朱 哲，王 娜，趙 敏*

·論著·

百草枯中毒早期大鼠腎組織中不規(guī)則趨化因子的表達

朱 哲1，王 娜2，趙 敏1*

目的 通過觀察不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN，又稱CX3CLl)在百草枯(Paraquat，PQ)中毒早期腎組織中的表達，探討FKN在PQ致大鼠急性腎損傷中的作用。方法 SD大鼠80只，按隨機數(shù)字法分為染毒組(40只)和對照組(40只)。染毒組腹腔注入PQ(22 mg/kg)，對照組給予等量生理鹽水。每組分別在染毒后0.5、1、3、5 d處死大鼠。測定血清肌酐及尿素氮，HE染色觀察腎組織病理改變，免疫組化法檢測FKN的表達。結(jié)果 PQ染毒后大鼠出現(xiàn)腎功能損害，血肌酐及尿素氮同步升高，且隨染毒時間延長，腎功能損害逐漸加重，與同時間對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。鏡下觀察，染毒組大鼠腎組織病理改變?yōu)槟I小球體積增大，腎小管上皮細胞腫脹及管腔變窄；此后隨觀察時間延長，可見水腫滲出、壞死，間質(zhì)炎性細胞浸潤增加，腎小管內(nèi)蛋白管型。免疫組化發(fā)現(xiàn)：染毒組在染毒后0.5、1、3、5 d,FKN表達呈逐漸增高趨勢(P<0.05)，且明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 FKN在PQ早期大鼠腎組織中可表達，并與急性腎損傷的發(fā)病過程緊密相關(guān)。

百草枯；中毒；不規(guī)則趨化因子；腎組織

0 引言

百草枯(Paraquat，PQ)是世界范圍內(nèi)廣泛使用的速效觸殺型除草劑[1]，毒性較強且無特效解毒劑，因接觸誤服或自殺等原因?qū)е碌陌俨菘葜卸静±仓鹉暝黾?。炎癥反應(yīng)在百草枯中毒機制中研究比較廣泛[2]。不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN，又稱CX3CLl)屬趨化因子CX3C亞族，具有促進白細胞黏附、加快炎性因子滲出、促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生等多種生物學(xué)作用，參與了多種炎性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程。但FKN與百草枯中毒的相關(guān)報道很少[3-6]。本實驗通過觀察PQ染毒早期不同時間點腎組織中FKN的表達及變化，探討FKN與PQ致大鼠急性腎損傷的關(guān)系，為研究PQ中毒急性腎損傷的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 20%百草枯溶液(江蘇南通先正達藥業(yè))，兔抗大鼠CX3CLl多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動物模型制作 SPF級健康成年雄性SD大白鼠80只(由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體重(392±38)g。將80只大鼠按隨機數(shù)字法分成染毒組(40只)和對照組(40只)。染毒組以PQ 22 mg/kg腹腔注射染毒，對照組給予等量的生理鹽水。每組按觀察時間點(染毒后0.5、1、3、5 d)隨機分為4個亞組，每組10只大鼠進行試驗。

1.3 標(biāo)本采集 各組大鼠在建模后第0.5、1、3、5天，按照10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。腹主動脈采血約5 mL放入離心管中，靜置30 min，3 500 r/min，離心15 min，留取血漿，置于-80 ℃冰箱保存。放血處死大鼠后，留取雙腎標(biāo)本行病理觀察及免疫組化染色。

1.4 腎組織病理學(xué)觀察 腎組織用4%多聚甲醛(4 ℃，PBS配制，pH 7.4)固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后光鏡下觀察腎臟病理變化(4 μm切片)。

1.5 血Cr和BUN的測定 取各組大鼠血漿，按照試劑盒說明測定血清 Cr、BUN水平。

1.6 腎組織FKN免疫組化染色 采用鏈霉親和素-生物素標(biāo)記法(SABC)進行染色，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進行。一抗兔抗大鼠CX3CLI多克隆抗體稀釋濃度為1∶50。鏡下隨機選取3個高倍視野，以胞質(zhì)/胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，應(yīng)用免疫組化分析軟件(NIS-Elements Br 3.0)進行圖像分析，分別計算每個視野陽性染色的平均吸光度值(MOD)，取其平均數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物觀察 對照組大鼠觀察期內(nèi)無明顯變化，活動敏捷，飲食正常，反應(yīng)正常，毛發(fā)光滑，體重增加或無明顯改變。染毒組大鼠染毒0.5d后開始出現(xiàn)活動減少，1d后部分大鼠進食進水減少、呼吸不穩(wěn)，口鼻部可見分泌物；3d及5d后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促，嚴(yán)重者死亡(3d染毒組死亡3例，5d染毒組死亡5例，予同數(shù)量大鼠補充入組)。

2.2 腎組織病理變化 對照組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤，小管內(nèi)無管型及顆粒(圖1A)。染毒組出現(xiàn)急性腎損傷表現(xiàn)。染毒后0.5d即可見腎小球體積增大，1d可見腎小管上皮細胞腫脹及管腔變窄 ，3d可見水腫滲出、壞死，間質(zhì)可見炎性細胞浸潤增加，5d可見腎小管內(nèi)蛋白管型(見圖1)。

圖1 各組大鼠腎組織的病理變化(HE,×100)

2.3 染毒組和對照組不同時點血Cr和BUN比較PQ染毒后，大鼠出現(xiàn)腎功能損害，血肌酐及尿素氮升高(P<0.05)，且隨染毒時間延長腎功能損害加重(P<0.05)，與同時間對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見表1。

2.4FKN在腎組織中的表達FKN在對照組中不表達或很少表達，僅見極少數(shù)腎小管細胞漿棕黃色淡染，各時間點FKN比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。染毒組在染毒后0.5、1、3、5d,FKN表達呈逐漸增高趨勢(P<0.01)，且明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖2、圖3。

3 討論

百草枯是一種快速滅生性除草劑，具有極強的觸殺作用。其對人體毒性極大，致死率高，受累的主要器官是肺臟，腎臟也是受累器官之一，且無特效解毒劑。有研究表明，針對草枯中毒患者的研究中，腎損傷的發(fā)生率高達64.9%，其中死亡患者的腎損傷發(fā)生率達到67.1%，可以看出腎損傷是影響預(yù)后的重要因素[7]。本研究成功建立PQ腹腔注射染毒大鼠動物模型，染毒后0.5 d,大鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸急促，口鼻及肢端出現(xiàn)血性分泌物，血肌酐及尿素氮升高，HE染色見腎小球體積增大，腎小管上皮細胞腫脹、變性、空泡樣變、壞死，腎小管管腔變窄，間質(zhì)充血、水腫、炎性細胞浸潤，提示PQ中毒早期可致腎損傷。并且實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN在腎組織中的表達從0.5 d以后的時間點呈逐漸增加趨勢，在時間上與腎組織病理損害程度相關(guān)，故認(rèn)為FKN介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與急性腎損傷的發(fā)生與發(fā)展過程。本研究顯示，PQ中毒后0.5 d即出現(xiàn)腎臟組織FKN 的表達升高，且持續(xù)較長時間，提示FKN可能參與了腎臟早期炎性損害及功能衰竭的發(fā)生。通過以上實驗推測，F(xiàn)KN參與的炎癥反應(yīng)，也是PQ中毒者多臟器功能障礙或死亡的一個重要因素。

表1 各組大鼠不同時點腎功能的變化

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組大鼠腎組織FKN免疫組化染色結(jié)果(SABC，×400)

圖3 各組大鼠腎組織FKN比較

FKN是趨化因子CX3C亞族的唯一成員[8-9]，主要表達在內(nèi)皮細胞及上皮細胞，是活化的內(nèi)皮細胞分泌的具有黏附功能的趨化因子，具有膜結(jié)合型和可溶型兩種形式。膜結(jié)合型FKN可對白細胞上FKN受體CX3CR1起黏附作用，并支持整合素非依賴性白細胞黏連。當(dāng)膜結(jié)合型FKN被溶蛋白性裂解后以游離的形式釋放，趨化多種炎性細胞，促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。FKN是與多種細胞因子相關(guān)聯(lián)的活性因子。有研究表明，F(xiàn)KN與CX3CRl結(jié)合以后，可以增加NF-κB、TGF-β1的表達，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[10]。已有實驗證明NF-κB及TGF-β1在PQ中毒中都發(fā)揮著重要作用[11-16]，F(xiàn)KN在百草枯中毒腎組織中的表達可能成為PQ中毒的新靶點。

本實驗證實了FKN同PQ中毒腎損傷程度的相關(guān)性，但與PQ中毒相關(guān)研究仍需更多實驗證實。FKN兼具趨化和黏附雙重功能，其受體CX3CRl的特異性在百草枯中毒的臨床治療實踐中的應(yīng)用值得深入探索。

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Expression of the Fractalkine in kidney tissue of SD rats with early paraquat poisoning

ZHU Zhe1，WANG Na2，ZHAO Min1*

(1.Department of Emergency，Shengiing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China;2.Liaoning Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment,Shenyang 110005,China)

Objective To investigate the effect of fractalkine (FKN) on acute renal injury induced by paraquat poisoning in rats by observing the expression of FKN in renal tissue.Methods A total of 80 SD rats were randomly divided into two groups: PQ group (n=40) and control group (n=40).PQ 22 mg/kg and an equal volume of normal saline were administered intraperitoneally in PQ group and control group.Rats were separately sacrificed at 0.5,1,3 and 5 d after poisoning.The serum creatinine (Cr),urea nitrogen (BUN) and the pathological changes of the renal tissue were measured by HE staining.The FKN expression was observed by immunohistochemistry method.Results After PQ poisoning,the renal failure appeared in the rats of PQ group,and the Cr and BUN increased at the same time.As poisoned time prolonged,the Cr and BUN increased more significantly,and there were significant differences in Cr and BUN between the two groups (P<0.05).The pathological changes of renal tissue in rats of PQ group,including increased glomerular volume,the swelling of tubular epithelial cells and the narrowing of the lumen were observed under the microscope.Then the edema exudation,necrosis,increased infiltration of inflammatory cells and visible protein tube in renal tubules appeared as the observation time prolonged.The results of HE staining showed that the FKN expression of rats in PQ group at 0.5,1,3 and 5 d after being poisoned increased gradually (P<0.05),and there were significant differences between the two groups (P<0.01).Conclusion FKN can be expressed in renal tissue of early PQ rats,which is closely related to the pathogenesis of acute kidney injury.

Paraquat;Poisoning;FKN;Renal tissue

2016-10-20

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004;

2.遼寧省職業(yè)病防治院，沈陽 110005

國家重點?？平ㄔO(shè)項目(衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701001

*通信作者