朱益波，蔣卓越,2，郭倩，鄭青云，林容天，錢(qián)志浩，齊斌，王立梅*

1(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟，215500)2 (蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州，215000)

重組融合蛋白大腸桿菌不對(duì)稱合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸

朱益波1，蔣卓越1,2，郭倩1，鄭青云1，林容天1，錢(qián)志浩1，齊斌1，王立梅1*

1(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟，215500)2 (蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州，215000)

將來(lái)自于Lactobacillusplantarum的突變D-乳酸脫氫酶(D-LDHY52V)和Candidaboidinii的甲酸脫氫酶(FDH)進(jìn)行融合，重組成雙功能融合蛋白，為生物法合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法。利用重疊延伸PCR技術(shù)，將對(duì)底物苯丙酮酸(PPA)親合力更高的突變蛋白D-LDHY52V與FDH通過(guò)連接肽(Gly4Ser)3融合，將融合基因克隆至表達(dá)載體pET-28a(+)，并轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到高效表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，融合蛋白分子質(zhì)量為79.7 kDa，在重組菌中獲得了正確表達(dá)；酶活性測(cè)定結(jié)果表明，融合蛋白具有D-LDH和FDH的雙重生物學(xué)活性。在不對(duì)稱轉(zhuǎn)化PPA合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸(D-PLA)的應(yīng)用中，融合蛋白體系比D-LDHY52V單獨(dú)表達(dá)體系的D-PLA產(chǎn)量提高了40.71%。通過(guò)5 h底物分批補(bǔ)加發(fā)酵，D-PLA產(chǎn)量為17.34 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為77.64%，生產(chǎn)強(qiáng)度3.47 g/(L·h)。雙功能融合蛋白增強(qiáng)了輔酶再生的效率，有效促進(jìn)了 (R)-2-羥基-3-苯基丙酸的不對(duì)稱合成。

D-LDHY52V；甲酸脫氫酶；融合蛋白；D-3-苯基乳酸；輔酶再生

在食品工業(yè)中，乳酸菌一般被認(rèn)為是安全菌株[1]，它們代謝產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可作為天然的食品防腐劑直接應(yīng)用于食品工業(yè)[2]。2-羥基-3-苯基丙酸，即苯基乳酸(Phenyllactic acid, PLA)作為乳酸菌的代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品中[3]。大量研究表明，苯基乳酸是一種廣譜的抗菌物質(zhì)，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌都有很好的抑制效果[4]，抑菌活性強(qiáng)于一些常用的食品防腐劑，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等[5]。因此苯基乳酸的開(kāi)發(fā)和利用具有廣泛的應(yīng)用前景。

在乳酸菌的代謝過(guò)程中，苯丙氨酸(Phe)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化成為苯丙酮酸(PPA)，然后苯丙酮酸通過(guò)乳酸脫氫酶(LDH)還原生成苯基乳酸[6-7]。乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶被認(rèn)為是將苯丙酮酸還原成苯基乳酸的關(guān)鍵酶[8-9]，在微生物體內(nèi)的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控而導(dǎo)致胞內(nèi)乳酸脫氫酶含量較低，限制了苯基乳酸產(chǎn)量的提高。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)乳酸脫氫酶的工程菌來(lái)提高苯基乳酸產(chǎn)量是極具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N方法。ZHU等[10]將來(lái)自Lactobacilluspentosus的乳酸脫氫酶第52位氨基酸替換成小分子疏水氨基酸后轉(zhuǎn)化大腸桿菌高效表達(dá)，有效提升了乳酸脫氫酶對(duì)非天然底物苯丙酮酸的催化效率和D-PLA的產(chǎn)量。ZHENG等[11]和王穎等[12]分別將來(lái)自于BacilluscoagulansNL01和BacillusmegateriumZ2013513的L-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中表達(dá)，均獲得了高光學(xué)純度的L-PLA。

乳酸脫氫酶是NADH依賴型氧還原酶。催化過(guò)程中需要不斷消耗體系中的還原型輔酶(NADH)[13]，轉(zhuǎn)化反應(yīng)也會(huì)因?yàn)檫€原型輔酶的不足而終止，但是還原型輔酶的額外添加會(huì)顯著增加生產(chǎn)成本。因此開(kāi)發(fā)系統(tǒng)中還原型輔酶再生的方法亦是研究的關(guān)鍵。酶偶聯(lián)法是常用的輔酶再生的方法，在反應(yīng)體系中共表達(dá)底物催化酶和輔酶再生酶，但輔酶在兩個(gè)酶分子間傳遞，游離酶之間的空間距離有可能造成輔酶再生效率不高[14]。利用基因融合技術(shù)構(gòu)建雙功能酶有可能使兩個(gè)酶的活性位點(diǎn)接近，使輔酶在分子內(nèi)高效傳遞從而提高催化效率[15-16]。SüHRER等[17]通過(guò)構(gòu)建酮還原酶與甲酸脫氫酶的融合蛋白體系，在一個(gè)融合蛋白內(nèi)實(shí)現(xiàn)NADH的再生。到目前為止，尚未有將乳酸脫氫酶與甲酸脫氫酶進(jìn)行融合表達(dá)并實(shí)現(xiàn)輔酶再生用于生產(chǎn)苯基乳酸研究的報(bào)道。

研究將來(lái)自于Lactobacillusplantarum的D-乳酸脫氫酶(D-LDHY52V)與來(lái)自博伊丁假絲酵母(Candida

boidinii)的甲酸脫氫酶(FDH)進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建了D-LDHY52V-FDH雙功能融合蛋白，在以苯丙酮酸為底物不對(duì)稱合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸的反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)輔酶因子的原位再生，維持反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，獲得更高產(chǎn)量的(R)-2-羥基-3-苯基丙酸。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

(R)-2-羥基-3-苯基丙酸和苯丙酮酸標(biāo)品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；酵母提取物，胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid公司(英國(guó))；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，硫酸卡那和相關(guān)分子試劑盒購(gòu)自上海生工。所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒

pMD19-T Simple Vector購(gòu)自寶生物公司(大連)；E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)，Candidaboidinii，E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-d-ldhY52V，pET-28a(+)均為實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-d-ldhY52V的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[10]。

1.1.3 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-RAD公司；高速臺(tái)式離心機(jī)德國(guó)Thermo公司；恒溫金屬浴德國(guó)Eppendorf公司；高效液相色譜儀日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 pET-28a-d-ldhY52V-fdh的構(gòu)建

構(gòu)建示意圖如圖1所示。主要過(guò)程如下：通過(guò)2輪PCR，利用特異引物序列(表1)將編碼乳酸脫氫酶的基因以及甲酸脫氫酶基因通過(guò)柔性Linker (GGGGS)3的核苷酸序列連接，并在引物P1F和P4R中分別加入BamH I和XhoI限制性酶切位點(diǎn)。第1次PCR，分別以質(zhì)粒pET-28a(+)-d-ldhY52V和Candidaboidinii基因組為模板，擴(kuò)增出D-LDH和FDH目的片段。PCR 程序?yàn)椋?8 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30～35個(gè)循環(huán)后在72 ℃延伸7～10 min。第2次PCR以經(jīng)凝膠回收的第1次PCR產(chǎn)物作為模板，應(yīng)用Gene-SOEing技術(shù)構(gòu)建d-ldhY52V-fdh融合基因，具體方法如下：由于d-ldhY52V的3’端和fdh的5’端形成了部分重疊鏈，在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸從而將兩段基因拼接起來(lái)，合成全長(zhǎng)的融合蛋白基因。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min，前5個(gè)循環(huán)為98 ℃變性10 s，45 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min；后30個(gè)循環(huán)為98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸10 min，共35個(gè)循環(huán)。在前5個(gè)循環(huán)結(jié)束后加入P1F，P4R。目的片段經(jīng)凝膠回收后通過(guò)雙酶切插入至pET-28a(+)載體的BamH I和XhoI位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后經(jīng)菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 pET-28a-d- ldhY52V-fdh構(gòu)建示意圖Fig.1 Scheme of the construction of pET-28a-d- ldhY52V-fdh

引物名稱引物序列(5’-3’)所含特殊序列P1FCGCGGATCCATGAAAATTATTG-CATATGCBamHI酶切位點(diǎn)P2RGTCAAACTTAACTTGTGTG無(wú)P3FCACACAAGTTAAGTTTGACGGCGGTG-GCGGCAGCGGCGGAGGCGGAAGCG-GAGGCG-GAGGAAGCATGAAGATCGTTTTAGTC連接肽序列P4RCCGCTCGAGTTTaTTTCTTATCGTGTT-TACCGXhoI酶切位點(diǎn)P5CGCGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTCBamHI酶切位點(diǎn)

1.2.1.2 pET-28a-fdh構(gòu)建

以Candidaboidinii基因組為模板，P5和P4R為引物PCR擴(kuò)增fdh。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化，16 ℃過(guò)夜連接至pMD19-T，獲得重組質(zhì)粒pMD19-fdh。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，克隆、提取質(zhì)粒、BamH I和XhoI雙酶切。目的片段經(jīng)凝膠回收后插入pET-28a(+)載體的BamH I和XhoI位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)獲得E.coli BL21(DE3)/pET-28a-fdh。

1.2.2D-LDHY52V-FDH融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及活性鑒定

E.coliBL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh單菌落接種于含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)(約9 h)，按照1%接種于含有相同濃度卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600約0.6時(shí)，添加IPTG濃度至0.6 mmol/L，誘導(dǎo)溫度25 ℃，200 r/min條件下誘導(dǎo)10 h后離心收集菌體，用磷酸緩沖液(pH為7.0)重懸，將菌體沉淀冰浴超聲破碎(超聲3 s，停3 s，持續(xù)10 min)后12 000 r/min離心2 min，取適當(dāng)量上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶酶活測(cè)定。另取適量上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶酶活測(cè)定基本原理是NADH在340 nm處有最大吸收峰，通過(guò)光吸峰值的改變定量測(cè)定酶的含量。乳酸脫氫酶檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)液為：0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH為7.0)，10 mmol/L苯丙酮酸鈉，0.4 mmol/L的NADH。甲酸脫氫酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液：100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)，167 mmol/L甲酸鈉，1.67 mmol/L NAD+。反應(yīng)在30 ℃條件下，連續(xù)測(cè)定反應(yīng)液3 min,在340 nm吸收值的變化。酶活定義為：在30 ℃、pH 7.0的條件下，每分鐘消耗或生成1 μmol NADH所需的酶量為1個(gè)酶活單位(1 μmol/min=1U)。比活力定義為：1 mg粗酶蛋白中酶活力(U/mg)。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)參照Bradford的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.2.3 單批次全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成D-PLA

將經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的菌體離心后，用pH 7.0磷酸緩沖液洗滌2次,重懸于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中(pH 7.0的100 mmol/L的磷酸鉀溶液含有10 g/L PPA，0.2 g葡萄糖，0.07 g甲酸鈉 ),37 ℃，200 r/min轉(zhuǎn)化2 h，定時(shí)取一定量轉(zhuǎn)化液于4 ℃、12 000 r/min離心2 min，將上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，然后用高效液相測(cè)定。色譜條件參考ZHU[10]的方法。同樣條件測(cè)定E.coliBL21(DE3)/p28a-d-ldhY52V菌株對(duì)苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化。

1.2.4 底物分批補(bǔ)加合成D-PLA

將誘導(dǎo)后菌體懸浮于50 mL轉(zhuǎn)化液，菌體干重20 g/L，PPA、葡萄糖和甲酸鈉起始濃度分別為7 g/L，20 g/L和7 g/L。分別在0.5 h添加0.35 g苯丙酮酸，1 h、1.5 h添加0.2 g苯丙酮酸，在2 h、3 h添加0.1 g的苯丙酮酸，使溶液中底物濃度大致維持在8 g/L左右，定時(shí)取樣檢測(cè)，測(cè)定方法如1.2.3所述。

2 結(jié)果與討論

2.1D-ldhY52V-fdh融合基因及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用Over-lap extension PCR法成功構(gòu)建d-ldhY52V-fdh融合基因(圖2a)，測(cè)序結(jié)果表明，融合基因序列與設(shè)計(jì)一致，其中d-ldhY52V基因片段長(zhǎng)996 bp,編碼332個(gè)氨基酸；連接肽(Linker)基因長(zhǎng)45 bp,編碼15個(gè)氨基酸(GGGGS)3，fdh基因長(zhǎng)1 122 bp,編碼374個(gè)氨基酸。融合基因片段定向插入pET-28a(+)表達(dá)載體后提取質(zhì)粒進(jìn)行BamH I/XhoI雙酶切驗(yàn)證(圖2b)。雙酶切的目的DNA片段大小正確，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序分析，無(wú)堿基錯(cuò)配，最終確定重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-d-ldhY52V-fdh構(gòu)建成功。

圖2 凝膠電泳驗(yàn)證Fig.2 Validation by agarosegel electrophoresis(a)Analysis of PCR products by agarosegel electrophoresis. M-DNA marker; 1-PCR product of d-ldhY52V; 2-PCR product of fdh 3-PCR product of d-ldhY52V-fdh (b) Identification of recombinant expression vector pET-28a-d-ldhY52V-fdh. M-DNA Marker; 1-pET-28a-d-ldhY52V-fdh digested with BamH I and Xho I

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及活性檢測(cè)

將重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V，E.coliBL21(DE3)/pET-28a-fdh，E.coliBL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh分別進(jìn)行培養(yǎng)，破碎菌體得到粗蛋白溶液樣品。對(duì)表達(dá)的重組蛋白d-ldhY52V，F(xiàn)DH，D-LDHY52V-FDH進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖3所示。D-LDHY52V的理論值為37 kDa，F(xiàn)DH的理論值為41 kDa，目標(biāo)蛋白為79.7 kDa。由圖3可以看出，重組菌在近80 kDa處有明顯蛋白條帶(圖3，泳道3)，相對(duì)分子質(zhì)量和預(yù)期的大小一致，表明融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)成功。表2列出了從重組菌內(nèi)得到的融合蛋白D-LDH和FDH活性的檢測(cè)結(jié)果。融合蛋白的D-LDH活性只有單獨(dú)表達(dá)的D-LDH的42.97%，融合表達(dá)的FDH的活性和單獨(dú)表達(dá)的FDH活性相近。這些結(jié)果表明，融合蛋白具有D-LDH和FDH雙重生物學(xué)活性，在構(gòu)建的重組菌中得到了成功表達(dá)，并對(duì)苯丙酮酸顯示出催化活力。

M-Maker; 1-crude extract of E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V with induction；2-crude extract of E. coli BL21(DE3)/pET-28a-fdh with induction；3-crude extract of E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh with induction圖3 重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)Fig.3 The analysis of recombinant protein by SDS-PAGE

VariantD-LDHactivity(U/mg)FDHactivity(U/mg)D-LDHY52V104.84±4.19NDFDHND0.38±0.03D-LDHY52V-FDH49.77±5.950.41±0.07

2.3 重組菌批式全細(xì)胞合成D-PLA

對(duì)菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-d-ldhY52V和E.coliBL21(DE3)/pET28a-d-ldhY52V-fdh進(jìn)行單批次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，在反應(yīng)過(guò)程中定時(shí)取樣，考察苯基乳酸生產(chǎn)速率的情況。如圖4所示，表達(dá)融合蛋白的重組菌在轉(zhuǎn)化反應(yīng)初期就具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活力，前10 min內(nèi)累積的D-PLA產(chǎn)量是菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-d-ldhY52V的1.6倍。由此可以看出，具有輔酶NADH再生的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，因?yàn)榉磻?yīng)過(guò)程中輔酶NADH的及時(shí)補(bǔ)充，使合成苯基乳酸的反應(yīng)速率加快。KATHRIN等[18]將3-酮乙基?；d體蛋白還原酶與突變型甲酸脫氫酶進(jìn)行融合后全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化五氟苯乙酮生成五氟苯基乙醇的過(guò)程中，也觀察到類似現(xiàn)象。此外，可以看出單獨(dú)表達(dá)D-LDHY52V的體系在反應(yīng)進(jìn)行到40 min時(shí)，D-PLA的產(chǎn)量基本不再增高，而具有輔因子再生的融合表達(dá)體系因?yàn)檩o酶NADH的持續(xù)供給，轉(zhuǎn)化反應(yīng)能夠維持較長(zhǎng)的時(shí)間，D-PLA單批次產(chǎn)量累積達(dá)到7.13 g/L，較D-LDHY52V的單獨(dú)表達(dá)體系提高40.71%。

圖4 E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V 和 E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh合成D-PLA時(shí)間曲線Fig.4 Time course of batch production of D-PLA by the recombinant E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52Vand E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh

2.4 分批補(bǔ)加底物合成D-PLA

對(duì)于生物催化反應(yīng)而言，底物濃度的高低會(huì)顯著影響反應(yīng)的速度，底物濃度太低時(shí)，酶的活性中心沒(méi)有被完全飽和，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢；而過(guò)高的底物濃度會(huì)對(duì)酶和菌體活性有較大的抑制[19]。為了避免轉(zhuǎn)化過(guò)程中的底物抑制作用，本研究利用分批添加底物方式來(lái)提高D-PLA的產(chǎn)量。轉(zhuǎn)化過(guò)程中各參數(shù)變化如圖5所示，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的初期，PPA快速轉(zhuǎn)化合成D-PLA，反應(yīng)前2 h內(nèi)，菌體保持較高的轉(zhuǎn)化活力，轉(zhuǎn)化率維持在80%以上，D-PLA產(chǎn)量累計(jì)達(dá)到15.14 g/L。2 h以后菌體轉(zhuǎn)化活力下降，D-PLA產(chǎn)量上升緩慢，轉(zhuǎn)化至4 h，D-PLA產(chǎn)量為17.20 g/L。最終，經(jīng)5 h全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，D-PLA產(chǎn)量達(dá)到最大值17.34 g/L，轉(zhuǎn)化率為77.64%，生產(chǎn)強(qiáng)度3.47 g/(L·h)。相比ZHU等[10]報(bào)道的D-LDHY52V的重組菌轉(zhuǎn)化4 h，合成D-PLA產(chǎn)量結(jié)果(15.6 g/L)相比，本研究產(chǎn)量提高了10.12%。和MU等[6]報(bào)道利用菌株Lactobacillussp.SK007底物流加發(fā)酵72 h生產(chǎn)D-PLA(產(chǎn)量17.38 g/L，轉(zhuǎn)化率51.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度0.241 g/(L·h)相比，本研究生產(chǎn)強(qiáng)度與轉(zhuǎn)化率都顯著提高。ZHENG等[20]利用1株嗜熱芽孢桿菌BacilluscoagulansSDM全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)苯基乳酸，獲得產(chǎn)量37.3 g/L，這是此前報(bào)道的生物法生產(chǎn)苯基乳酸的最高產(chǎn)量，但其發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)16 h，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.3 g/(L·h)。與其相比，本研究在產(chǎn)量上仍有待進(jìn)一步提高，但在生產(chǎn)強(qiáng)度方面具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖5 分批補(bǔ)料添加苯丙酮酸鈉生產(chǎn)D-PLA時(shí)間曲線Fig.5 Time course of D-PLA production in fed-batch fermentation with intermittent PPA feeding

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建D-LDHY52V-FDH融合蛋白，經(jīng)過(guò)體外生物學(xué)活性分析，該融合蛋白具有催化苯丙酮酸還原和再生輔因子的雙重生物學(xué)功能。在利用重組菌合成D-PLA時(shí)，融合蛋白體系較D-LDHY52V單獨(dú)表達(dá)體系具有明顯的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)批次添加底物策略，獲得D-PLA最高產(chǎn)量17.34 g/L，轉(zhuǎn)化率77.64%，生產(chǎn)強(qiáng)度3.47 g/(L·h)。本研究構(gòu)建的雙功能融合蛋白為解決酶偶聯(lián)法反應(yīng)體系復(fù)雜、不穩(wěn)定的弊端提供了一個(gè)替代方案，為生物催化法不對(duì)稱合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

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Construction of fusion protein for asymmetric synthesis of (R)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid

ZHU Yi-bo1, JIANG Zhuo-yue1,2, GUO Qian1, ZHENG Qing-yun1,LIN Rong-tian1, QIAN Zhi-hao1, QI Bin1, WANG Li-mei1*

1(Key Laboratory of Food and Biotechnology of Suzhou, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China) 2(Institute of Basic Medical and Biological Sciences,Soochow University, Suzhou 215000,China)

The bifunctional fusion protein system consisting of a mutantD-lactic dehydrogenase (D-LDHY52V) and formate dehydrogenase (FDH) was constructed for asymmetric synthesis of (R)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid and cofactor regeneration. Thed-ldhY52V-fdhgene was constructed with the flexible 15 amino acids linker (Gly4Ser)3by overlap extension PCR, and the final full length product was cloned into the pET-28a(+) vector for protein expression inEscherichiacoliBL21(DE3), wherein protein expression was induced by IPTG. The expression of fusion protein was analyzed through SDS-PAGE. The result showed a specific band of about 79.7 kDa after expression ofE.coliBL21 (DE3) containing plasmid pET28a-d-ldhY52V-fdh, its size was identical with the expected molecular weight of the fusion protein. The specific activity of crude recombinant protein extracts was then found to exhibit bothD-LDH and FDH activity. In asymmetric reductions of phenylpyruvic acid (PPA), cells expressing fusion protein generated 40.71% more of theD-PLA in the batch fermentation compared with cells expressingD-LDHY52V. Fed-batch fermentation was conducted by intermittent feed PPA, after 5 h transformation, the finalD-PLA concentration reached 17.34 g/L with the conversion ratio of 77.64%. Results showed that the fusion proteinD-LDHY52V-FDH was successfully constructed, and it could provide foundation for further study of asymmetric synthesis of (R)-(+)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid with simultaneous cofactor regeneration.

D-LDHY52V; formate dehydrogenase; fusion protein;D-3-phenyllactic acid; cofactor regeneration

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701009

博士，副教授(王立梅教授為通訊作者,E-mail：wlmqb@126.com)。

國(guó)家自然科學(xué)青年基金(31501459)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31470092)；江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(BK20130380)；江蘇省“六大高峰人才”資助計(jì)劃項(xiàng)目(NY-021)；常熟市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CN201412)

2016-06-24，改回日期：2016-08-08