李曉瑩，郭希民，郭紅延，潘凌亞

論 著

血小板衍生生長因子C對體外培養(yǎng)的人卵巢透明細胞癌細胞的增殖和趨化作用

李曉瑩1，郭希民2，郭紅延3，潘凌亞1

目的 觀察血小板衍生生長因子-C(platelet-derived growth factor-C,PDGF-C)對體外培養(yǎng)的人卵巢透明細胞癌(ovarian clear cell carcinoma,OCCC)ES-2細胞的增殖和趨化作用。方法 體外培養(yǎng)ES-2細胞，添加不同濃度的PDGF-C進行干預(yù)，應(yīng)用CCK8試劑盒法評價細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，利用Transwell細胞遷移實驗、細胞劃痕實驗測定細胞遷移能力。結(jié)果 與未加PDGF-C的對照組相比，PDGF-C能明顯刺激ES-2細胞的增殖，在第4天增殖達高峰，PDGF-C促增殖最佳作用濃度是20 μg/L；經(jīng)不同濃度PDGF-C的刺激，處于細胞周期G1期的ES-2細胞比例較對照組明顯降低(P<0.05)，處于S期的ES-2細胞比例顯著升高(P<0.05)，而處于G2+M期的細胞比例則無明顯變化(P>0.05)。同時，PDGF-C提高了ES-2細胞的遷移能力。結(jié)論 PDGF-C可促進體外培養(yǎng)的ES-2細胞的增殖、遷移能力。

血小板衍生生長因子C；ES-2細胞系；細胞增殖；趨化作用

卵巢癌是常見惡性腫瘤之一，其病死率高居婦科惡性腫瘤之首[1, 2]。卵巢透明細胞癌(ovarian clear cell carcinoma, OCCC)是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)一種特殊的病理類型，約占卵巢癌的5%，其侵襲性強，易發(fā)生腹膜后淋巴結(jié)及實質(zhì)器官如肝臟等部位轉(zhuǎn)移，易發(fā)生耐藥且復(fù)發(fā)性高，故而預(yù)后較差[3, 4]。

血管生成在腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)作為促進血管生成的一種重要因子，其過表達能促進腫瘤細胞增殖、遷移，并且能改變腫瘤微環(huán)境。PDGF-C作為新發(fā)現(xiàn)的PDGF家族成員，在多種上皮細胞腫瘤中均有表達，如乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌等[5-7]。PDGF-C有較強的促進血管新生能力[8,9]，可間接促進腫瘤的生長，但是它對腫瘤細胞本身的增殖和侵襲能力影響如何尚未有報道。因此，本研究旨在了解PDGF-C對卵巢透明細胞癌ES-2細胞增殖與遷移能力的影響，以期進一步揭示PDGF-C在卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ES-2(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心)、PDGF-C(美國Peprotech公司)，細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所)，CCK8檢測試劑盒(日本同仁化學(xué))，胎牛血清(HyClone Laboratories, Inc)，胰蛋白酶、McCOY’S5A培養(yǎng)液(上海Invitrogen公司)，CD133抗體(美國BD公司)，Transwell(孔徑8 μl，美國Corning)。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Shell-Lab2323型)，超凈工作臺(YJ-875型，蘇州凈化設(shè)備)、流式細胞儀(美國Elite SP型)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、酶標分析儀(美國Bio-RAD Model 550型)、細胞計數(shù)儀(美國FJ-2003型)。

1.3 ES-2細胞培養(yǎng) ES-2細胞復(fù)蘇后，以1×104/cm2的密度接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/ml青霉素G及100 g/ml 鏈霉素的McCOY’S5A培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中貼壁培養(yǎng)。

1.4 CCK8法ES-2細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的ES-2細胞，消化離心后計數(shù)，以1×104個/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，于孵箱常規(guī)培養(yǎng)12 h，分別加入濃度為10、20和40 μg/L的PDGF-C；同時設(shè)置對照組，加入等體積的PBS液。每組設(shè)置5個復(fù)孔，以換含PDGF-C培養(yǎng)液的時間為準，每天定時于每孔中加入CCK8試劑20 μl，孵育4 h后酶標儀檢測各孔細胞于450 nm波長處的吸光度值，連續(xù)檢測7 d。將檢測結(jié)果以時間為橫軸，吸光度為縱軸繪制生長曲線，計算細胞的存活率。

1.5 流式細胞儀法ES-2細胞周期檢測 取ES-2細胞，以6×103個/cm2的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換含2% FBS的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為10、20和40 μg/L 的PDGF-C，對照組加入等體積的PBS。孵育24 h后，胰酶消化3 min，加入含血清培養(yǎng)液中和胰酶作用，輕輕吹打成細胞懸液，800 r/min離心5min，棄上清，PBS液漂洗3遍，細胞篩去除聚集的細胞團，PBS液重懸并將細胞密度調(diào)整為1.5×106/ml，加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇溶液，于4 ℃過夜。PBS液充分漂洗后加入RNA酶10 μl，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)25 μl染色，置于4 ℃冰箱避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期(激發(fā)波長488 nm)。

1.6 ES-2細胞劃痕實驗 將ES-2細胞以2×105/ml的密度接種在6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換含2% FBS的培養(yǎng)液，待細胞融合達80%后，每孔用200 μl無菌槍頭縱向勻速劃一道劃痕，PBS液輕輕沖洗細胞，分別加入濃度為10、20和40 μg/L的PDGF-C培養(yǎng)液，對照組加入等體積PBS液。于0、12、24、36和48 h對細胞進行拍照，觀察各組細胞向空白處遷移的情況。

1.7 Transwell細胞遷移實驗 將50 mg/L 的Matrigel用PBS液稀釋8倍，取1滴加于Transwell小室底部膜的下室面，在超凈臺內(nèi)風干后備用。取對數(shù)生長期的ES-2細胞消化離心，將細胞密度調(diào)整為2×105/ml，取200 μl細胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，下室分別加入濃度為10、20和40 μg/L的PDGF-C培養(yǎng)液500 μl，設(shè)立對照組并加入等體積PBS液。孵育24 h后取出，加入4%多聚甲醛液，置于4 ℃冰箱固定15 min，PBS液清洗3min，重復(fù)2次。將固定好的細胞用CD133進行免疫熒光染色，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照取材。

2 結(jié) 果

2.1 PDGF-C對ES-2細胞增殖的影響 如圖1所示，加入PDGF-C的各組細胞其增殖能力較對照組均有明顯增強，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。加入PDGF-C后，ES-2細胞的增殖均在第4天達到高峰，但PDGF-C與細胞增殖之間未呈現(xiàn)線性濃度/效應(yīng)關(guān)系，其中在PDGF-C濃度為20 μg/L時達高峰，而40 μg/L 濃度時其效應(yīng)與10 μg/L 濃度時相近。

2.2 PDGF-C對ES-2細胞周期的影響 如圖2所示，在不同濃度的PDGF-C刺激下，處于細胞周期G1期的ES-2細胞比例與對照組相比明顯降低(P<0.05)，處于S期的ES-2細胞比例則顯著升高(P<0.05)，而處于G2+M期的細胞比例則無明顯變化(P>0.05)。

圖1 不同濃度PDGF-C對人卵巢透明細胞癌細胞(ES-2)增殖能力的影響

2.3 PDGF-C對ES-2細胞遷移的影響 與對照組相比，加入PDGF-C的各組細胞向劃痕空白處遷移的數(shù)量明顯增多，并且遷移速度也明顯加快；其中當PDGF-C的濃度為20 μg/L時，ES-2細胞遷移速度最快(圖3)。

圖2 PDGF-C對ES-2細胞周期的影響

2.4 PDGF-C對ES-2細胞的趨化作用 加入PDGF-C的ES-2細胞在Transwell培養(yǎng)24 h后，細胞遷移到小室底部膜的下室面，并沿著小室孔道呈現(xiàn)細長形生長(圖4)。加入PDGF-C的實驗組細胞遷移數(shù)量明顯高于對照組，其中濃度為20 μg/L的PDGF-C小室膜下室面ES-2細胞數(shù)量最多，其次是濃度為40 μg/L和10 μg/L。

圖3 PDGF-C對ES-2細胞遷移能力的影響

A1～A5.對照組，未添加PDGF-C；B1～B5. 添加PDGF-C濃度為10 μg/L；C1～C5. 添加PDGF-C濃度為20 μg/L；D1～D5. 添加PDGF-C濃度為40 μg/L

圖4 PDGF-C對ES-2細胞的趨化作用

A.對照組，未添加PDGF-C；B. 添加PDGF-C濃度為10 μg/L；C. 添加PDGF-C濃度為20 μg/L；D. 添加PDGF-C濃度為40 μg/L

3 討 論

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，起病隱匿，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已為晚期。其中約90%的卵巢癌來源于卵巢表面的生發(fā)上皮，稱為上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)。卵巢透明細胞癌(OCCC)來源于苗勒管上皮，好發(fā)于圍絕經(jīng)期婦女，常合并子宮內(nèi)膜異位癥[10]，其發(fā)生機制尚不明確。OCCC易早期轉(zhuǎn)移、早期復(fù)發(fā)，加之易發(fā)生耐藥，導(dǎo)致其預(yù)后較差。

腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)受多種因素調(diào)控，腫瘤生長的微環(huán)境是其重要條件[11]。近年來，腫瘤微環(huán)境影響腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為這一觀念逐漸被越來越多的人所接受。腫瘤微環(huán)境由內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞、免疫細胞、多種生長因子、細胞因子及細胞外基質(zhì)等構(gòu)成，通過復(fù)雜的信號通路及機制調(diào)控腫瘤的生物學(xué)特性。

PDGF是一類已被認識的生長因子，能維持正常組織和細胞生長分化，作為促進血管生成的關(guān)鍵生長因子，是腫瘤微環(huán)境中的重要成員，對腫瘤的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移具有重要作用。研究表明PDGF在多種實體腫瘤中高表達，如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等[12,13]。PDGF家族包括PDGF-A、B、C、D等亞型，其為單體時無活性，需通過二硫鍵結(jié)合為二聚體時才具有生物活性被分泌出來。其中，PDGF-A和PDGF-B的研究已較為成熟，而PDGF-C和PDGF-D作為PDGF家族新成員，研究時間較短。PDGF通過結(jié)合并激活其特異性受體，激活下游信號通路，調(diào)控腫瘤的生物學(xué)行為，其作用機制尚不明確，可能與啟動基因轉(zhuǎn)錄、增加細胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)[14]。研究表明，PDGF-AA能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞遷移，促進腫瘤內(nèi)部新生血管的形成[15]；PDGF-BB能促進細胞分裂增殖[16]；PDGF-CC能促進卵巢組織中新生血管形成；PDGF-DD能影響組織中化療藥物的吸收[17]。

PDGF-C作為新發(fā)現(xiàn)的PDGF家族的一員，文獻報道能促進內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞分裂及遷移，從而促進腫瘤組織內(nèi)新生血管形成，同時能夠趨化成纖維細胞[18,19]。另外，有研究表明，PDGF-C能調(diào)控炎性細胞功能，改變腫瘤細胞所處的微環(huán)境[20]。文獻報道，PDGF-C在多種上皮細胞腫瘤細胞中高表達，而基質(zhì)細胞大量表達其受體，激活酪氨酸激酶通路，影響腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成[21]。綜上所述，PDGF-C在腫瘤組織中通過直接或間接作用，調(diào)控腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究表明，PDGF-C能顯著促進卵巢透明癌ES-2細胞的增殖。細胞周期檢測表明，PDGF-C能誘導(dǎo)ES-2細胞進入分裂增殖周期，使S期細胞比例增大，說明處于活躍的DNA復(fù)制與合成期的細胞量有所增加，這也證實了PDGF-C能夠促進ES-2細胞內(nèi)DNA合成，加快細胞的有絲分裂及增殖。在細胞劃痕實驗及Transwell細胞趨化實驗中可以明顯看到加入PDGF-C組的細胞遷移與趨化速度要比對照組快，說明PDGF-C對ES-2細胞的遷移與趨化作用是正向調(diào)控的。比較不同濃度對ES-2細胞的遷移與趨化作用可以發(fā)現(xiàn)，隨著PDGF-C濃度的增加，ES-2細胞的遷移與趨化速度明顯加快，當?shù)竭_20 μg/L時遷移與趨化速度最快，說明PDGF-C對ES-2的遷移與趨化作用不是呈線性增加的，而是存在一個最適濃度(20 μg/L接近最適濃度)。

綜上所述，本研究證實，PDGF-C能直接作用于卵巢癌細胞，不但能增強腫瘤細胞的增殖能力，也能促進腫瘤細胞的遷移能力，從而提示其可能在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。對PDGF-C的深入研究，將為卵巢癌的診斷以及治療開辟一條嶄新的道路。

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(2016-08-04收稿 2016-09-25修回)

(責任編輯 武建虎)

Effect of platelet-derived growth factor-C on proliferation and migration of ovarian cancer cells in vitro

LI Xiaoying1, GUO Ximin2,GUO Hongyan2, and PAN Lingya1.

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100730，China；2.Department of Advanced Interdisciplinary Studies, Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China；3.Department of Dentistry，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To examine the effect of platelet-derived growth factor-C (PDGF-C) on ovarian clear cell carcinoma cells ES-2 in vitro.Methods ES-2 cells were cultured with the supplement of different concentrations of PDGF-C (0, 10, 20 and 40 μg/L). CCK8 assay was used to detect the effect of PDGF-C on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell cycle phases. Transwell assay and cell scratch test were used to detect cell migration ability.Results PDGF-C could not only significantly induce proliferation of ES-2 compared with the blank control group without PDGF-C, but increase the percentage of the cells in S phase. Additionally, it was found the best concentration of PDGF-C to promote the proliferation of ES-2 cells was 20 μg/L. With the stimulation of different concentrations of PDGF-C, the proportion of ES-2 cells in G1 and S cell cycle was significantly decreased (P<0.05) and significantly increased (P<0.05) respectively, while the proportion of cells in G2+ M phase did not change compared with the control group (P>0.05). At the same time, PDGF-C increased the migration ability of ES-2 cells.Conclusions PDGF-C can promote the proliferation and migration of ES-2 cells in vitro.

platelet-derived growth factor-C; ES-2; cell proliferation; cell migration

國家自然科學(xué)基金(81172481)

李曉瑩，博士研究生。

1.100730，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科；2.100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；3.100039 北京，武警總醫(yī)院口腔科

潘凌亞，E-mail: lingyapan@hotmail.com

R711.15