蔣素華, 程喜梅, 宋彩霞, 許申平, 梁 芳, 崔 波*

(1.鄭州師范學院生物工程研究所, 鄭州 450044; 2.河南農業(yè)大學生命科學學院, 鄭州 450002; 3.鄭州拓洋實業(yè)有限公司, 鄭州 450001)

實驗方法與技術
ExperimentalMethod&Technology

三種甘薯病毒多重RT-PCR檢測技術的建立

蔣素華1, 程喜梅3, 宋彩霞2, 許申平1, 梁 芳1, 崔 波1*

(1.鄭州師范學院生物工程研究所, 鄭州 450044; 2.河南農業(yè)大學生命科學學院, 鄭州 450002; 3.鄭州拓洋實業(yè)有限公司, 鄭州 450001)

本文根據(jù)GenBank中甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷葉病毒(SPLCV)和甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)外殼蛋白(CP)基因序列設計特異引物,對多重RT-PCR退火溫度、延伸溫度、模板濃度、引物濃度進行改良優(yōu)化,建立能同時檢測3種甘薯病毒的多重RT-PCR方法。該方法能同時擴增出SPVG、SPLCV和SPFMV特異片段,其大小分別是800、276和570 bp。測序結果表明,擴增出的3種病毒序列與相應參考序列相似性達到98%以上。靈敏度分析結果表明,多重RT-PCR方法能夠檢測cDNA的量為0.1 ng。應用建立的多重RT-PCR檢測方法對田間樣品進行檢測,結果顯示該方法可以特異、快速、靈敏地同時檢測3種甘薯病毒。這些研究結果可為甘薯病毒檢測提供參考。

甘薯; 病毒; 多重RT-PCR

甘薯病毒病存在于世界各個甘薯產區(qū)[1]。甘薯作為無性繁殖的作物,主要通過薯塊和秧蔓進行繁殖,因此極易感染病毒并且代代相傳。甘薯受到病毒侵染后,正常的生理機能受到嚴重的干擾和破壞,造成種性退化與產量的降低[2]。

病毒的檢測是防治甘薯病毒病的關鍵,建立高效的病毒檢測技術是抗病性早期鑒定、種苗檢疫、確保甘薯無毒化栽培的前提[3-4]。現(xiàn)在常用的以病毒侵染特性為基礎的檢測有多種方法如目測法、指示植物法、電鏡觀察法、血清學檢測法及分子生物學方法。分子生物學法既適用于DNA和 RNA 病毒,又適用于類病毒,具有特異性強、靈敏度高、適用面廣、快速簡便的特點。PCR技術目前已成為甘薯病毒檢測最常用和最主要的方法之一。近年來,研究者將多重RT-PCR技術運用到甘薯病毒檢測之中,與普通PCR檢測方法相比,多重RT-PCR檢測技術能夠在一個反應體系中同時檢測多種病毒,縮短了檢測時間,降低了試驗成本,提高了檢測效率,簡化了試驗步驟[5-6]。目前能夠檢測包含甘薯卷葉病毒Sweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV)、甘薯G病毒SweetpotatovirusG(SPVG)和甘薯羽狀斑駁病毒Sweetpotatofeatherymottlevirus(SPFMV)的多重RT-PCR 反應體系少有報道。本研究建立并優(yōu)化了檢測3種病毒的多重RT-PCR技術,旨在為甘薯病毒田間檢測和脫毒苗診斷打下良好的基礎。

1 材料方法

1.1 材料

供試甘薯樣品為采自河南地區(qū)帶有典型病毒病癥狀的樣品；陽性對照為經PCR驗證含有SPVG、SPLCV和SPFMV的樣品;陰性對照是無毒組培甘薯苗。樣品經液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基由本實驗室制備并保存。TaqDNA聚合酶、dNTPs、M-MLV反轉錄酶購自TaKaRa(大連)公司;克隆載體pGEM-Teasy、多重PCR擴增試劑盒、植物總RNA抽提試劑盒、普通瓊脂糖DNA回收試劑盒、IPTG、X-Gal購自天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中報道的甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷葉病毒(SPLCV)、甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)[7]的外殼蛋白(CP)基因的保守區(qū)域,應用DNAMAN軟件進行序列比對分析,并應用Primer Premier 5.0引物設計軟件分別設計病毒的特異性引物(表1),引物由上海英濰捷基生物技術公司合成。

1.4 單一RT-PCR檢測

參照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)的說明反轉錄合成第一鏈cDNA,并于-20℃保存。以cDNA為模板,分別利用SPVG、SPLCV、SPFMV的特異引物對甘薯樣品進行PCR擴增。單一RT-PCR反應體系為:10×PCR buffer 2.0 μL,dNTPs(2.5 μmol/L)2.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,模板cDNA 1.0 μL,補足ddH2O至20 μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min;94℃變性40 s,53℃退火40 s,72℃延伸40 s,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存。 PCR反應結束后,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,利用凝膠成像儀觀察并拍照記錄。

表1 甘薯病毒的特異性引物

Table 1 Specific primers for sweet potato viruses

病毒Virus引物Primer引物序列(5'→3')Primersequences擴增長度/bpFragmentlengthSPVGG-FG-RGCAGGAAAAACAGGAAACACTGTAGACCATACCTCGGCA800SPLCVLCV-FLCV-RTCCAGGACTATGAGTTCAAGATGCAGTAGTGGGCTCATTGTCGTA276SPFMVFMV-FFMV-RGCGTGATACGAGCAAAGAAAAGGCCAAAAGGGGCATTTACAGCACC570

1.5 多重RT-PCR檢測體系優(yōu)化和建立

在同一個PCR反應體系中加入3對引物同時進行PCR,對多重RT-PCR體系中模板濃度(12、20和28 ng/μL)、退火溫度(51、53和55℃)、延伸溫度(68、70 和72℃)、引物濃度(2.0、6.0和10 μmol/L)等因素進行優(yōu)化試驗。在設定某一影響因素時,其他因素保持不變。

1.6 靈敏度檢測

取1 μL濃度為1 021 ng/μL的總cDNA按10倍梯度依次稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,得到cDNA濃度依次為1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL,取1 μL cDNA為模板分別進行單一RT-PCR和多重RT-PCR擴增,觀察電泳結果,分析單一PCR和多重RT-PCR檢測的靈敏度。

1.7 PCR產物的克隆與序列分析

多重RT-PCR擴增產物采用普通瓊脂糖DNA回收試劑盒進行回收與純化,純化后的PCR產物與pGEM-Teasy載體進行連接轉化大腸桿菌,經藍白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆,獲得的陽性克隆送上海英濰捷基生物技術公司進行測序。利用NCBI上的BLAST和DNAMAN軟件對序列進行比對分析。

1.8 多重 RT-PCR的初步應用

從田間采集7份感病甘薯樣品,采用優(yōu)化的多重RT-PCR方法進行檢測分析。

2 結果與分析

2.1 單一RT-PCR檢測結果

用SPVG、SPLCV、SPFMV特異引物分別對相應病毒的RNA模板進行單一RT-PCR擴增,分別能夠擴增出800、276和570 bp特異性條帶,符合設計病毒目的條帶大小(圖1)。

2.2 多重RT-PCR反應體系的優(yōu)化分析

分別對3種病毒的模板濃度、退火溫度、延伸溫度、引物濃度進行優(yōu)化(圖2)。模板濃度為12、20、28 ng/μL時,3種病毒都能擴增出目的條帶且較亮,綜合考慮,模板濃度可選擇20 ng/μL。3種病毒引物濃度優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn),當3種(SPVG、SPLCV、SPFMV)引物混合濃度為10.0 μmol/L時,結果顯示SPFMV片段較強,3種引物混合濃度分別為2.0和6.0 μmol/L時,3種病毒擴增條帶均較亮,為了節(jié)約成本,選擇引物濃度為2.0 μmol/L。

圖1 單一PCR檢測三種甘薯病毒Fig.1 Detection of three sweet potato viruses by single PCR

圖2 多重RT-PCR反應體系優(yōu)化Fig.2 Optimization of multiplex RT-PCR reaction system

退火溫度試驗結果顯示,退火溫度為53℃時,3種病毒的目的條帶均較亮,條帶單一;退火溫度為51和55℃時,SPVG目的條帶亮度較暗,綜上分析可知,53℃為最適退火溫度。延伸溫度試驗表明,3個延伸溫度均能擴增出3種病毒清晰目的條帶,但是延伸溫度為72℃時目的條帶最亮,所以選擇72℃作為最佳延伸溫度。

2.3 多重RT-PCR反應體系的確立

根據(jù)2.2的結果,多重RT-PCR反應的最佳體系為:10×Primer mix (2.0 μmol/L) 1.2 μL,10×Multi buffer 2.5 μL,Super pure dNTPs (2.5 μmol/L) 2.0 μL,Multi HotStart DNA polymerase 1 μL, cDNA (20 ng/μL) 1 μL,補ddH2O至25 μL。最佳反應條件為:95℃預變性15 min;94℃變性30 s,53℃退火90 s,72℃延伸90 s,40個循環(huán);最后72℃延伸10 min。利用建立的反應體系對SPVG、SPLCV、SPFMV進行多重RT-PCR擴增,3種病毒的目的條帶均清晰分明。

2.4 靈敏度檢測

將甘薯cDNA模板按照10倍梯度依次稀釋，并分別取1 μL在相同反應體系及反應條件下進行單一RT-PCR和多重RT-PCR，結果表明，采用單一RT-PCR檢測SPLCV、SPFMV和SPVG，其cDNA的最低檢測量分別為0.001、0.01、10 ng(圖3a～c)；而采用多重RT-PCR檢測，在模板量為0.1 ng時能檢測到3種病毒，且條帶清晰(圖3d)，綜上多重RT-PCR檢測靈敏度為0.1 ng。多重RT-PCR較單一RT-PCR檢測靈敏度高。

圖3 單一和多重RT-PCR 靈敏度的檢測Fig.3 Sensitivities analysis of the single and multiplex RT-PCR

2.5 RT-PCR 產物的克隆及測序

分別切膠回收SPVG、SPLCV、SPFMV的 RT-PCR 產物,與PGEM-Teasy連接后轉化DH5α,經藍白斑的篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆。將測序結果與NCBI上報道的病毒基因序列對比,SPFMV擴增產物與NCBI上報道的EU021058.1,EU021062.1的序列同源性達到98%,SPVG的RT-PCR擴增產物與NCBI上報道的KC771335.1, JQ775879.1序列同源性達到99%,SPLCV的擴增產物與NCBI上報道的KP069469.1,KJ013566.1的序列同源性達到99%。

2.6 田間樣品檢測

利用優(yōu)化后的多重RT-PCR體系檢測田間甘薯樣品(圖4)。田間甘薯樣品多為幾種病毒復合性侵染。檢測結果表明,樣品2、5、6和7為SPVG、SPLCV、SPFMV復合侵染,樣品1、3為SPLCV、SPFMV侵染,樣品4受SPVG侵染嚴重,受SPLCV和SPFMV侵染較輕。本研究建立的多重RT-PCR方法可快速、高效地檢測侵染甘薯的3種病毒。

圖4 甘薯田間樣品檢測結果Fig.4 Detection results of field sweet potato samples by multiplex RT-PCR

3 結論與討論

中國不僅是甘薯種植大國,也是甘薯種質資源保存大國。無論是甘薯生產還是種質資源的保存,建立高效、靈敏的檢測技術將為中國甘薯抗病毒育種,病毒病害防治,脫毒和無病毒甘薯種薯生產提供有效的檢測手段[8]。由于甘薯易受多種病毒復合性侵染,單一RT-PCR的檢測技術只能檢測一種病毒,并費時費力[9]。隨著分子病毒學的發(fā)展,多重RT-PCR技術和多重實時熒光定量PCR技術將成為甘薯病毒檢測的良好發(fā)展方向。

由于多重RT-PCR是在同一反應體系中對多個病毒同時進行特異性擴增,并不是單一RT-PCR簡單的混合,其穩(wěn)定性沒有單一RT-PCR高,需要針對引物、反應體系和反應程序進行綜合優(yōu)化和反復試驗才能使多重 RT-PCR檢測體系達到穩(wěn)定的狀態(tài)[10-12]。其中,引物選擇對試驗的成敗起至關重要的作用, 既要使引物具有特異性,又要避免引物之間相互影響[13-15]。本研究對檢測甘薯SPVG、SPLCV、SPFMV的多重RT-PCR條件進行優(yōu)化,結果顯示,以模板濃度20 ng/μL,退火溫度53℃,延伸溫度72℃,3種病毒混合引物濃度2.0 μmol/L為最佳。應用建立的多重 RT-PCR體系對7份樣品進行檢測,經反復驗證,該體系可降低檢測成本,提高檢測效率,完全可用于甘薯病害田間檢測。

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(責任編輯：楊明麗)

Establishment of multiplex RT-PCR system for detection of three viruses in sweet potato

Jiang Suhua1, Cheng Ximei3, Song Caixia2, Xu Shenping1, Liang Fang1, Cui Bo1

(1.InstituteofBiotechnology,ZhengzhouNormalUniversity,Zhengzhou450044,China; 2.CollegeofLifeScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 3.ZhengzhouTuoyangIndustrialCo.,LTD,Zhengzhou450001,China)

Three pairs of specific primers forSweetpotatovirusG,SweetpotatoleafcurlvirusandSweetpotatofeatherymottleviruswere designed based on the conserved region sequences of the coat protein(CP) gene published in GenBank. The crucial factors of multiplex RT-PCR including annealing temperature, extension temperature, template concentration and primers concentration were optimized and a multiplex RT-PCR detection method for three sweet potato viruses was developed. Three specific fragments could be simultaneously amplified in uniplex PCR reaction, with the lengths of 800, 276 and 570 bp, respectively. Sequence analysis indicated that the fragments of three viruses shared at least 98% homology with those of the other related viruses. Sensitivity analysis demonstrated that cDNA of 0.1 ng could be detected by multiplex RT-PCR. This multiplex RT-PCR protocol can simultaneously detect three sweet potato viruses from field samples with high specificity, rapidity and sensitivity.

sweet potato; virus; multiplex RT-PCR

2016-01-29

2016-03-07

河南省科技攻關項目(092102110128);鄭州市科技計劃項目(112PPTGY250-3);鄭州市科技攻關項目(20150448)

S 435.31, Q 789

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.021

* 通信作者 E-mail: laocuibo@163.com