隨熱處理強度增大，呈上升趨勢，85 ℃熱處理13 s時V0達(dá)最大，為1.51 μmolglucose/(mL·min)，原因是乳清蛋白變性程度隨熱處理溫度升高而增大[17]，在較高溫度(85 ℃)下乳清蛋白完全變性，釋放出大量活性巰基使乳糖酶活力明顯被激活[12]。延長熱處理時間，V0呈下降趨勢，這可能是由于變性乳清蛋白與酪蛋白膠粒開始發(fā)生聚合，使得乳中活性巰基濃度下降，酶激活效應(yīng)減弱[18]。因此，在乳中菌落總數(shù)符合我國巴氏乳安全標(biāo)準(zhǔn)[16]前提下，85 ℃、13 s更適宜作為乳糖酶解預(yù)熱處理參數(shù)。

圖2 不同條件熱處理對乳糖水解速率(V0)的影響Fig.2 The effect of different conditions of heat treatments on the lactose hydrolysis rate(V0)

2.4 牦牛乳乳糖酶解單因素試驗

2.4.1 溫度對乳糖水解率的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度由28 ℃升高到38 ℃乳糖水解率呈增大趨勢。這是因為，在乳糖酶最適溫度以下升高溫度可有效促進(jìn)酶分子運動，增強與乳糖結(jié)合能力，促使水解率不斷升高[19]。大于38 ℃，隨著溫度上升，水解率快速下降，這是由于，溫度過高使乳糖酶失去部分活性，不能充分酶解乳糖。因此，確定乳糖酶解最適溫度為38 ℃。

圖3 溫度對乳糖水解率的影響Fig.3 The effect of different temperatures on the lactose hydrolysis

2.4.2 時間對乳糖水解率的影響

由圖4可知，隨著酶解時間延長，β-半乳糖苷酶與乳糖反應(yīng)愈加充分，使得水解率不斷上升。酶解2.5 h，水解率>70%，可以滿足乳糖不耐癥患者需求[20]。過度延長酶解時間，會延長生產(chǎn)周期，也可能增加原料乳受污染風(fēng)險，酶解時間以2.5 h為佳。

圖4 水解時間對乳糖水解率的影響Fig.4 The effect of time on the lactose hydrolysis

2.4.3 酶添加量對乳糖水解率的影響

圖5 酶添加量對乳糖水解率的影響Fig.5 The effect of enzyme concentration on the lactose hydrolysis rate

由圖5可知，當(dāng)酶添加量由0.5 u/mL增大至2 u/mL，水解率呈顯著(P<0.05)上升趨勢。因為酶用量增大過程中，酶分子同底物結(jié)合幾率增大，水解率增大。當(dāng)酶添加量大于2 u/mL后，水解率趨于穩(wěn)定(P>0.05)。因為酶添加量較大時，酶分子已經(jīng)結(jié)合了底物的大部分酶切位點，繼續(xù)增加酶用量對酶解反應(yīng)的貢獻(xiàn)減弱。從提高乳糖酶利用率考慮，確定酶添加量為2 u/mL，此時，水解率為76.3%。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化牦牛乳乳糖酶解條件

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，進(jìn)行17組乳糖酶解試驗，結(jié)果見表4。利用Design Expert 8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項回歸方程：

Y=76.44+1.55A+1.88B+4.75C+2.15AB+2.25AC-0.50BC-9.25A2-1.35B2-0.69C2。

2.5.2 回歸模型的建立和分析

表4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及試驗結(jié)果

表5 乳糖水解率回歸模型方差分析表

2.5.3 回歸模型的驗證

牦牛乳乳糖酶解最優(yōu)條件為：溫度38.81 ℃、時間2.44 h、酶添加量2.44 u/mL。此條件下，預(yù)測水解率達(dá)80.2%。根據(jù)實際試驗條件修訂酶解條件為：溫度39 ℃、時間2.4 h、酶添加量2.4 u/mL，并進(jìn)行驗證試驗(n=3)測得乳糖水解率為(79.7±0.9)%，與預(yù)測值非常接近，說明該試驗?zāi)Ｐ涂尚行暂^高，優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.6 優(yōu)化工藝驗證試驗

牦牛乳熱處理(85 ℃，13 s)前后，測定乳糖酶解反應(yīng)底物(乳糖)和產(chǎn)物(葡萄糖)含量。如表6所示，熱處理牦牛乳中乳糖含量與原料乳中相當(dāng)，二者葡萄糖含量均可忽略(<0.01 g/100mL)，表明適宜條件熱處理對牦牛乳中乳糖無直接影響。這與MESSIA[21]等關(guān)于低乳糖荷斯坦牛乳生產(chǎn)加工特性的研究結(jié)果相似。

表6 預(yù)熱處理對牦牛乳中乳糖與葡萄糖含量影響

表7 熱處理乳與原料乳中乳糖水解效果比較

從表7可知，以本試驗所得最佳條件酶解未經(jīng)熱處理牦牛乳中乳糖，測得乳糖水解率為(67.1±0.5)%，相比熱處理乳(85 ℃、13 s)水解率低約11.2%～14.0%。該差異值也高于GREENBERG[22]與KOSIKOWSKI[23]報道的巴氏殺菌處理對荷斯坦牛乳乳糖水解率提升量(5.0%～8.0%)。為進(jìn)一步客觀評價該優(yōu)化工藝，根據(jù)低乳糖乳制品需求[22]，本試驗設(shè)定目標(biāo)水解率為70%，同等酶解條件(酶添加量2.4 u/mL，酶解溫度39 ℃)下，未經(jīng)熱處理牦牛乳乳糖水解率≥70%至少需要2.65 h，然而，按照本試驗優(yōu)化工藝進(jìn)行酶解處理，僅需 1.9 h，比前者用時縮短0.75 h，顯著提高了乳糖酶解環(huán)節(jié)生產(chǎn)效率。

3 討論

研究結(jié)果表明，乳糖水解速率較乳糖水解率能更加客觀、準(zhǔn)確地反映出外源乳糖酶在牦牛乳中活性表現(xiàn)情況。牦牛乳經(jīng)熱處理后酶解乳糖，乳糖水解速率最大時外源乳糖酶酶解活性表現(xiàn)最強，說明此熱處理乳更適宜進(jìn)行乳糖酶解。作為乳糖酶解效果的直觀表現(xiàn)，以乳糖水解率作為指標(biāo)優(yōu)化乳糖酶解條件，更加貼近實際生產(chǎn)需求。同時，通過優(yōu)化工藝驗證試驗將牦牛乳經(jīng)適宜熱處理后乳糖水解速率(V0)增量有效轉(zhuǎn)換為更貼近實際生產(chǎn)的衡量指標(biāo)——乳糖水解率與水解率達(dá)標(biāo)(≥70%)時間，實現(xiàn)了整體研究評價標(biāo)準(zhǔn)的回歸與統(tǒng)一。

4 結(jié)論

牦牛乳熱處理對外源乳糖酶酶解活性具有顯著激活效應(yīng)，85、75、65 ℃熱處理5 min后酶解乳糖，乳糖水解速率增量達(dá)26.5%～49.0%，約為荷斯坦牛乳3倍。依照實際生產(chǎn)條件，優(yōu)化牦牛乳乳糖酶解預(yù)熱處理參數(shù)為85 ℃，13 s，乳糖酶解條件為：溫度39 ℃，時間2.4 h，酶添加量2.4 u/mL，乳糖水解率可達(dá)(79.7±0.9)%。驗證試驗發(fā)現(xiàn)，較未熱處理牦牛乳中同等條件酶解乳糖，此優(yōu)化工藝顯著提高了乳糖酶解效率，有效縮短了酶解時間。

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Optimization of enzymatic hydrolysis of yak milk lactose and preheat treatment process

GUAN Sheng1,2, LIANG Qi1,2*, SONG Xue-mei1,2, HUANG Shao-hai3,ZHANG Yan1,2, WEN Peng-cheng1,2

1(Food Science and Engineering Department of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)2(Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu, Lanzhou 730070, China)3(Lanzhou Xuedun Organism Dairy Produce Co. Ltd., Lanzhou 730050, China)

For a range of issues about heat treatment and lactose enzymolysis of yak milk, using yak milk derived from xiahe town Gansu province as raw material, taking microorganisms and lactose hydrolysis rate (V0) as assessment index, the preheat treatment conditions of lactose enzymolysis were determined. The conditions of lactose enzymolysis were optimized with lactose hydrolysis rate (V0) as index. The results showed that optimal heat treatment of yak milk significantly enhanced exogenous lactase enzyme activity. After enzymatic hydrolysis of lactose at 65 ℃ for 5 min, theV0was up to 49.0%. According to the requirement of actual production, pasteurized treatments using low temperature long time (LTLT) and high temperature short time (HTST) respectively were performed before lactose enzymolysis of yak milk, the condition for lactose enzymolysis was determined as 85 ℃ for 13 s. Response surface analysis (RSA) was applied to optimize the conditions of lactose enzymolysis on the foundation of single-factor experiment. The condition of lactose enzymolysis were determined as follows: enzymolysis temperature was 39 ℃, enzymolysis time was 2.4 h, amount of enzyme was 2.4 u/mL. The lactose hydrolysis rate reached 79.7%±0.9% under the optimized conditions, which was 11.2%-14.0% comparatively improvement comparing with the raw material in the same condition, while the time to meet the standard requirements (≥70%) has been reduced by 0.75 h.

yak milk; heat treatment; lactose; enzymolysis; optimize

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701020

碩士研究生(梁琪教授為通訊作者,E-mail：liangqi@gsau.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目-牦牛乳硬質(zhì)干酪脂肪酸的構(gòu)成特征及氧化調(diào)控機制研究(31660468)；甘肅省高等學(xué)?？蒲许椖?2014A-061)

2016-08-11，改回日期：2016-09-08