房亞蘭 黃語(yǔ)悠 趙詠梅 李錦程 段云霞 趙海蘋(píng) 高 利 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

· 腦血管病、認(rèn)知障礙的基礎(chǔ)及臨床研究 ·

大黃酚對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區(qū)環(huán)氧化酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響

房亞蘭 黃語(yǔ)悠 趙詠梅*李錦程 段云霞 趙海蘋(píng) 高 利 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

目的 探究大黃酚(Chrysophanol， CHR)對(duì)大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型小鼠再灌注后腦內(nèi)環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2， COX2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9， MMP-9)表達(dá)的影響，探討CHR保護(hù)腦缺血再灌注損傷的抗炎機(jī)制。方法采用數(shù)字表法隨機(jī)將18只健康雄性C57BL小鼠分為3組:假手術(shù)(Sham)組、MCAO組、CHR組(小鼠造模當(dāng)天按0.1 mg/kg腹腔注射CHR，此后每天1次，連續(xù)給藥14 d)，每組6只。使用線栓法制作小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血45 min再灌注模型。術(shù)中監(jiān)測(cè)小鼠肛溫，使其維持在正常范圍。于再灌注后14 d處死小鼠，迅速取腦，用免疫熒光染色檢測(cè)小鼠腦組織冰凍切片缺血半暗帶區(qū)COX2和MMP-9的表達(dá)，并用免疫熒光雙標(biāo)法對(duì)COX2和MMP-9在缺血腦組織的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位。結(jié)果1)Sham組小鼠偶見(jiàn)COX2或MMP-9染色陽(yáng)性細(xì)胞。與Sham組相比，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)COX2和MMP-9的表達(dá)明顯增高(P<0.05)。2)與MCAO組相比，給予CHR治療后，缺血再灌注小鼠腦缺血半暗帶區(qū)COX2和MMP-9的表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。3)缺血再灌注小鼠腦缺血半暗帶區(qū)，COX2或MMP-9免疫熒光染色分別與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN免疫熒光染色共定位。結(jié)論CHR可能通過(guò)抑制COX2和MMP-9的蛋白表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮長(zhǎng)期的神經(jīng)保護(hù)作用。

腦缺血；大黃酚；炎性反應(yīng)；大腦中動(dòng)脈梗死；環(huán)氧化酶2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

缺血性腦卒中是由于腦血管狹窄或閉塞導(dǎo)致腦組織供血障礙引起的神經(jīng)系統(tǒng)損害。它是造成成人永久性殘疾的主要原因，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的直接原因之一[1]。腦缺血/再灌注損傷機(jī)制非常復(fù)雜，有眾多的細(xì)胞因子參與其中，最終啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或死亡。其中，炎性反應(yīng)在缺血性腦損傷過(guò)程中扮演著重要的角色[2-3]。因而，抑制腦缺血/再灌注過(guò)程中的炎性反應(yīng)是一個(gè)頗具吸引力的治療策略[4]。

在中國(guó)，應(yīng)用大黃治療腦損傷的歷史悠久，大黃酚(Chrysophanol， CHR)是大黃蒽醌類中一種純化的活性成分[5]，一些研究[6-7]表明，CHR對(duì)腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。但目前關(guān)于CHR在神經(jīng)保護(hù)作用方面的相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)研究還十分有限。

環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2， COX2)是花生四烯酸合成炎性介質(zhì)前列腺素的限速酶，生理狀態(tài)下，COX2幾乎不表達(dá)[8]。研究[9]表明，局灶性腦缺血大鼠缺血30 min時(shí)，COX2在缺血半暗帶區(qū)及扣帶回的表達(dá)顯著增加，抑制COX2的表達(dá)能減輕腦缺血損傷[10]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9， MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)家族成員之一，能特異性地降解膠原蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，在缺血性腦梗死病人的血清中，MMP-9顯著增加[11]。研究[12]顯示，敲除MMP-9基因的腦缺血再灌注小鼠能顯著減小腦梗死體積，降低腦缺血損傷，表明MMP-9與腦缺血損傷過(guò)程密切相關(guān)。因此，本研究采用大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion， MCAO)再灌注模型小鼠，觀察CHR對(duì)模型小鼠腦缺血再灌注后14 d COX2和MMP-9表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步探討CHR長(zhǎng)期拮抗腦缺血再灌注損傷的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

小動(dòng)物手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))、麻醉機(jī)(Harvard Apparatus公司，美國(guó))、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150，Carnegie Medicin公司，瑞典)、雙極電凝器(德威公司，DEVEL，ACC100)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；CHR(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美國(guó))；COX2抗體(CST公司，美國(guó))；MMP-9抗體(Abcam公司，美國(guó))；NeuN抗體(Millipore公司，美國(guó))等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2月齡健康雄性C57BL小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京) 2012-0001(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，體質(zhì)量(23.5±1) g，于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。將18只小鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(Sham)組、MCAO組、CHR組。CHR溶于含有1%(體積分?jǐn)?shù)) Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù)) DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液中，CHR組小鼠造模當(dāng)天按0.1 mg/kg腹腔注射CHR，此后每天1次，連續(xù)給藥14 d，Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的含1%(體積分?jǐn)?shù)) Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù)) DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液。

1.4 動(dòng)物模型制作

MCAO模型按照改良ZeaLonga法制備。將恩氟烷混合于70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2中，首先用5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，然后用面罩吸入2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。于小鼠頸部沿正中線切口，分離右側(cè)的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，將頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓自頸外動(dòng)脈殘端插進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，到達(dá)距頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉約1 cm處。使用反饋性控溫毯監(jiān)測(cè)術(shù)中小鼠肛溫，將其維持在(37.0±0.5)℃。缺血45 min后，將線栓小心地拔出進(jìn)行再灌注。術(shù)后小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室14 d，自由進(jìn)食飲水。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)

各組小鼠于造模后14 d，用水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速斷頭取腦，于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛后固定48 h，30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖脫水24 h，行連續(xù)冰凍切片(厚度為20 μm)。將腦組織冰凍切片經(jīng)PBS洗后，用含有0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100的PBS孵育約10 min，PBS洗后，用5 %(體積分?jǐn)?shù))的山羊血清在室溫下封閉30 min，滴加一抗(COX2兔多克隆抗體 1∶100，MMP-9兔多克隆抗體 1∶500，NeuN鼠多克隆抗體 1∶300)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日將切片取出，PBS洗后，滴加山羊抗兔和山羊抗鼠熒光二抗(1∶300)，在室溫下避光孵育1 h。PBS洗后，最終用含DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察腦皮質(zhì)半暗帶區(qū)[9]。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。在相同放大倍數(shù)下，使用相同參數(shù)，每張腦組織冰凍切片隨機(jī)選取4個(gè)視野照相，用NIS Element軟件統(tǒng)計(jì)COX2和MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)COX2的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果可見(jiàn)，Sham組小鼠腦組織偶見(jiàn)COX2綠色熒光染色；在MCAO小鼠缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)和紋狀體有大量的COX2陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO組小鼠缺血半暗帶區(qū)COX2染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加；與MCAO組相比，CHR組小鼠缺血半暗帶區(qū)COX2染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(圖1 A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1 B)。

2.2 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腦組織可見(jiàn)少量MMP-9綠色熒光染色，散在分布于大腦皮質(zhì)和海馬組織。MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。與MCAO組相比，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9的表達(dá)明顯減少(圖2 A)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2 B)。

2.3 MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)域COX2、MMP-9與NeuN共定位

免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果可見(jiàn)，在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)域COX2陽(yáng)性細(xì)胞及MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞，均呈綠色熒光。NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光。所有細(xì)胞的胞核為藍(lán)色熒光。合并圖像后，發(fā)現(xiàn)綠色與紅色熒光相重合，表明COX2和MMP-9與神經(jīng)元共定位，該結(jié)果提示，腦缺血再灌注后神經(jīng)元內(nèi)COX2及MMP-9的表達(dá)增加(圖1、2)。

圖1 Sham組、MCAO組及CHR組小鼠再灌注14 d腦缺血半暗帶區(qū)COX2/NeuN免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果

A:representative double immunofluorescence staining for COX2 (green) and neuron-specific NeuN (red) on 14th day after reperfusion. Bar=20μm. B: comparison of the numbers of COX2-positive immunoreactive cells in Sham， MCAO and CHR group mice.*P<0.05vssham group，#P<0.05vsMCAO group，n=5; MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4’，6-diamidino-2-phenylindole; CHR:Chrysophanol.

A:representative double immunofluorescence staining for MMP-9 (green) and neuron-specific NeuN (red) on 14th day after reperfusion. Bar=20μm. B: comparison of the numbers of MMP-9-positive immunoreactive cells in Sham， MCAO and CHR group mice.*P<0.05vsSham group，#P<0.05vsMCAO group，n=5; MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4’，6-diamidino-2-phenylindole；CHR：Chrysophanol；MMP-9：matrix metalloproteinase-9.

3 討論

炎性反應(yīng)可增加缺血性卒中的嚴(yán)重程度，在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[2]。核因子-κΒ(nuclear factor-kappa Β， NF-κΒ)是一個(gè)參與調(diào)節(jié)多種炎性細(xì)胞因子表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，在許多炎性疾病中發(fā)揮舉足輕重的作用。據(jù)報(bào)道[13]，NF-κB的活化與缺血再灌注損傷過(guò)程中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)濃度的顯著升高有關(guān)。本課題組最新的研究[14]表明，再灌注后14 d，CHR仍能顯著抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)NF-κΒ的活化和TNF-α、IL-1β的表達(dá)，提示CHR通過(guò)抑制NF-κΒ的活化，下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮長(zhǎng)期的神經(jīng)保護(hù)作用。然而有關(guān)CHR神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制目前尚不十分清楚，本研究通過(guò)免疫熒光染色方法檢測(cè)腦缺血半暗帶區(qū)COX2和MMP-9的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討CHR拮抗腦缺血再灌注損傷的抗炎機(jī)制。

NF-κΒ信號(hào)通路和COX2廣泛參與腦缺血再灌注中的炎性反應(yīng)[15-18]。NF-κΒ p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核引起NF-κΒ的活化，進(jìn)而促進(jìn)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。COX2是NF-κΒ的一個(gè)下游靶基因，活化的NF-κΒ可以促使COX2基因轉(zhuǎn)錄，已有研究[9-10，15]表明，腦缺血可引起COX2的產(chǎn)生，介導(dǎo)有害的炎性反應(yīng)，參與腦缺血損傷。為了闡明CHR減輕腦缺血損傷炎性反應(yīng)的機(jī)制，本研究采用免疫熒光染色方法觀察CHR對(duì)MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)COX2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，MCAO小鼠再灌注14 d時(shí)腦缺血半暗帶區(qū)COX2的表達(dá)仍比Sham組顯著增加，高表達(dá)的COX2可促使促炎介質(zhì)和氧自由基的增多，也能直接損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16，19]，因此，本研究中MCAO小鼠再灌注14 d時(shí) COX2表達(dá)增加，可加重腦缺血損傷。給予MCAO小鼠CHR治療14 d后，腦缺血半暗帶區(qū)COX2的表達(dá)明顯減少，說(shuō)明CHR對(duì)COX2的產(chǎn)生有抑制作用。本課題組最近的研究[14]結(jié)果顯示，CHR能顯著改善MCAO小鼠再灌注后14 d的神經(jīng)功能評(píng)分，明顯減少因腦缺血導(dǎo)致的腦組織損失，并且抑制NF-κΒ的活化。結(jié)合本研究結(jié)果，提示CHR可能通過(guò)抑制NF-κΒ活化，減少COX2的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎性損傷，發(fā)揮長(zhǎng)期的神經(jīng)保護(hù)作用。

已有研究[12]表明，急性腦梗死病人血清中MMP-9的濃度與腦梗死體積呈正相關(guān)，且COX2和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)[20]。為了進(jìn)一步闡明CHR拮抗腦缺血損傷的機(jī)制，本研究采用免疫熒光染色法觀察CHR對(duì)MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，MCAO小鼠再灌注14 d時(shí)腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9的表達(dá)仍比Sham組顯著增多，提示此時(shí)MMP-9仍參與腦缺血損傷。本課題組最近的研究[14]表明，CHR能抑制MCAO小鼠腦組織內(nèi)NF-κΒ的活化，而活化的NF-κΒ可誘導(dǎo)MMP-9轉(zhuǎn)錄[21]，因此，在本研究中，CHR可能通過(guò)抑制NF-κΒ的活化，進(jìn)而抑制了MMP-9的表達(dá)。有關(guān)癌癥的研究[20]顯示，COX2可能通過(guò)促進(jìn)前列腺素合成，間接促進(jìn)MMP-9表達(dá)，也可能直接促進(jìn)MMP-9產(chǎn)生。因此，本研究中，給予CHR治療的MCAO小鼠，其MMP-9的表達(dá)顯著減少，可能是CHR通過(guò)降低COX2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

COX2參與遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[10]，敲除MMP-9基因的MCAO小鼠再灌注后腦梗死體積明顯降低[12]，抑制腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)COX2和MMP-9的表達(dá)，能有效改善其神經(jīng)細(xì)胞凋亡[22-23]。為了闡明MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)COX2、MMP-9是否在神經(jīng)元中的表達(dá)增加，本研究采用免疫熒光雙標(biāo)染色法將COX2和MMP-9分別與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN進(jìn)行共染色。結(jié)果顯示，MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)COX2和MMP-9分別與神經(jīng)元共定位，提示COX2和MMP-9很可能參與腦缺血再灌注損傷過(guò)程中神經(jīng)元的凋亡。

本研究以上的結(jié)果提示，給予MCAO小鼠CHR治療能降低COX2的表達(dá)，進(jìn)而抑制MMP-9的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到長(zhǎng)期的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步為深入探討CHR發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的抗炎機(jī)制提供了相關(guān)的科學(xué)依據(jù)。

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編輯 陳瑞芳

Effects of chrysophanol on the expressions of cyclooxygenase-2 and matrix metalloproteinase-9 in the penumbra of mice following focal cerebral ischemia/reperfusion

Fang Yalan， Huang Yuyou， Zhao Yongmei*， Li Jincheng， Duan Yunxia， Zhao Haiping， Gao Li， Luo Yumin

(XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，BeijingGeriatricMedicalResearchCenter，KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation，BeijingKeyLaboratoryofTranslationalMedicineforCerebrovascularDiseases，Beijing100053，China)

Objective To explore the effects of Chrysophanol (CHR) on the expression levels of cyclooxygenase-2 (COX2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in mice with middle cerebral artery occlusion (MCAO)/reperfusion injury and to investigate the potential anti-inflammatory mechanism of CHR. Methods Eighteen male C57BL mice were divided into 3 groups randomly: Sham group (n=6)， MCAO group (n=6)， and CHR group [mice received 0.1 mg/kg CHR (i.p.) for 14 days after ischemia/reperfusion]. MCAO was induced by using the suture method. The mice underwent 45 min of right MCAO， and then reperfusion by withdrawing filament. Rectal temperature was monitored and kept in normal range during the operation. The mice were sacrificed and the brains were harvested on 14 d after reperfusion. The expressions of COX2 and MMP-9 were detected by immunofluorescent staining. And the cellular location of COX2 and MMP-9 were detected by double immunofluorescence labeled antibody technique. Results 1) In Sham group， little COX2 positive cells and MMP-9 positive cells were observed. Compared with Sham group， the number of COX2 positive cells and MMP-9 positive cells increased significantly in the penumbra of MCAO group (P<0.05). 2) Compared with MCAO group， the number of COX2 positive cells and MMP-9 positive cells decreased significantly in the penumbra of MCAO+CHR group on day 14 after reperfusion (P<0.05). 3) COX2-positive immunoreactive cells were colocalized with the general neuronal marker， NeuN， in the penumbra of ischemia/reperfusion mice. And MMP-9-positive immunoreactive cells were colocalized with NeuN. Conclusion CHR has long-term neuroprotective effect against ischemia/reperfusion injury which might be attributed to its anti-inflammatory actions by decreasing the expression of COX2 and MMP-9.

cerebral ischemia; Chrysophanol; inflammatory middle cerebral artery occlusion; cyclooxygenase-2; matrix metalloproteinase-9

國(guó)家臨床重點(diǎn)專科(中醫(yī)，財(cái)社122號(hào))，北京市自然科學(xué)基金(7122036)。This study was supported by National Key Clinical Specialty (Traditional Chinese Medicine， No.122)，Natural Science Foundation of Beijing (7122036).

時(shí)間：2017-01-17 23∶22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2322.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.010]

R 743.3

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：yongmeizhao@hotmail.com