劉月慶, 樊 星, 周 夏, 錢(qián) 金, 楊文慶, 楊 靜, 樊 東*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030)

甘藍(lán)夜蛾CYP9A90基因的克隆及
溴氰菊酯對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)

劉月慶1, 樊 星2, 周 夏1, 錢(qián) 金1, 楊文慶1, 楊 靜1, 樊 東1*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030)

P450CYP9A家族基因與昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的抗性相關(guān)。為證實(shí)溴氰菊酯對(duì)甘藍(lán)夜蛾CYP9A基因的誘導(dǎo)效果,本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得甘藍(lán)夜蛾CYP9A基因,real-time PCR檢測(cè)該基因在甘藍(lán)夜蛾不同組織中的表達(dá)差異及溴氰菊酯處理甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)不同時(shí)間后該基因相對(duì)表達(dá)量變化,研究結(jié)果可為甘藍(lán)夜蛾對(duì)溴氰菊酯的抗性治理提供依據(jù)。結(jié)果表明:克隆得到甘藍(lán)夜蛾CYP9A基因cDNA全長(zhǎng)序列,該序列包含1 828 bp,包括1個(gè)125 bp的5′非編碼區(qū),1個(gè)104 bp的3′非編碼區(qū)和1個(gè)1 599 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼532個(gè)氨基酸,分子量約為61.1 kDa,等電點(diǎn)為8.84,GenBank登錄號(hào)為KR676343,被國(guó)際P450命名委員會(huì)命名為CYP9A90。Real-time PCR分析結(jié)果表明,該基因在甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)6個(gè)組織中表達(dá)情況不同,其中在脂肪體中表達(dá)量最高。低劑量溴氰菊酯作用后不同時(shí)間點(diǎn)CYP9A90 mRNA總體呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)趨勢(shì)。

甘藍(lán)夜蛾; P450; 基因克隆; 溴氰菊酯; 表達(dá)

細(xì)胞色素P450多功能氧化酶系(cytochrome P450 enzymes,P450s)在昆蟲(chóng)體內(nèi)主要分布于中腸、脂肪體和馬氏管等組織中[1],可代謝殺蟲(chóng)劑等多種內(nèi)源及外源性化合物[2-3],以及多種激素及信息素[4-5]。一般認(rèn)為,其對(duì)殺蟲(chóng)劑的代謝(解毒或活化)關(guān)系到昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的耐受性和殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)的選擇性,P450 介導(dǎo)的殺蟲(chóng)劑代謝解毒作用的增強(qiáng)是昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性常見(jiàn)而重要的機(jī)制[4]。已有研究表明,對(duì)二氯苯醚菊酯產(chǎn)生抗性的致倦庫(kù)蚊CulexquinquefasciatusCYP9M10基因的mRNA表達(dá)為敏感體系的264倍[6],小菜蛾對(duì)二氯苯醚菊酯抗性品系中CYP6BG1基因表達(dá)是敏感品系的4.9倍[7]。P450的可誘導(dǎo)性表現(xiàn)為昆蟲(chóng)暴露于藥劑或其他異源物質(zhì)環(huán)境下,其體內(nèi)某一種或幾種細(xì)胞色素P450的水平會(huì)顯著上升,使得解毒作用顯著增強(qiáng)[8]。其誘導(dǎo)作用增強(qiáng)了昆蟲(chóng)的解毒作用,提高了昆蟲(chóng)對(duì)環(huán)境有毒物質(zhì)的適應(yīng)能力,因此昆蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生通常表現(xiàn)為P450酶活性的增強(qiáng)和其表達(dá)量的上升[4]。用氯氰菊酯誘導(dǎo)野桑蠶Bombyxmandarina時(shí),CYP9A21基因在中腸的表達(dá)量是對(duì)照的2.1倍,導(dǎo)致野桑蠶對(duì)氯氰菊酯氧化解毒代謝作用的增加[9]。用氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)甜菜夜蛾,4個(gè)P450基因CYP9A9、CYP4G37、CYP4S11及CYP6B的表達(dá)明顯上調(diào)[10]。溴氰菊酯可以顯著增強(qiáng)褐飛虱體內(nèi)CYP303A1的表達(dá)[11]。

甘藍(lán)夜蛾MamestrabrassicaeLinnaeus,又名甘藍(lán)夜盜蟲(chóng)、夜盜蛾等,屬于鱗翅目夜蛾科,盜夜蛾亞科,為世界性分布害蟲(chóng)[12]。不僅為害甘藍(lán)、白菜、卷心菜等十字花科蔬菜,還是瓜類、豆類、茄果類、甜菜的重要害蟲(chóng)[13]。目前對(duì)于甘藍(lán)夜蛾的主要防治手段是化學(xué)防治,主要藥劑包括高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯。目前國(guó)內(nèi)外一些文章報(bào)道了P450對(duì)殺蟲(chóng)劑的代謝解毒機(jī)制,研究多在 CYP4 家族、CYP6 家族和 CYP9 家族三個(gè)與抗藥性相關(guān)的家族中[14],且Yang等通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)中CYP9A家族與氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯抗性有關(guān)[15-17],煙芽夜蛾中與硫代滅多威和氯氰菊酯抗藥性相關(guān)的基因?yàn)镃YP9A1[18-19],家蠶當(dāng)中的CYP9A22與野桑蠶中的CYP9A21均能被氯氰菊酯誘導(dǎo)[9,20]。因此,本研究對(duì)甘藍(lán)夜蛾CYP9A型基因的cDNA序列進(jìn)行克隆,將其命名為CYP9A90;并通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在各組織中的表達(dá)以及經(jīng)溴氰菊酯誘導(dǎo)后的表達(dá),為開(kāi)展甘藍(lán)夜蛾細(xì)胞色素P450基因的功能分析提供基礎(chǔ),同時(shí)也為P450酶系的抗性機(jī)理研究及甘藍(lán)夜蛾抗性治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)基地黑光燈下誘集甘藍(lán)夜蛾成蟲(chóng),將其放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光周期L∥D=14 h∥10 h,相對(duì)濕度70%,以5%蜂蜜水飼喂,待其產(chǎn)卵,幼蟲(chóng)取食未接觸任何農(nóng)藥的白菜葉,飼養(yǎng)2代后再用作試驗(yàn)材料。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒TRIzolReagent購(gòu)自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Fermentas(FBI)公司;DNA 膠回收試劑盒、克隆載體 pMD18-T、DL2000 DNA Marker、3′RACE試劑盒、5′RACE試劑盒、TapDNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司;感受態(tài)細(xì)胞Trans5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購(gòu)自TOYOBO公司;大腸桿菌DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存),其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?；驕y(cè)序由上海生工生物有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取與第一鏈cDNA的合成

選取發(fā)育良好的甘藍(lán)夜蛾5齡第1天幼蟲(chóng)為試驗(yàn)材料,提取方法根據(jù)TRIzol試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行,提取得到的RNA為模板,以dt-Adapter(表1)為cDNA合成引物,根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明進(jìn)行,合成第一鏈cDNA。

1.3.2 cDNA全長(zhǎng)序列克隆及序列分析

根據(jù)已登錄GenBank的棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(AY371318)CYP9A12和野桑蠶B.mandarina(EF535806)CYP9A22兩種昆蟲(chóng)CYP9A基因的全序列設(shè)計(jì)甘藍(lán)夜蛾CYP9A基因特異片段的簡(jiǎn)并引物Mb9-F和Mb9-R(表1)。以合成的cDNA為模板,以Mb9-F和Mb9-R為引物擴(kuò)增甘藍(lán)夜蛾CYP9AcDNA序列片段。PCR程序如下:95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min 。經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后回收目的片段,進(jìn)行純化后再克隆到pEasy-T1載體上,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,氨芐篩選,挑斑活化,鑒定后選擇陽(yáng)性克隆菌斑送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。按照得到的基因片段及試劑盒要求設(shè)計(jì)RACE嵌套引物Mb9-3′RACE-Ro,Mb9-3′RACE-Ri,Mb9-5′RACE-Ro,Mb9-5′RACE-Ri(表1),根據(jù)5′ Full RACE Kit說(shuō)明進(jìn)行5′ RACE擴(kuò)增,根據(jù)3′ Full RACE Kit說(shuō)明進(jìn)行3′ RACE擴(kuò)增。檢測(cè)RACE產(chǎn)物并進(jìn)行純化、測(cè)序,測(cè)序結(jié)果拼接。利用Blastx進(jìn)行相似性比對(duì),DNAMAN翻譯開(kāi)放閱讀框,氨基酸序列的分子量、等電點(diǎn)和信號(hào)肽等利用ExPASy在線網(wǎng)站(http:∥us.expasy.o-rg/tools/dna.html)推導(dǎo)獲得。

1.3.3 不同組織表達(dá)分析

在RNA保存液中快速解剖5齡幼蟲(chóng)20頭,獲得前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體和唾腺等6種組織。共設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。cDNA模板的制備同1.3.1。

根據(jù)CYP9A90基因全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物CYP9A-q-F和CYP9A-q-R。利用β-actin作為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)引物β-actin-F和β-actin-R(表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照qPCR Mix(Code:QPS-201)熒光定量試劑盒(TOYOBO)說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 5 min, 變性95℃ 10 s,退火60℃ 12 s,延伸72℃ 20 s,40個(gè)反應(yīng)循環(huán),最后以每1 s上升1℃的速度從60℃上升至95℃記錄熔解曲線。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行PCR相對(duì)定量分析。數(shù)據(jù)的多重比較利用SAS9.4軟件來(lái)進(jìn)行,數(shù)值均以平均值±SE進(jìn)行表示,差異顯著性分析應(yīng)用HSD檢驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè),P< 0.01。

1.3.4 溴氰菊酯對(duì)CYP9A90基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

1.3.4.1 室內(nèi)毒力測(cè)定

采用點(diǎn)滴法,用丙酮將2.5%溴氰菊酯水乳劑(拜耳作物科學(xué)(中國(guó))有限公司)稀釋成5個(gè)不同的濃度,點(diǎn)滴0.5 μL藥液于甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)第2、3腹節(jié)之間,每個(gè)處理20頭,3個(gè)重復(fù),以丙酮作對(duì)照。點(diǎn)滴后的甘藍(lán)夜蛾幼蟲(chóng)放在室溫條件下飼養(yǎng),24 h后計(jì)算死亡率。采用SAS軟件對(duì)藥劑使用劑量和昆蟲(chóng)死亡率之間進(jìn)行回歸分析。計(jì)算出5齡甘藍(lán)夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)溴氰菊酯的LD10、LD30和LD50。

圖1 甘藍(lán)夜蛾CYP9A90 cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 CYP9A90 cDNA and the deduced amino acid sequence from Mamestra brassicae

1.3.4.2 溴氰菊酯對(duì)甘藍(lán)夜蛾CYP9A90基因的誘導(dǎo)表達(dá)

分別點(diǎn)滴0.5 μL LD10、LD30和LD50濃度的溴氰菊酯于甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)第2、3腹節(jié)之間,每處理120頭,3個(gè)重復(fù),以丙酮作對(duì)照,室溫條件下飼養(yǎng),在點(diǎn)滴處理后3、6、12、24 和 48 h 分別從每個(gè)重復(fù)收集存活的幼蟲(chóng)10頭并凍存于液氮中保存。依照1.3.1方法獲得cDNA第一鏈,-80℃冰箱中保存待用。采用real-time PCR方法分析甘藍(lán)夜蛾CYP9A90基因相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系及條件參見(jiàn)1.3.3。

表1 本研究所用引物

Tabel 1 The primers used in this study

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5'-3')dt-AdapterGACTCGAGTCGACATCGA(T)17Mb9-FGGTCAAGAATGGAAAGACATGCGNTCMb9-RATGGAGTTGAAGTCGAACTTCCGCCGTMb9-3'RACE-RoCAGAGTTTGGACTGACACCGACCTCATTGCMb9-3'RACE-RiCAGGAGCGTCTGGGGCACGAGATCAAGMb9-5'RACE-RoCGCAGGAGGCTATCACGTCGTTAGMb9-5'RACE-RiCCGACCTCCACCATGAAAGGCACCATCAGACGCYP9A-q-FAAGATTTTATCGTCCGCAAAGGCYP9A-q-RGTCCAACACCGAAGGGCATβ-actin-FCCAACGGCATCCACGAGACCAβ-actin-RTCGGCGATACCAGGGTACAT

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP9A90基因的獲得及序列分析

利用RT-PCR及RACE方法獲得甘藍(lán)夜蛾細(xì)胞色素P450基因1 828 bp的全長(zhǎng)cDNA序列,包括1個(gè)125 bp的5′非編碼區(qū),1個(gè)104 bp的3′非編碼區(qū)和1個(gè)1 599 bp的開(kāi)放閱讀框。編碼532個(gè)氨基酸。氨基酸序列中包括P450蛋白特征序列FxxGxRxCxG(血紅素結(jié)合區(qū))(圖2)。通過(guò)ExPaSy在線生物軟件獲得其氨基酸序列的分子量約為61.1 kDa,等電點(diǎn)為8.84。GenBank登錄號(hào)為KR676343,國(guó)際P450命名委員會(huì)命名為CYP9A90。

圖2 CYP9A90與其他昆蟲(chóng)CYP9A 氨基酸序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences of CYP9A90 and other CYP9As

2.2 CYP9A90基因與鱗翅目其他種昆蟲(chóng)CYP氨基酸序列比對(duì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與甘藍(lán)夜蛾CYP9A90相似性高的其他昆蟲(chóng)CYP9A氨基酸序列16條,利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn),甘藍(lán)夜蛾CYP9A90與其他昆蟲(chóng)CYP9A亞家族的氨基酸序列同源性達(dá)70%以上,其中與甘藍(lán)夜蛾(AY390260)一致性最高,達(dá)86%,與棉鈴蟲(chóng)(DQ003275)、美洲棉鈴蟲(chóng)(DQ788839)、斜紋夜蛾(GQ465040)、甜菜夜蛾(AB381883)和草地貪夜蛾(KJ671577)的一致性分別為 79%、78%、72%、71%和 70%;這7種氨基酸序列均具有相似的螺旋C、螺旋K、氧結(jié)合區(qū)、血紅素結(jié)合區(qū)(圖2)。通過(guò)MEGA5.0軟件NJ法構(gòu)建鱗翅目不同昆蟲(chóng)的細(xì)胞色素P450系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明,CYP9A90推導(dǎo)出的氨基酸序列與同種的CYP9A13(AY390260)關(guān)系最近,與鱗翅目夜蛾科棉鈴蟲(chóng)(DQ003275)、美洲棉鈴蟲(chóng)(DQ788839)親緣關(guān)系較近,與斜紋夜蛾(GQ465040)、甜菜夜蛾(AB381883)和草地貪夜蛾(KJ671577)關(guān)系稍遠(yuǎn);與家蠶(AB498807)、稻縱卷葉螟(KP001131)、蘋(píng)果蠹蛾(KC832920)等非夜蛾科昆蟲(chóng)的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖3 昆蟲(chóng)CYP9A基因推導(dǎo)氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建Fig.3 Phylogenetic tree based on calculated amino acid sequences of CYP9A

2.3 CYP9A90基因在不同組織中的表達(dá)

通過(guò)real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CYP9A90在甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)的6個(gè)不同組織內(nèi)表達(dá)情況不同,其中在脂肪體中表達(dá)最高,其次是前腸、中腸和后腸,而在馬氏管和唾腺中沒(méi)有檢測(cè)到該基因的表達(dá)(圖4)。脂肪體中該基因表達(dá)量分別是中腸、前腸和后腸的4.48、6.54和98.1倍。

2.4 溴氰菊酯對(duì)CYP9A90基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

2.4.1 室內(nèi)毒力測(cè)定

經(jīng)點(diǎn)滴法測(cè)定,溴氰菊酯對(duì)甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)的LD10、LD30和LD50分別為0.152(0.017～0.335)、0.448(0.146～0.792)和0.943(0.475～1.817)ng/g(表2)。

2.4.2 低劑量溴氰菊酯對(duì)CYP9A90基因表達(dá)量的影響

為了驗(yàn)證溴氰菊酯對(duì)CYP9A90基因表達(dá)量的影響,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)溴氰菊酯LD10、LD30和LD50劑量處理甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)不同時(shí)間(3、6、12、24和48 h)后CYP9A90基因的表達(dá)狀況進(jìn)行研究。LD30和LD50誘導(dǎo)效果不理想,與對(duì)照差異不顯著,數(shù)據(jù)在此沒(méi)有列出。圖5表示低劑量溴氰菊酯LD10作用后CYP9A90基因在一定時(shí)間范圍內(nèi),排除對(duì)照影響后,各時(shí)間點(diǎn)數(shù)值均為正值,表示該基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均被誘導(dǎo),但誘導(dǎo)量存在差異。6、24和48 h表達(dá)量間差異不顯著,但這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)與3 h和12 h時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量間存在顯著差異,分別是3 h和12 h的1.40、1.43、1.31倍和4.07、4.13、3.80倍。

表2 溴氰菊酯對(duì)甘藍(lán)夜蛾5齡幼蟲(chóng)的毒力1)

Table 2 Toxicity of deltamethrin on fifth-instar larvae ofMamestrabrassicae

LD10(CI95)/ng·g-1LD30(CI95)/ng·g-1LD50(CI95)/ng·g-1毒力回歸方程Toxicityregressionequation相關(guān)系數(shù)rCorrelationcoefficient0.152(0.017～0.335)0.448(0.146～0.792)0.943(0.475～1.817)y=1.978x-0.0790.989

1) CI95: 95%的置信限。 CI95: 95% confidence interval.

圖4 CYP9A90在甘藍(lán)夜蛾不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expression pattern of CYP9A90 in different tissues of Mamestra brassicae

圖5 溴氰菊酯點(diǎn)滴后不同時(shí)間點(diǎn)CYP9A90的表達(dá)量Fig.5 Expression of CYP9A90 treated by deltamethrin at different time points

3 討論

由于P450基因在昆蟲(chóng)組織器官表達(dá)的差異性,使這些基因在昆蟲(chóng)體內(nèi)表現(xiàn)的功能也不盡相同[21]。王煒等發(fā)現(xiàn)致倦庫(kù)蚊CYP9J40基因在肌肉、消化道、卵巢、腦和胸部神經(jīng)節(jié)均有明顯表達(dá),表明了該基因參與蚊蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性,并且對(duì)雌蟲(chóng)發(fā)育有重要的影響[22]。鄭笑笑等發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾P(guān)450基因的分布也具有一定的特異性:主要分布在外源化合物進(jìn)入體內(nèi)所經(jīng)過(guò)的主要入口的一些組織中,這些組織是針對(duì)經(jīng)口、皮進(jìn)入的外源化合物的第一道防線[23]。趙華強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)家蠶CYP9A22的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有組織特異性,在中腸的表達(dá)量高于脂肪體[20]。CYP4D46基因在脂肪體中的相對(duì)表達(dá)量較高,說(shuō)明CYP4D46可能與脂肪體的重要生理功能相關(guān)。本文研究的CYP9A90基因在5齡幼蟲(chóng)脂肪體中有最高表達(dá),這可能與脂肪體的功能密切相關(guān)。在昆蟲(chóng)體內(nèi),脂肪體是最主要的代謝器官[24],因此推斷本文研究的CYP9A90基因可能參與內(nèi)源和外源物質(zhì)的代謝,也可能參與殺蟲(chóng)劑的解毒作用。隨后的試驗(yàn)將利用RNA干擾等技術(shù)探討該基因與殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)活性的關(guān)系,達(dá)到利用分子手段降低或延緩昆蟲(chóng)抗性甚至減少殺蟲(chóng)劑的目的。

外源物質(zhì)不同劑量和作用時(shí)間對(duì)P450均產(chǎn)生不同的誘導(dǎo)效應(yīng),當(dāng)外源物質(zhì)達(dá)到一定劑量并作用一定的時(shí)間后才會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用[22]。溴氰菊酯是最重要的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑,其使用范圍很廣[25]。目前,越來(lái)越多的試驗(yàn)證明很多昆蟲(chóng)已對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性,而昆蟲(chóng)體內(nèi)P450的參與是產(chǎn)生抗性的主要原因[26]。Pottelberge等發(fā)現(xiàn)巴比妥、苯巴比妥和香葉醇對(duì)二斑葉螨P450s誘導(dǎo)作用表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng),在藥劑處理1～4 h內(nèi)P450s酶活性迅速增加,而4～48 h內(nèi)其活性達(dá)到最大[27]。王學(xué)貴等發(fā)現(xiàn)氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)甜菜夜蛾,CYP9A9基因上調(diào)表達(dá)表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng),在12 h達(dá)到最大[10]。劉昌燕發(fā)現(xiàn)吡蟲(chóng)啉誘導(dǎo)大草蛉P450基因上調(diào)表達(dá)表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng),在16 h達(dá)到最高峰[28]。在本研究中,CYP9A90基因被誘導(dǎo)表達(dá),在3 h 時(shí)就開(kāi)始出現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng),至48 h時(shí)仍保持一定的誘導(dǎo)效應(yīng),總體情況下,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)表達(dá)量均為對(duì)照組的2倍左右,但在12 h出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)量明顯減少的現(xiàn)象,與對(duì)照表達(dá)量間差異不顯著。導(dǎo)致在該時(shí)間點(diǎn)排除對(duì)照影響后,其誘導(dǎo)表達(dá)量明顯低于其他各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量,其原因可能是由于此時(shí)間節(jié)點(diǎn)昆蟲(chóng)體內(nèi)特殊生理過(guò)程導(dǎo)致該基因表達(dá)量明顯下降,其具體原因有待下一步試驗(yàn)驗(yàn)證。在低劑量(LD10)溴氰菊酯條件下CYP9A90基因被誘導(dǎo)表達(dá);而在較高劑量LD30、LD50條件下,可能蟲(chóng)體受到溴氰菊酯的影響較大,不能及時(shí)對(duì)刺激做出反應(yīng),所以CYP9A90并沒(méi)有表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用(數(shù)據(jù)未列出)。因此,溴氰菊酯只能在一定的劑量范圍內(nèi)對(duì)該基因發(fā)揮誘導(dǎo)作用,劑量過(guò)高反而無(wú)誘導(dǎo)效果。但不同昆蟲(chóng)種類和不同CYP基因?qū)︿迩杈挣サ恼T導(dǎo)可能存在不同的效應(yīng),東亞飛蝗Locustamigratoria的CYP409A1和CYP408B1均可被不同濃度(LD10、LD30和LD50)的溴氰菊酯所誘導(dǎo)[29],與本研究的CYP9A90只有在LD10劑量下被誘導(dǎo)存在一定區(qū)別。在棉鈴蟲(chóng)的脂肪體中,只有低劑量溴氰菊酯誘導(dǎo)了CYP6AE14、CYP6B2、CYP6B6、CYP9A14的表達(dá)[30],與本研究結(jié)果有類似之處。

P450酶系是一個(gè)共同作用的代謝酶系,探究P450酶系中CYP基因的種類和功能將有助于更好地開(kāi)展P450的系統(tǒng)研究工作。本試驗(yàn)以對(duì)甘藍(lán)夜蛾P(guān)450基因家族的CYP9A90基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),克隆了1個(gè)新的CYP9A基因,研究了其在不同組織中的分布及表達(dá)量差異,明確了低劑量溴氰菊酯殺蟲(chóng)劑對(duì)其誘導(dǎo)反應(yīng),研究結(jié)果豐富了甘藍(lán)夜蛾P(guān)450基因家族成員,為在甘藍(lán)夜蛾體內(nèi)系統(tǒng)研究P450解毒作用,降低或延緩甘藍(lán)夜蛾抗藥性奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Cloning ofCYP9A90 and effects of deltamethrin on its mRNA expression inMamestrabrassicae

Liu Yueqing1, Fan Xing2, Zhou Xia1, Qian Jin1, Yang Wenqing1, Yang Jing1, Fan Dong1

(1.CollegeofAgriculture，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China；2.CollegeofResourcesandEnvironment，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

Genes inCYP9Asubfamily of P450 are associated with the resistance of insects to pyrethroids. In order to verify the induction effect of deltamethrin toCYP9AinMamestrabrassicae, RT-PCR and RACE were used to clone the full-length cDNA sequence ofCYP9Agene. Its mRNA expression profiles in different tissues at fifth-instar larvae and the effect of deltamethrin were detected by real-time PCR.The results would give us a basis for resolving the management problem of the resistance ofM.brassicaeto deltamethrin. The results showed that the cDNA sequence was 1 828 bp in length, which contained a 125 bp 5′-untranslated region, a 104 bp 3′ untranslated region and a 1 599 bp open reading frame, and coded a polypeptide of 532 amino acid residues with a predicted molecular weight of 61.1 kDa and pI 8.84 (GenBank accession no. KR676343). It was namedCYP9A90 by the P450 Nomenclature Committee. The real-time quantitative RT-PCR assay showed thatCYP9A90 gene expression levels were different in six tissues of the fifth-instar larvae. The expression level was at the highest point in fat body. Low dosage of deltamethrin treatment could induceCYP9A90 mRNA expression at different time points after treatment.

Mamestrabrassicae; cytochrome P450; cloning; deltamethrin; expression

2016-06-20

2016-07-21

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531045)

Q 785， S 436.35

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.009

* 通信作者 E-mail:dnfd@163.com