王然然，李曉敏，陳柳，卞小穩(wěn)，蔡國林，陸健*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(上海華潤雪花啤酒(上海)有限公司，上海，200949)

黃酒發(fā)酵過程中乳酸菌的分離及對其產(chǎn)生物胺能力的評價

王然然1,2,3，李曉敏1,2,3，陳柳4，卞小穩(wěn)1,2,3，蔡國林1,2,3，陸健1,2,3*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(上海華潤雪花啤酒(上海)有限公司，上海，200949)

對黃酒釀造過程中乳酸菌進行分離，并對乳酸菌產(chǎn)生物胺能力進行檢測。利用脫羧培養(yǎng)基對分離出的82株乳酸菌進行培養(yǎng)，結(jié)合反相高效液相色譜技術(shù)(reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)測定發(fā)酵液中生物胺含量，具體色譜條件如下：使用丹磺酰氯(Dansyl Chloride，Dns-CL)進行柱前衍生，以乙腈-乙腈(φ=50%)為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，254 nm紫外波檢測。該方法在給定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.996)，平均回收率為94.46%～105.20%，相對偏差(RSD)均小于5%。檢測到組胺產(chǎn)生菌株11株，最大生成量為18.19 mg/L，高產(chǎn)菌株分離自黃酒前酵第2天；酪胺產(chǎn)生菌株28株，最大生成量為30.38 mg/L，高產(chǎn)菌株分離自黃酒前酵第2天；腐胺產(chǎn)生菌株51株，最大生成量為299.94 mg/L，高產(chǎn)菌株分離自浸米水。由此表明，有必要控制黃酒發(fā)酵過程中的乳酸菌，采用低產(chǎn)或不產(chǎn)生物胺的乳酸菌作為強化菌株，可降低黃酒中的生物胺含量。

黃酒；乳酸菌；生物胺；反相高效液相色譜技術(shù)

生物胺(biogenic amine,BAs)是一類含氮的低分子量堿性化合物的總稱，根據(jù)結(jié)構(gòu)可將其分為3類：脂肪類(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)、芳香類(酪胺、苯乙胺等)、雜環(huán)類(組胺、色胺等)。食品中常見的生物胺主要有腐胺、尸胺、組胺、酪胺等[1]。

微量生物胺是人體內(nèi)的正?；钚猿煞?，但也具有潛在毒性。人體攝入過量的生物胺會產(chǎn)生頭痛、心悸、呼吸紊亂等中毒性癥狀，其中，組胺對人體的毒害最大，其次是酪胺。人體攝入過多酪胺和β-苯乙胺會引起偏頭痛；組胺攝入量在8～40 mg，40～100 mg和高于100 mg時，分別會引起輕微、中等和嚴重中毒，如腹部痙攣、嘔吐和腹瀉等癥狀[2]；腐胺、尸胺、精胺和亞精胺雖然未發(fā)現(xiàn)明確的危害，但其與亞硝酸鹽反應(yīng)會生成致癌物質(zhì)亞硝基胺[3]，且腐胺和尸胺的存在會抑制生物胺分解酶活性，從而間接增強組胺和酪胺對于人體健康的危害[4]。一些國家食品中生物胺的限量標準詳見表1，我國尚未規(guī)定酒類中生物胺的限量標準。

表1 不同國家及地區(qū)生物胺的限量標準

注：在酒類中，目前只有葡萄酒限量標準的報道；-沒有文獻報道。

黃酒是我國特有的古老酒種，其富含乳酸菌和曲霉的三邊發(fā)酵過程中會產(chǎn)生許多對人體有益的功能性成分，但同時也會積累大量的生物胺等有害物質(zhì)。研究指出，黃酒中總生物胺的平均含量高達115 mg/L[5]，遠高于世界各國對葡萄酒的限量標準。酒中的乙醇會降低胺類氧化酶活力，體積分數(shù)為12%的乙醇存在時最高可抑制91%的胺類氧化酶活性[6]，從而增強生物胺的毒性。目前，黃酒中檢測到的主要生物胺包括組胺、酪胺和腐胺等，其中，腐胺的檢出率最高，且含量相對較高[7]。

發(fā)酵食品中的生物胺主要由微生物細胞內(nèi)氨基酸的脫羧反應(yīng)形成，以乳酸菌的作用最為突出[1, 8]。然而，乳酸菌是黃酒釀造過程中不可或缺的重要微生物之一，不僅可以抑制雜菌的生長，其主要代謝產(chǎn)物乳酸也是黃酒風(fēng)味物質(zhì)的重要來源。在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵液pH維持在4.0左右，有利于誘導(dǎo)乳酸菌內(nèi)氨基酸脫羧酶的合成[9]，加之黃酒原料中豐富的游離氨基酸，為生物胺的形成提供了大量底物來源。研究表明，乳酸菌積累生物胺的能力具有菌株特異性，即使相同種屬的乳酸菌，其產(chǎn)生生物胺的能力也不盡相同[10-13]。因此，研究黃酒發(fā)酵過程不同階段乳酸菌的組成，檢測各菌株產(chǎn)生物胺的能力，培養(yǎng)馴化發(fā)酵過程中低產(chǎn)生物胺的乳酸菌為優(yōu)勢菌株，將有利于在不影響其風(fēng)味物質(zhì)和發(fā)酵過程的前提下，降低成品黃酒中的生物胺含量。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從黃酒釀造過程中各階段取樣，取浸米水、前酵第2天、后酵第1、4、7、14天的未過濾黃酒(紹興某黃酒廠提供)，4 ℃保存。

1.1.2 試劑

生物胺標準品組胺、酪胺、腐胺以及色譜純試劑丹磺酰氯(Dansyl Chloride，Dns-CL)、乙腈均購自美國Sigma化學(xué)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸提物10 g，牛肉膏5 g，檸檬酸胺2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，CuSO40.28 g，加水至1 000 mL，pH調(diào)至6.2～6.3，1×105Pa滅菌20 min，制備固體培養(yǎng)基質(zhì)時另加15 g瓊脂粉配制。

液體脫羧培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母浸提物5 g，牛肉膏5 g，NaCl 2.5 g，葡萄糖0.5 g，吐溫-80 1 mL，MgSO40.2 g，F(xiàn)eSO40.4 g，檸檬酸銨0.05 g，K2HPO42 g，CaCO31 g，5-磷酸吡多醛0.05 g，L-組氨酸5 g，L-酪氨酸0.4 g，L-鳥氨酸5 g，加水至1 000 mL，pH調(diào)到5.5，1×105Pa滅菌20 min。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

日立Chromaster CM5110高效液相色譜儀(示差檢測器/紫外檢測器);QSC-12T氮吹儀,上海泉島公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器,上海書培實驗設(shè)備有限公司;XMTD-8222型數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;QT-1漩渦混合器,上海琪特分析儀器有限公司;分析天平,梅特勒EL204型;H1850R低溫離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌種分離及分子生物學(xué)鑒定

取工廠浸米水(記為0-n)，前酵第2天(記為1-2-n)，后酵第1天(記為2-1-n)、第4天(記為2-4-n)、第7天(記為2-7-n)、第14天(記為2-14-n)未過濾的黃酒，用濾紙過濾后，梯度稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)，并于各梯度取200 μL分別涂布于含放線菌酮(100 μg/mL)的MRS平板上，放入?yún)捬豕迌?nèi)于30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，在菌落密度適中的平板上挑取單個乳白色，表面光滑，邊緣整齊，不透明的菌落進行編號，挑取編號菌落在MRS培養(yǎng)基上劃線進行傳代培養(yǎng)，反復(fù)劃線至單菌落。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

將單菌株接種于MRS培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)12 h，吸取1 mL菌液，8 000 r/min離心5 min收集菌體，提取基因組DNA。

以各菌株基因組為模板利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA。PCR擴增體系(50 μL)：10×buffer 5 μL；dNTP 4 μL；引物各2 μL；rTaq酶0.6 μL；模板2 μL；加水34.4 μL補充至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。對PCR產(chǎn)物進行測序后(由上海生工生物工程有限公司完成)進行BLAST序列比對，根據(jù)序列同源性確定其種屬信息。

1.2.3 菌體活化及脫羧培養(yǎng)基培養(yǎng)

待試菌株在MRS培養(yǎng)基中活化2次，接種于液體脫羧培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)4 d，每個氨基酸底物做3組平行，利用不添加氨基酸底物的空白培養(yǎng)基作為對照。

1.2.4 反相高效液相色譜檢測生物胺

培養(yǎng)液離心去菌體后，取1 mL上清，加入200 μL飽和Na2CO3溶液，20 μL NaOH溶液(2 mol/L)，2 mL Dns-cL溶液(10 mg/mL丙酮中)，混合后于70 ℃中水浴10 min進行衍生。待混合液冷卻后，加入1 mL氨水(50 mg/mL)終止反應(yīng)。終止反應(yīng)結(jié)束后，加入2 mL飽和NaCl混勻，隨后加入3 mL乙醚進行萃取，室溫下200 r/min振蕩30 min，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min后將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中吹干，最后用1 mL乙腈定容，過0.45 μm偏氟膜后用于高效液相色譜分離檢測。

使用安捷倫ZORBAX Eclipse AXBD-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。采用梯度洗脫，洗脫程序見表2，流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；柱溫：28 ℃；流動相A：乙腈，流動相B：乙腈(φ=50%)。

1.2.5 標準曲線的繪制

準確稱取標準品酪胺、組胺、腐胺各100 mg，用超純水定容至100 mL，制成濃度為1 000 mg/L混合標準儲備液。量取上述標準儲備液，用超純水配制成終濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、30、60、90、120、150、200 mg/L的混合標液。

1.2.6 回收率和精密度實驗

向發(fā)酵液樣品中加入樣品生物胺濃度為80%、100%和120%的標準品。每個添加做6個平行，做空白樣品2份，按照上述衍生方法和色譜條件進行回收率及精密度試驗。

表2 HPLC法檢測生物胺的梯度洗脫程序

2 實驗結(jié)果分析

2.1 實驗菌種分離及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

為了探索黃酒中乳酸菌的微生態(tài)系統(tǒng)組成，在黃酒釀造過程中，取浸米水、前酵、后酵中未過濾的黃酒酒液，分離出82株菌，通過16SrDNA擴增、測序、BLAST比對后得到如表3所示的鑒定結(jié)果，其中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)的乳酸菌，其中乳酸桿菌屬共58株，占絕對優(yōu)勢，明串珠菌屬16株，是除乳酸桿菌屬外的優(yōu)勢菌種，乳球菌4株，此外還有個別魏斯氏菌株。具體實驗結(jié)果見表3以及圖1。

2.2 色譜條件的選擇

參照沈念原[14]等的衍生方法，由于該方法對樣品預(yù)處理采用酸提，不適用于本實驗條件下生物胺的檢測，因此對其方法進行修改：對樣品衍生后加入氨水終止反應(yīng)，并用乙醚抽提，改變流動相和洗脫程序。實驗條件下腐胺的保留時間為20.90±0.02 min、組胺的保留時間為25.12±0.02 min、酪胺的保留時間為32.34±0.00 min。3種樣品均可以在40 min內(nèi)有效分離出來(圖2)，峰形對稱無拖尾。結(jié)果說明3種生物胺的分離效果良好，使用此方法可以實現(xiàn)對3種生物胺的快速準確檢測。

表3 黃酒中分離乳酸菌的鑒定結(jié)果

2.3 方法的線性范圍和檢測限

選擇不同濃度的生物胺標準溶液進行檢測，確定腐胺、組胺的濃度在0～200 mg/L范圍內(nèi)是線性相關(guān)的、酪胺在0～160 mg/L內(nèi)線性相關(guān)。標準品色譜圖見圖2,標準曲線見圖3，其相關(guān)系數(shù)均大于0.996，說明組胺、酪胺和腐胺的峰面積與相應(yīng)濃度呈良好的線性關(guān)系。用信噪比(S/N)為3確定方法檢測限(LOD)，具體參數(shù)見表4。

表4 生物胺標準品線性方程及檢測限(LOD)

2.4 回收率及精密度實驗

回收率及精密度試驗結(jié)果見表5。由表5可以看出酪胺、組胺和腐胺在不同濃度(低、中、高)精密度良好，相對標準偏差(RSD)值均小于5%。Dns-CL衍生物穩(wěn)定，但為了保證實驗結(jié)果準確性，在樣品衍生結(jié)束后最好立即上樣檢測。

圖1 黃酒發(fā)酵不同階段乳酸段菌株分布Fig.1 The distribution of BA producing LAB strains during Chinese rice wine fermentation

1-腐胺(20.95 min);2-組胺(25.11 min);3-酪胺(32.34 min)圖2 生物胺混合標準品(濃度為90 mg/L)色譜圖Fig.2 Chromatogram for a standard mixture of BAs (90 mg/L)

圖3 生物胺含量標準曲線Fig.3 Standard curves of BAs content

2.5 菌體培養(yǎng)液中生物胺含量的測定

采用以氨基酸為底物的培養(yǎng)基對分離的各菌株進行培養(yǎng)，并檢測其產(chǎn)生物胺能力，其部分結(jié)果見表6，黃酒生產(chǎn)各階段產(chǎn)生物胺菌株分布詳見圖4。結(jié)果顯示，產(chǎn)生組胺的菌株有11株(生成量為4.02～18.19 mg/L)，產(chǎn)生酪胺的菌株有28株(生成量為9.20～30.38 mg/L)，產(chǎn)生腐胺的菌株有51株(生成量為20.26～299.94 mg/L)。

表5 生物胺檢測方法的回收率及精密度測定(n=6)

圖4 黃酒生產(chǎn)各階段產(chǎn)生物胺菌株分離分布Fig.4 The distribution of BA producing LAB strains during Chinese rice wine fermentation

菌株腐胺組胺酪胺含量/(mg·L-1)轉(zhuǎn)化率/%含量/(mg·L-1)轉(zhuǎn)化率/%含量/(mg·L-1)轉(zhuǎn)化率/%生物胺總量/(mg·L-1)L.sakei0-4299.946.00nd0nd0299.94L.fermentum1-2-1289.795.80nd0nd0289.79Leu.citreum0-19229.854.60nd0nd0229.85L.curvatus0-18202.434.05nd0nd0202.43L.paralimentarius1-2-11191.693.83nd0nd0191.69L.fermentum2-14-20165.663.312.560.0518.834.70187.06L.sp.1-2-22177.643.55nd0nd0177.64L.sp.2-4-19132.382.652.500.0519.964.98154.84L.fermentum1-2-20123.632.4718.190.362.940.74144.76L.fermentum2-28135.522.71nd0nd0135.52W.sp.2-1-2658.991.183.060.0613.913.4775.96L.fermentum2-1-1444.610.892.690.0515.483.8762.78L.brevis2-4-1520.580.410.000.0023.095.7743.68L.fermentum2-1-1227.470.554.020.084.291.0735.78L.brevis1-2-2924.780.50nd030.387.5955.16L.plantarum2-14-820.260.41nd024.486.1144.74L.fermentum2-7-1422.770.462.600.059.202.3034.57L.fermentum1-2-3216.350.332.220.0415.113.7733.69L.sp.2-14-1329.510.59nd04.131.0333.64L.sp.2-7-919.840.40nd0nd019.84Leu.citreum0-819.440.39nd0nd019.44L.coryniformissubsp.1-2-1319.380.39nd0nd019.38Leu.mesenteroides0-1517.880.36nd0nd017.88Leu.pseudomesenteroides0-516.990.34nd0nd016.99Leu.citreum2-14-1615.820.32nd0nd015.82

注：nd：未檢測到。

3 討論

本文從黃酒發(fā)酵各階段發(fā)酵液中分離出82株乳酸菌，并對其進行了鑒定，主要有乳酸桿菌屬和明串珠球菌屬，乳酸桿菌屬包括發(fā)酵乳桿菌(Lb.fermentum)、植物乳桿菌(Lb.plantarum)、彎曲乳桿菌(Lb.curvatus)、短乳桿菌(Lb.brevis)、棒狀乳桿菌(Lb.coryniformis)等；明串珠菌屬包括檸檬明串珠菌(Leu.citreum)和腸系膜明串珠菌(Leu.mesenteroides)兩種；此外，還存在少量乳球菌和魏斯氏菌。

在黃酒開放式發(fā)酵過程中，來自浸米水、麥曲以及空氣中的乳酸菌均會進入發(fā)酵液，除形成乳酸維持發(fā)酵液的pH外，還可利用原料中的氨基酸進行脫羧反應(yīng)產(chǎn)生生物胺。本文進一步利用改進的RP-HPLC方法對分離的各菌株進行了產(chǎn)生物胺能力的評價。在實驗室培養(yǎng)條件下，檢測到產(chǎn)組胺的菌株11株，其中生成組胺最高菌株為分離自前酵第2天的發(fā)酵乳桿菌(18.19 mg/L，轉(zhuǎn)化率0.36%)；檢測到產(chǎn)生酪胺的菌株28株，其中生成酪胺最高菌株為分離自前酵第2天的短乳桿菌(30.38 mg/L，轉(zhuǎn)化率7.59%)；檢測到能夠產(chǎn)生腐胺的菌株51株，其中生成腐胺最高菌株為分離自浸米水的清酒乳桿菌(299.94 mg/L，轉(zhuǎn)化率6.00%)。在浸米階段，環(huán)境中較多組胺和腐胺生成菌株進入浸米水；在前酵階段，隨著麥曲和浸米水帶入，以及周圍環(huán)境的影響，發(fā)酵液中存在大量組胺、腐胺和酪胺生成菌株；在后酵過程中，發(fā)酵液中組胺生成菌株逐漸減少，但仍存在腐胺和酪胺生成菌株。因此，有必要控制黃酒發(fā)酵過程中的乳酸菌，如采取凈化制曲工藝、對浸米水進行滅菌處理、在前酵過程強化不產(chǎn)生物胺的乳酸菌等手段，實現(xiàn)在不改變?nèi)樗岙a(chǎn)量和發(fā)酵液pH的前提下，降低生物胺的目的。文章中僅是對分離出菌株進行了實驗室條件下的發(fā)酵實驗，未對發(fā)酵過程中各菌株的數(shù)量及生物胺含量進行檢測，這方面有待進一步的研究。

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Detection of biogenic amines produced by lactic acid bacteria isolated from the fermentation process of Chinese rice wine

WANG Ran-ran1,2,3, LI Xiao-min1,2,3, CHEN Liu4, BIAN Xiao-wen1,2,3,CAI Guo-lin1,2,3, LU Jian1,2,3*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122,China) 3 (School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122,China) 4(China Resources Snow Breweries, Shanghai 200949,China)

The performance of biogenic amine (BA) production which was conducted by lactic acid bacteria (LAB) isolated from the fomentation process of Chinese rice wine was explored in this paper. A collection of 82 LAB strains cultured in decarboxylation medium were screened for potential producers and BA content of each medium culture was determined by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) after derivatized with dansyl chloride (Dns-cL). The RP-HPLC analysis for the samples were conducted as follows: mobile phase was a gradient elution program of acetonitrile and acetonitrile (φ=50%) with a flow rate of 1 mL/min and the column effluent was monitored at 254 nm with a UV detector. It turned out that the method for BA production presented good linearity (R2>0.996) at given concentrations and a recovery rate of 94.46%-105.20%, together with a relative standard deviation (RSD) of less than 5%. Furthermore, there were 11 strains detected for histamine production (maximum=18.19 mg/L) and the max-histamine producing strain were isolated on the 2nd day of pre-fermentation. 9 strains for tyramine (maximum=30.38 mg/L) and the max- tyramine producing strain were isolated on the 2nd day of pre-fermentation. 51 strains for putrescine (maximum=299.94 mg/L) and the max-putrescine producing strain were isolated from the rice immersion water. The results suggested that it was necessary to control LAB during Chinese rice wine fermentation to reduce the content of BA.

Chinese rice wine; lactic acid bacteria; biogenic amine; reversed-phase high performance liquid chromatography

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701003

碩士研究生(陸健教授為通訊作者,E-mail: jlu@jiangnan.edu.cn)。

工業(yè)過程高效轉(zhuǎn)化與系統(tǒng)集成的科學(xué)基礎(chǔ)研究，973項目(2013CB733602);黃酒發(fā)酵過程中乳酸菌積累有害胺類物質(zhì)代謝物的機制解析，江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140144);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目

2016-08-04，改回日期：2016-09-18