馬驄毓，張英，馬文彬，李建宏，姚拓*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810016)

黃芪根際促生菌(PGPR)篩選與特性研究

馬驄毓1，張英2，馬文彬1，李建宏1，姚拓1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810016)

為獲得黃芪根際PGPR菌株并明確其促生特性，可為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)，本研究以黃芪的根瘤、根系及根際土壤為材料，利用選擇性培養(yǎng)基分離篩選根瘤菌與溶磷菌，測定根瘤菌固氮酶活性、溶磷菌株的溶磷能力及分泌3-吲哚乙酸(IAA)的能力，從中篩選出綜合性能優(yōu)良的菌株，并運(yùn)用生理生化鑒定和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法鑒定優(yōu)良菌株的種屬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶磷菌數(shù)量的分布具有根系表面(RP)>根表土壤(RS)>遠(yuǎn)根土(NRS)>根內(nèi)(HP)的規(guī)律，有明顯的根際效應(yīng)；經(jīng)分離純化獲得76 株P(guān)GPR菌，其中根瘤菌1株、溶解無機(jī)磷菌株42 株和溶解有機(jī)磷菌株33 株，其中可分泌IAA能力的溶磷菌株有7株；篩選出綜合性能優(yōu)良，有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用潛力的溶磷菌株7株，根瘤菌1株，經(jīng)鑒定溶磷菌中3株為Pseudomonassp.，3株為Bacillussp.和1株為Klebsiellaoxytoca，根瘤菌為Rhizobiumsp.，這為研制生物菌肥提供優(yōu)良菌種，同時(shí)豐富優(yōu)良根際促生菌資源庫。

黃芪；根際促生菌(PGPR)；促生特性；菌株鑒定

黃芪(Astragalusmembranaceus)是常用的大宗中藥材之一，具有利尿消腫、固表補(bǔ)氣、生肌托毒之功效，在臨床各科中都有廣泛的應(yīng)用，中成藥中，以黃芪為原料的達(dá)200余種，因此有“十藥八芪”之譽(yù)[1]。國內(nèi)市場對(duì)黃芪的需求量極大，年產(chǎn)量(人工栽培)達(dá)230000 t之多，其中用于飲片生產(chǎn)和深加工(包括提取物、制劑、中成藥)各半[2]。我國也是世界上唯一的黃芪出產(chǎn)國和出口國，在國際植物藥材市場上占有重要地位，黃芪是我國中藥材出口中排在1000萬美元的7個(gè)品種之首[3]。強(qiáng)勁的需求導(dǎo)致了野生黃芪資源的枯竭，栽培黃芪是目前商品黃芪的主要來源。近些年來黃芪價(jià)格居高不下，農(nóng)民大量施用化肥以追求較高的產(chǎn)量，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在黃芪主產(chǎn)區(qū)甘肅省的渭源、隴西、岷縣、宕昌等地，黃芪種植過程化肥施用量普遍很大，這不僅推高了生產(chǎn)成本，而且大量的化肥施用造成土壤板結(jié)、土壤功能退化以及微生態(tài)失調(diào)，影響了可持續(xù)發(fā)展；此外，化學(xué)肥料的大量使用也為藥品安全帶來了巨大的隱患。因此，探尋其他更為安全環(huán)保的增肥劑以部分替代化肥的作用，實(shí)現(xiàn)高效益的循環(huán)農(nóng)業(yè)已迫在眉睫。

近些年研究表明，植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR或促生菌)不但可以固定空氣中的氮?dú)?，同時(shí)一些菌還兼具溶解土壤中不能被植物直接利用的磷元素，分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)植物根系生長和礦物質(zhì)吸收，增強(qiáng)植物抗病性的功能[4]。用從不同環(huán)境、不同植物群落根際分離獲得的特定促生菌株生產(chǎn)的生物菌肥與化肥相比具有成本低、使用安全、持續(xù)效果好、增產(chǎn)穩(wěn)定、非再生能源消耗少、經(jīng)濟(jì)效益高、無環(huán)境和食品污染等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，還可改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和改良鹽堿地[5-6]。縱觀世界生物肥料研究與應(yīng)用現(xiàn)狀，發(fā)達(dá)國家(如美國)仍然是世界上研究、生產(chǎn)和使用生物肥料的大國。我國化肥年產(chǎn)量、總產(chǎn)量和單位面積使用量均居世界第一，而微生物肥料年生產(chǎn)量不足化肥的1‰，且品種單一。雖然國外已有規(guī)?；拇偕十a(chǎn)品，但不同生境的植物根際生存著不同的菌株，而不同菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性不同。因此，只能借鑒國外的成功經(jīng)驗(yàn)，從我國特定氣候、植物及生境中不斷地分離篩選高效菌株，以生產(chǎn)出適合我國特定氣候、植物及生境的生物菌肥[7-9]。

綜上所述，篩選黃芪根際PGPR菌，并將其運(yùn)用于黃芪專用生物肥料的研制和生產(chǎn)，不僅對(duì)促進(jìn)我國黃芪種植業(yè)發(fā)展具有重要意義，而且對(duì)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪，選取隴芪一號(hào)。樣品采集于2014年7月，采樣地位于甘肅省渭源縣會(huì)川鎮(zhèn)。采集生長健壯、無病蟲害、結(jié)瘤正常且呈粉紅色的黃芪根瘤及黃芪根際(根系和土壤)樣品，裝入無菌采樣袋中低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行PGPR 菌株分離。

1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基用于分離和保存根際細(xì)菌[10]；酵母菌形態(tài)瓊脂(YMA)培養(yǎng)基用于根瘤菌的分離與純化[11]；PKO(Pikovskaya)培養(yǎng)基用于溶解無機(jī)磷菌株的分離與純化[12]；蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基用于溶解有機(jī)磷菌株的分離與純化[10,13]；纖維素(CCM)培養(yǎng)基用于植物生長激素(IAA)的測定[12,8]。具體組成如下：

LB培養(yǎng)基組成：蛋白胨 10 g；NaCl 5 g；酵母膏 5 g；瓊脂 18 g；總體積1000 mL；pH 7.0～7.2。

YMA培養(yǎng)基配方：CaCO33 g；K2HPO40.5 g；酵母粉 1 g；NaCl 0.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g； 甘露醇 10 g； 0.25%剛果紅10 mL；瓊脂(agar) 18 g；總體積1000 mL；pH 7.0～7.2。

PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基組成：NaCl 0.5 g；KCl 0.2 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；Ca3(PO4)23 g；(NH4)2SO40.1 g；FeSO4(微量)0.004 g/L；MnSO4(微量)0.004 g/L；蔗糖 10 g；酵母膏 0.5 g；瓊脂(Agar)18 g；總體積 1000 mL；pH 7.0～7.2。

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基組成：葡萄糖(glucose) 10 g； (NH4)2SO40.5 g； NaCl 0.3 g； KCl 0.3 g； FeSO4·7H2O 0.03 g；MnSO4·4H2O 0.03 g；蛋黃卵磷脂(lecithin) 0.2 g；CaCO35 g；酵母膏(yeast extract paste) 0.4 g；瓊脂(agar) 18 g；總體積 1000 mL；pH 7.0～7.5。

CCM培養(yǎng)基及組成：MgSO4·7H2O 0.2 g； KH2PO40.2 g；甘露醇5 g； K2HPO40.8 g； CaCl2·2H2O 0.06 g；蔗糖5.0 g；NaMoO4·2H2O 2.5 mg；酵母粉 0.1 g；乳酸 0.5 mL；NaCl 0.1 g；1.64%乙二胺四乙酸鈉鐵(Na·Fe·EDTA) 4 mL；總體積 1000 mL；pH 7.0(注：滅菌時(shí)將MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和EDTA分開滅菌，否則會(huì)產(chǎn)生沉淀)。

1.3 根瘤菌分離純化

將所采集新鮮的黃芪根瘤置于培養(yǎng)皿中，用無菌水洗凈，用0.1%升汞消毒3 min后，用無菌水沖洗3～4次，用扁平的鑷子壓破上述滅過菌的根瘤，在YMA平板上點(diǎn)接或劃線后，將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，分離得到的菌株進(jìn)一步純化保存于冰箱中備用。

1.4 根瘤固氮菌固氮特性測定

色譜條件：玻璃柱內(nèi)徑 0.4 cm，長2 m，擔(dān)體為 GDX-502，檢測器溫度 170 ℃，進(jìn)樣器溫度 150 ℃，柱溫 180 ℃，氣體流量：空氣 0.15 kg/cm，N20.3 kg/cm，H20.08 kg/cm，檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)。

根瘤樣品測定：用橡膠塞封口裝有約0.2～1.0 g新鮮根瘤的小玻璃瓶。先用注射器從瓶中抽出1 mL空氣，再向瓶中注入1 mL乙炔氣。在28 ℃條件下使根瘤與乙炔氣體反應(yīng)1 h后。用微量進(jìn)樣器從每個(gè)小瓶中抽取50 μL氣體注入氣相色譜儀(GC 7890F)。測定后稱取根瘤重量。

酶活計(jì)算：乙炔還原活性測定固氮酶活性，也稱ARA法[14]。

1.5 溶磷菌分離純化

將根際分為4個(gè)部分，即根表土壤(soil adhering to roots, RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots, RP)、遠(yuǎn)根土(soil away from roots, NRS)與根內(nèi)(histoplan or interior of roots, HP)4個(gè)區(qū)域[12]。

稱取樣品2 g，置于50 mL離心管中，注入18 mL 0.85% 無菌生理鹽水，振蕩2 min并靜置后即為10-1根表土壤稀釋液，然后依次制備成濃度為10-3、10-4及10-5的稀釋液，備用。

用微量移液器分別吸取50 μL上述已制備好的4個(gè)根系區(qū)域的10-3、10-4和10-5稀釋液，接種于滅菌的PKO平板培養(yǎng)基上，立即用無菌玻璃涂布器涂抹均勻，每區(qū)域的每個(gè)濃度均重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)5～7 d后觀察，用接種針挑取具有溶磷透明圈的菌落在PKO平板上以劃線法純化細(xì)菌，并在LB斜面培養(yǎng)基上接種于4 ℃冰箱中保存。

1.6 溶磷菌溶磷能力測定

1.6.1 定性測定 將活化后的菌株點(diǎn)接種于PKO固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，在7～10 d時(shí)觀察每菌株是否出現(xiàn)溶磷透明圈，并測量每菌株溶磷圈直徑(diameter of phosphate solution, D)和菌落直徑(diameter of colony, d)的比值(D/d)，由比值大小初步判定菌株的溶磷能力。

1.6.2 定量測定 在已滅菌的PKO培養(yǎng)液中接種0.5 mL各菌株菌懸液(OD值為0.5)。每菌株3 次重復(fù)，不接種為對(duì)照。28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)12 d后，用酸度計(jì)測定各個(gè)培養(yǎng)液pH 值，后將培養(yǎng)液在10000 r/min、4 ℃離心15 min后，取其上清液5 mL于150 mL錐形瓶中并加入45 mL 0.5 mol/L NaHCO3和約1.5 g無磷活性炭，封口振蕩 30 min，無磷濾紙過濾。在50 mL容量瓶中加入濾液1 mL、0.5 mol/L NaHCO35 mL以及蒸餾水約30 mL，最后加入5 mL鉬銻抗顯色劑，定容搖勻。顯色30 min后，進(jìn)行比色，測定700 nm下的吸光度，計(jì)算磷濃度(μg/mL)。

1.7 溶磷菌分泌植物激素(IAA、GA)能力測定

配制含1 g/L 硝酸銨和100 mg/L 色氨酸的CCM 液體培養(yǎng)基，分裝于150 mL 錐形瓶中，滅菌后接種供試菌株的菌懸液(108cfu/mL)1 mL，每菌株重復(fù)3次，不接種為對(duì)照。將接種后的培養(yǎng)液于28 ℃，125 r/min搖床上培養(yǎng)12 d待用。

1.7.1 定性測定 在白色比色板上滴加上述培養(yǎng)液50 μL，加等量的Spot 比色液，另取50 μL IAA標(biāo)樣(50 μg/mL)與等量比色液混合作為對(duì)照。比色板在黑暗條件下靜置10 min后觀察混合液顏色變化。與對(duì)照相比(對(duì)照為粉紅色)，若出現(xiàn)粉紅色，說明菌株具有分泌IAA能力，且顏色越深，其分泌IAA的能力相對(duì)越強(qiáng)；否則判定菌株不具有分泌IAA能力。

1.7.2 定量測定 將培養(yǎng)液于4 ℃，10000 r/min下離心10 min，收集上清液于錐形瓶中，調(diào)pH值至2.8。用乙酸乙酯萃取后轉(zhuǎn)入50 mL磨口燒瓶中，置于30 ℃真空蒸發(fā)濃縮近干，用甲醇溶解并定容至2 mL。0.45 μm有機(jī)系濾膜后于液相色譜儀上測定。色譜條件：溫度 25 ℃；流動(dòng)相為甲醇∶0.6%乙酸 (45∶55，V/V)(使用前過0.45 μm有機(jī)系濾膜)；流速0.6 mL/min；紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL。色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱，規(guī)格：4.6 mm×150 mm，填料細(xì)度：5 μm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制的標(biāo)液經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾，進(jìn)樣10 μL，獲得不同濃度時(shí)IAA 和GA的峰面積并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 PGPR菌株鑒定

1.8.1 溶磷菌形態(tài)觀察 將供試菌株接種于LB培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)，觀察記錄各細(xì)菌菌落形狀、大小、生長速度、顏色及邊緣形狀度等特征。

1.8.2 細(xì)菌生理生化特性測定 細(xì)菌生理生化測定方法參考文獻(xiàn)[15-17]。

1.8.3 細(xì)菌16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

1)細(xì)菌總DNA的提取：參照試劑盒說明書方法。

2)DNA濃度的測定：紫外分光光度法。

3)DNA純度分析：瓊脂糖凝膠電泳法。

4)16S rDNA擴(kuò)增。選用擴(kuò)增引物：選取16S rDNA擴(kuò)增的通用引物27F-1492R(由上海生工生物科技公司合成)，其序列分別為27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3；PCR 擴(kuò)增條件：擴(kuò)增反應(yīng)由梯度PCR儀完成；反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考馬文彬[15]；檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：由瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；序列測定：擴(kuò)增產(chǎn)物的測序工作由上海生工生物科技公司完成。

5)DNA序列分析：將測得的序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中用 megablast進(jìn)行相似性搜索，與已報(bào)道細(xì)菌菌株的 16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較，并利用MEGA 5.0 生物學(xué)軟件構(gòu)建進(jìn)化距離樹圖，用 Neighbor-Joining 法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，采用 SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪根瘤及溶磷菌的分離純化

如表1所列，利用YMA培養(yǎng)基從黃芪根瘤中分離得到1株根瘤菌優(yōu)勢(shì)菌株，同時(shí)利用PKO 和蒙金娜選擇培養(yǎng)基從黃芪根際分離出了生長速度快、菌落較大，且具有溶解有機(jī)磷、無機(jī)磷功能的菌株。純化后獲得菌株76株，其中根瘤菌1株，溶解無機(jī)磷菌株42株，溶解有機(jī)磷菌株33株。除根瘤菌外，其余菌株在根際不同部位數(shù)量不同，但均表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>遠(yuǎn)根土(NRS)>根內(nèi)(HP)的數(shù)量分布規(guī)律，即表現(xiàn)出很強(qiáng)的根際效應(yīng)。

表1 黃芪根際促生菌株來源及分布Table 1 Source and distribution of A. membranaceus rhizosphere strains

2.2 根瘤固氮酶活性

圖1 乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of C2H4

如圖1所示，用不同濃度的乙烯混合氣體作為橫坐標(biāo)，峰面積值作為縱坐標(biāo)作圖，得到下列乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中回歸方程為y=15078x-17177，相關(guān)系數(shù)值為0.9999，說明此測量值與擬合得到的公式之間的接近程度較好，公式較可靠。黃芪植株根瘤顏色呈粉紅，說明其為有效根瘤。通過乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性為11.21 μmol C2H4/(g·h)。

2.3 溶磷菌溶磷能力

2.3.1 菌株溶解無機(jī)磷能力 選取溶磷圈較大，生長速度較快的16株菌株，測定其溶磷量并研究其溶解無機(jī)磷的能力。結(jié)果如表2所列，通過溶磷圈法定性測定菌株的溶磷圈大小發(fā)現(xiàn)，各菌株D/d值在1.89～3.61之間，D/d值最大的菌株為HRW-31，達(dá)3.61，最小的菌株是HRW-14，其D/d值僅為1.89。利用鉬銻抗比色法對(duì)磷進(jìn)行定量測定的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)供試的16株菌均具有溶解無機(jī)磷的能力，不同菌株的溶磷能力不同，溶磷量在45.21～423.84 μg/mL之間，各菌株溶磷能力差異顯著(P<0.05)。其中溶磷量最大的是菌株HRW-41，達(dá)423.84 μg/mL，溶磷量最小的是菌株HRW-14，其溶磷量為45.21 μg/mL。

注：D/d為溶磷圈直徑比菌落直徑。下同。

Note: D/d means ratio of phosphate solution diameter and colony diameter. The same below.

2.3.2 菌株溶解有機(jī)磷能力 選取溶磷圈較大，生長速度較快的10株菌進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，研究其溶解有機(jī)磷的能力。通過測定分離自黃芪根際的溶有機(jī)磷菌的溶磷量，結(jié)果表明(表3)，通過溶磷圈法定性測定菌株的溶磷圈大小發(fā)現(xiàn)，各菌株D/d值在1.36～3.65之間，D/d值最大的菌株為HRY-7，達(dá)3.65，最小的菌株是HRY-12，其D/d值僅為1.36。定量測定的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)供試的10株菌均具有溶解有機(jī)磷的能力，不同菌株的溶磷能力不同，溶磷量為5.92～31.52 μg/mL之間，各菌株溶磷能力差異顯著(P<0.05)。其中溶磷量最大的菌株為HRY-7，達(dá)31.52 μg/mL，最小的菌株是HRY-12，為5.92 μg/mL，這一趨勢(shì)與D/d的一致。

表3 菌株溶解有機(jī)磷能力測定Table 3 Capacity of strains on organic culture medium

表4 溶磷菌株分泌IAA和GA的數(shù)量Table4 ConcentrationofIAAandGAofphosphatesolubilizationstrains菌株號(hào)Strains顯色反應(yīng)Chromogenicreaction3-吲哚乙酸IAA(μg/mL)赤霉素GA(μg/mL)HRW-12---HRW-13+-8.02HRW-16+++15.9210.84HRW-31++21.627.21HRW-36+14.57-HRW-41+++9.82-HRW-24---HRY-1+++28.519.52HRY-7++12.348.52HRY-28--- 注:IAA顯色反應(yīng)中,-、+、++和+++符號(hào)表示不顯色、淺紅色、粉紅色和深紅色。 Note:-,+,++and+++indicatenocolourandredcolourtakeitsturesfromlighttoheavy.

2.4 溶磷菌分泌IAA和GA

選取溶磷能力較好的10株菌株,利用Spot比色法和高效液相色譜法測定其分泌IAA、GA能力。結(jié)果表明(表4),利用比色法測定有7株供試菌株出現(xiàn)了顯色反應(yīng),其中有6株具分泌IAA能力,5株具分泌GA能力。但并不是所有顯色反應(yīng)的菌株均具分泌IAA能力;不同菌株分泌IAA量及GA量不同,其中有4株菌既具有分泌IAA能力,也兼具分泌GA 的能力。

2.5 菌株鑒定結(jié)果

2.5.1 生理生化鑒定結(jié)果 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果,選取總體性能較好的7株溶磷菌HRW-13、HRW-16、HRW-31、HRW-36、HRW-41、HRY-1、HRY-7及1株根瘤菌H-GL進(jìn)行鑒定。根據(jù)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合菌株革蘭氏染色特性、菌落特征(表5～7),查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]得到結(jié)果,經(jīng)鑒定HRW-13、HRW-31、HRW-41為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.),HRW-16、HRW-36和HRY-7為芽孢桿菌屬,HRY-1暫無法確定,H-GL為根瘤菌屬。

2.5.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 綜合生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本研究中所分離的菌株形態(tài)及生化鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果能很好地吻合，說明本研究的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。鑒定結(jié)果如表8和圖2、3所示，H-GL為根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)，7株溶磷菌分別屬于3個(gè)屬6個(gè)種，其中，HRW-13、HRW-31和HRW-41為假單胞菌屬，HRY-7、HRW-36和HRW-16為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，HRY-1為克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。

表5 各菌株的表型特征及革蘭氏染色結(jié)果Table 5 Colony morphologies and gram staining of strains

注：革蘭氏染色法中，G+表示陽性、G-表示陰性。

Note: G+means positive and G-means negative in Gram staining method.

表6 菌株生理生化反應(yīng)結(jié)果(一)Table 6 Physio-biochemical characteristics of strains (1)

注：表格中的符號(hào)與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》保持一致，“+”代表該反應(yīng)為陽性，“-”代表該反應(yīng)為陰性。下同。

Note: Symbols in the table as same as Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (eighth edition) and Common Bacteria Identification Manual, “+” on behalf of the reaction is positive, “-” on behalf of the reaction is negative. The same below.

表7 菌株生理生化反應(yīng)結(jié)果(二)Table 7 Physio-biochemical characteristics of strains (2)

表8 優(yōu)良PGPR菌株鑒定結(jié)果Table 8 Identification of PGPR

圖2 所分離的根瘤菌株分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the isolated rhizobium strains

圖3 所分離的溶磷菌株分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated phosphate solubilizing bacteria strains英文名稱后的序號(hào)為登錄號(hào)。The serial number which were in the back of English names were accession number.

3 討論

國內(nèi)外的很多研究者在篩選高效溶磷菌株的過程中，以溶磷圈的有無及大小為標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株溶磷能力的有無及高低[18-19]。但本研究中發(fā)現(xiàn)，溶磷圈的大小和溶磷量不完全呈正相關(guān)，也有學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象[10,20-22]，分析其原因是菌株的溶磷機(jī)理的復(fù)雜性[23]，溶磷圈的出現(xiàn)主要是體現(xiàn)溶磷微生物產(chǎn)酸而造成的，現(xiàn)有研究表明，產(chǎn)酸是微生物溶磷的主要途徑[24]，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)包括葡萄糖酸、2-酮戊二酸、乳酸、草酸、氨基酸、延胡索酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機(jī)酸[25]和H2S、H2SO4等無機(jī)酸[26]，在酸類物質(zhì)作用下，培養(yǎng)基中Ca3(PO4)2或CaCO3等成分溶解，出現(xiàn)溶磷圈；但除了產(chǎn)酸外，微生物還通過酶解作用和蛋白質(zhì)作用[27]溶解土壤中的難溶性磷，因此，溶磷圈的大小并不能完全反應(yīng)溶磷能力的高低。本研究中，以溶磷圈法作為定性測定，鉬銻抗比色法作為定量測定，兩個(gè)相結(jié)合，來確定菌株的溶磷能力，能降低誤差。

土壤中生存有多種根瘤菌，豆科植物根際也有大量根瘤菌，對(duì)根瘤菌的分離方法有多種，但是最直接有效的分離方法則是采集生長良好的豆科植物，選取個(gè)大、飽滿并帶粉紅色的根瘤在相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，本研究利用該方法從黃芪根瘤中分離出1株根瘤菌。由于利用豆科共生固氮的植物種類只占豆科植物種類的1%，而其中僅對(duì)15%的種進(jìn)行過結(jié)瘤調(diào)查[28]，因此，豆科植物優(yōu)良根瘤菌的選育以及開發(fā)利用未知的根瘤菌資源具有巨大潛力。

本研究在分離、純化具有固氮能力、溶解無機(jī)磷和溶解有機(jī)磷能力菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)各菌株數(shù)量均表現(xiàn)出“根表>根表土>遠(yuǎn)根土>根內(nèi)”的根際分布趨勢(shì)，此研究結(jié)果與馬文文等[29]、張英[30]以及趙小蓉等[20-21]的研究結(jié)果相一致，由此說明PGPR菌株在土壤中的數(shù)量除了受土壤理化性質(zhì)、肥力、類型及其耕作措施等因素外，PGPR菌的分布同時(shí)也受植物強(qiáng)烈的根際效應(yīng)的影響。據(jù)此可以推測，不同植物根際促生菌的組成必然不同，因此，要開發(fā)效果良好的促生菌產(chǎn)品，就必須從相應(yīng)環(huán)境中相應(yīng)植物的根際分離，當(dāng)然，選育出適應(yīng)性廣的優(yōu)良菌株也是一個(gè)好的研究方向。

除本研究的固氮、溶磷、分泌生長素等功效外，PGPR另外一個(gè)重要的功能就是用于防治農(nóng)作物病害[31]。用于生防研究的細(xì)菌中，假單胞桿菌(Pseudomonassp.)是研究報(bào)道最多的一種生物防治細(xì)菌，它們大量存在于植物根際，繁殖迅速、能分泌嗜鐵素和抗生素，而成為植物位點(diǎn)和空間微環(huán)境的有力競爭者，從而對(duì)多種植物病原菌有抑制作用。孫廣正等[31]研究發(fā)現(xiàn)促生菌LHS11對(duì)黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporiumf. sp.cucumerinum)、西瓜尖鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.niveum)抑制效果達(dá)80%以上，具有較好的應(yīng)用潛力。而本研究分離出的Pseudomonassp.和Bacillussp.，參考前人文獻(xiàn)推測其有拮抗病原菌的潛力，這一方面研究將是下一步工作的重點(diǎn)。此外，本研究中分離獲得一株只在韓國土壤環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的韓國叢毛假單胞菌(Pseudomonaskoreensis)，這證明該種群具有更廣泛的地理分布性[32]。

4 結(jié)論

黃芪根際有大量PGPR菌，分布特征表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>遠(yuǎn)根土(NRS)>根內(nèi)(HP)的根際效應(yīng)；最終獲得76 株P(guān)GPR菌，其中根瘤菌1株，溶解無機(jī)磷42 株，有機(jī)磷33 株；優(yōu)良菌株中，有分泌IAA能力的菌株7株。篩選出綜合性能優(yōu)良，有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用潛力的菌株7株，經(jīng)鑒定其中3株為Pseudomonassp.，3株為Bacillussp.，Klebsiellaoxytoca1株；黃芪PGPR菌分布呈根際效應(yīng)，最終篩選出7 株綜合性能良好、有進(jìn)一步開發(fā)利用價(jià)值的PGPR。

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Identification of plant growth promoting rhizobacteria Astragalus membranaceus and their effectives

MA Cong-Yu1, ZHANG Ying2, MA Wen-Bin1, LI Jian-Hong1, YAO Tuo1*

1.CollegeofPratacultureScience,GansuAgriculturalUniversity；KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation；Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China; 2.DepartmentofGrasslandScience,AgricultureandAnimalHusbandryCollege；StateKeyLaboratoryofPlateauEcologyandAgriculture,QinghaiUniversity,Xining810016,China

In order to obtain and study the performance of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) inAstragalusmembranaceus, the root nodule, root morphology and rhizosphere soil ofA.membranaceuswere collected. Strains of rhizobium and phosphate solubilizing bacteria were isolated and assessed for the potentially useful characteristics of high nitrogenase activity in the rhizobium and high phosphate solubilisation and ability to secrete 3-indoleacetic acid (IAA) in the phosphate solubilizing bacteria. Potential PGPR strains were then identified using physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. Results showed there are large amounts of phosphorus-dissolving bacteria in the rhizospheres ofA.membranaceus. The quantitative distribution of bacteria and PGPR shows a strong rhizosphere effect, with rhizosplan or surface of roots (RP)>soil adhering to roots (RS)>soil away from roots (NRS)>histoplan or interior of roots (HP). We have isolated 76 PGPR strains, composed of 1 rhizobium, 42 inorganic phosphate solubilizing and 33 organic phosphate solubilizing bacteria strains. There are 7 phosphate solubilizing strains with the ability to secrete IAA. A further 8 potential PGPR strains were identified (1 rhizobium and 7 phosphate solubilizing). 3 phosphate solubilizing strains were identified asPseudomonassp., 3 phosphate solubilizing strains asBacillussp., 1 phosphate solubilizing strain asKlebsiellaoxytoca, 1 rhizobium strain asRhizobiumsp. This study has identified potential PGPR for the development of microbial fertilizers forA.membranaceus.

Astragalusmembranaceus; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); characteristics of the growth; strains identification

10.11686/cyxb2016263

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-27；改回日期：2016-10-19

國家自然基金(31360584和31260025)資助。

馬驄毓(1987-)，女，甘肅蘭州人，在讀博士。E-mail:1401893955@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yaotuo@gsau.edu.cn

馬驄毓, 張英, 馬文彬, 李建宏, 姚拓. 黃芪根際促生菌(PGPR)篩選與特性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(1): 149-159.

MA Cong-Yu, ZHANG Ying, MA Wen-Bin, LI Jian-Hong, YAO Tuo. Identification of plant growth promoting rhizobacteriaAstragalusmembranaceusand their effectives. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 149-159.