石彥龍， 徐國(guó)娟， 王旭麗， 王國(guó)梁

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

轉(zhuǎn)錄因子OsEIL2正調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性

石彥龍， 徐國(guó)娟， 王旭麗*， 王國(guó)梁*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

紋枯病(sheath blight)是水稻三大病害之一,對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),水稻受到紋枯病菌侵染時(shí),與擬南芥EIN3同源的基因OsEIL2表達(dá)量顯著升高,預(yù)示OsEIL2與水稻對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)相關(guān)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,構(gòu)建了OsEIL2-RNAi植株,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析表明,該基因被特異性沉默,接種結(jié)果顯示,OsEIL2沉默后,水稻對(duì)紋枯病菌感病性增強(qiáng)。通過(guò)水稻原生質(zhì)體和煙草亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)該基因定位于細(xì)胞核,酵母單雜交結(jié)果表明,該基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性。在OsEIL2-RNAi植株中,乙烯合成關(guān)鍵酶的編碼基因OsACO1表達(dá)量下降。綜上,OsEIL2是一個(gè)與擬南芥EIN3蛋白同源的轉(zhuǎn)錄因子,能正調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性。

水稻; 紋枯病; 抗病; OsEIL2; 轉(zhuǎn)錄因子

水稻是全球種植最普遍的農(nóng)作物之一,超過(guò)半數(shù)的人口以稻米為主食[1]。各種病蟲害的發(fā)生是造成水稻產(chǎn)量損失的主要因素,如,由立枯絲核菌Rhizoctoniasolani引起的水稻紋枯病(rice sheath blight)。該病是水稻世界性病害,一般發(fā)生時(shí)可造成減產(chǎn)10%～30%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%[2]。由于水稻對(duì)紋枯病的抗性屬于典型的數(shù)量性狀,迄今未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗種質(zhì),抗病育種一直進(jìn)展緩慢,加之近年來(lái)矮化育種及高肥密植栽培技術(shù)的采用,由紋枯病造成的危害逐漸加重,在我國(guó)南方部分稻區(qū)已被認(rèn)為是水稻第一大病害。水稻紋枯病菌是一種死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌,現(xiàn)有研究表明,植物對(duì)該類病菌的防衛(wèi)反應(yīng)通常涉及乙烯(ethylene,ET)、 茉莉酸(jasmonic acid,JA)兩種植物激素信號(hào)通路[3]。Helliwell等[4]將乙烯合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,OsACS2)的編碼基因在水稻中過(guò)表達(dá)后,內(nèi)源乙烯含量明顯升高,轉(zhuǎn)基因植株對(duì)紋枯病的抗性顯著增強(qiáng),表明乙烯參與水稻對(duì)紋枯病的抗性。

乙烯是一種內(nèi)源植物氣體激素,在植物生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)生物和非生物脅迫響應(yīng)等許多方面起著重要作用[5-6]。通過(guò)遺傳學(xué)方法,現(xiàn)已鑒定出了擬南芥中乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要基因,初步描繪出了一條近似線性的乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑。當(dāng)乙烯不存在時(shí),乙烯受體蛋白可結(jié)合并激活CTR1(constitutive triple response 1),從而抑制下游轉(zhuǎn)錄因子EIN2(ethylene insensitive 2)和EIN3/EIL(ethylene insensitive 3/EIN3-like),使其處于非激活狀態(tài);受體蛋白一旦結(jié)合乙烯,則阻止其與CTR1的結(jié)合及其激酶活性的激活,下游反應(yīng)也不再受抑制,EIN2進(jìn)而激活EIN3/EIL,觸發(fā)轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng),建立乙烯響應(yīng)[7-9]。

目前,EIN3/EILs被認(rèn)為是乙烯、茉莉酸和水楊酸(salicylic acid, SA)信號(hào)通路交匯的節(jié)點(diǎn),并通過(guò)這些信號(hào)通路參與植物防衛(wèi)反應(yīng)[10-12],促進(jìn)植物選擇合適的防御策略應(yīng)對(duì)不同生活類型的病原菌[13-15]。因此推測(cè)水稻中EIN3/EILs蛋白在抗病反應(yīng)中具有重要作用,通過(guò)同源克隆的方法,在水稻中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)EIN3/EIL蛋白[16]。Yang等[17]發(fā)現(xiàn),OsEIL1和OsEIL2沉默后,水稻對(duì)鹽脅迫耐受性增強(qiáng),但EIN3/EILs家族在水稻對(duì)紋枯病抗性中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)基因芯片技術(shù),發(fā)現(xiàn)水稻受到紋枯菌侵染時(shí),與擬南芥EIN3同源的轉(zhuǎn)錄因子OsEIL2的編碼基因表達(dá)量顯著升高。OsEIL2的表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi),在酵母中表現(xiàn)出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性,該基因沉默后,乙烯合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase1, OsACO1)的編碼基因表達(dá)量顯著降低,水稻對(duì)紋枯病菌感病性顯著增強(qiáng)。對(duì)該基因的研究,將有助于水稻中乙烯信號(hào)通路的解析及乙烯參與抗病的分子機(jī)制的研究,可為培育持久廣譜抗病水稻新品種提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

水稻品種‘日本晴’及紋枯菌YN-7菌系為本實(shí)驗(yàn)室保存,轉(zhuǎn)化用水稻品種‘泰粳394’(TG394)為揚(yáng)州大學(xué)左示敏老師惠贈(zèng);載體pENTR、pDBL03為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院瞿紹洪老師惠贈(zèng),pCaMV35S:mVenus載體由北京農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心姚磊博士饋贈(zèng),pDBLeu載體為本實(shí)驗(yàn)室保存;Gateway LR Clonase II Enzyme Mix試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司,各種限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及測(cè)序由北京華大基因公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紋枯菌的接種及病情調(diào)查

參照王子斌等[18]和徐國(guó)娟等[19]的方法,并略作改動(dòng)。即從馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Becton Dickinson and Company公司)上用打孔器打取菌餅,將菌餅菌絲面緊貼水稻莖基部進(jìn)行接種。接種7 d后調(diào)查每株幼苗的相對(duì)病級(jí)。相對(duì)病級(jí)=(病斑攀升高度/植株地上部高度)×9,通過(guò)DPS 3.01對(duì)各品種的相對(duì)病級(jí)進(jìn)行方差分析,并用最小顯著差異法(LSD法) 進(jìn)行品種間病級(jí)的多重比較。

1.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR分析

按照產(chǎn)品使用說(shuō)明,用TRIzol(Invitrogen)從水稻葉片中提取總RNA,用DNaseI(全式金)去除RNA中的DNA,然后取2 μg RNA用M-MLV(Promega)反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。

在進(jìn)行qRT-PCR前,先將cDNA稀釋20倍,然后用BIO-RAD iQ2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè),20 μL反應(yīng)體系包括:稀釋后的cDNA 5 μL, SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)10 μL,正反引物各1 μL,以及超純水 3 μL。程序如下:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,48個(gè)循環(huán);然后建立熔解曲線,55℃保持30 s,每30 s升溫0.5℃,遞增到95℃,共進(jìn)行81個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù),以Actin或Ubiquitin(表1)做內(nèi)參,用2-ΔCt法取3次重復(fù)的平均值,用GraphPad Prism 5.01作圖并進(jìn)行方差分析和多重比較。

1.2.3 OsEIL2分離及克隆

按照上述方法獲得‘日本晴’cDNA,根據(jù)MSU(http:∥rice.plantbiology.msu.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋,設(shè)計(jì)特異性引物:OsEIL2-F和OsEIL2-R(表1),然后通過(guò)高保真聚合酶Fast-pfu(全式金)和RT-PCR獲得OsEIL2 (LOC_Os07g48630)的全長(zhǎng)編碼序列,最后按照產(chǎn)品說(shuō)明書將其連接至pEASY-Blunt(全式金)平末端載體上,將獲得的pEASY-Blunt-OsEIL2載體用M13-F/R引物測(cè)序,檢測(cè)是否有突變。

1.2.4 載體構(gòu)建

OsEIL2-RNAi載體的構(gòu)建采用Gateway技術(shù),先用特異性引物OsEIL2-Ri-F和OsEIL2-Ri-R(表1)擴(kuò)增出OsEIL2編碼序列起始密碼子后的939～1 239 bp區(qū)段,酶切連接至入門載體pENTR,測(cè)序正確后,利用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix試劑盒與pBDL03進(jìn)行重組反應(yīng)構(gòu)建得到OsEIL2-RNAi載體。

為了確定OsEIL2的亞細(xì)胞定位,將1.2.3中獲得的OsEIL2編碼序列全長(zhǎng),通過(guò)XbaI和XhoI位點(diǎn)連接到黃色熒光蛋白mVenus的氨基端編碼序列前,獲得花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子調(diào)控的載體pCaMV35S:OsEIL2-mVenus。

為了驗(yàn)證OsEIL2蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能,用特異性引物:pDBLeu-OsEIL2-F和pDBLeu-OsEIL2-R(表1),以pEASY-Blunt-OsEIL2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后用酶切和T4 DNA連接酶連接的方法融合到pDBLeu載體的GAL4 DNA結(jié)合域讀碼框后,獲得pDBLeu-OsEIL2載體。

表1 文中所用引物列表

Table 1 Primers used in this study

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence擴(kuò)增引入的限制性酶切位點(diǎn)Amplication-createdrestrictionsiteOsEIL2-Ri-FCgggatccTCAGTCCAAGTGCCTCCAGBamHIOsEIL2-Ri-RCCGctcgagCATCAGCGGCATGATCAGGXhoIOsEIL2-FAGtctagaATGATGGGAGCAGCGGTGXbaIOsEIL2-RGCctcgagGTAGAACCAGTTGGATCXhoIpDBLeu-OsEIL2-FAAcccgggtATGATGGGAGCAGCGGTGSmaIpDBLeu-OsEIL2-RCAgcggccgcGTAGAACCAGTTGGATCNotIOsEIL1-qFTGCTCAAGATGATGGAGGTG-OsEIL1-qRGGTCGAAGCGGACCTTCT-OsEIL2-qFGGGCTGATGACCATGTACG-OsEIL2-qRTCGCGGATGAAGAAATTAGC-OsACO1-qFGCAGGTACAAGAGCGTGATG-OsACO1-qRTGCCAGGGTTGTAGAAGGAC-Actin-qFTGAAGATCAAGGTGGTGGCAC-Actin-qRTGCTGGACCCGACTCATCATA-Ubi-qFAAGAAGCTGAAGCATCCAGC-Ubi-qRCCAGGACAAGATGATCTGCC-PR1a-qFGGAAGTACGGCGAGAACATC-PR1a-qRTGGTCGTACCACTGCTTCTC-

1.2.5 水稻轉(zhuǎn)化

水稻轉(zhuǎn)化由北京大北農(nóng)生物科技中心完成,以‘TG394’為受體材料,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將OsEIL2-RNAi載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷;從公司獲得轉(zhuǎn)基因植株,在廊坊溫室種植、鑒定和繁種。

1.2.6 植物材料

水稻種子脫殼后,按照Park等[20]的方法進(jìn)行表面消毒,然后均勻鋪于1/2MS培養(yǎng)基上催芽,以保證起始長(zhǎng)勢(shì)一致。于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周后,將水稻幼苗移栽于廊坊溫室土壤中,一個(gè)月左右進(jìn)行接種。

煙草Nicotianabenthamiana種子用同樣的方法催芽后移栽到32穴穴盤中,在生長(zhǎng)室中培養(yǎng),4～6周后注射農(nóng)桿菌。

1.2.7 農(nóng)桿菌侵染煙草試驗(yàn)

在煙草中,按照Ning等[21]的方法,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。首先將pCaMV35S:OsEIL2-mVenus載體用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中,然后挑選陽(yáng)性菌株與P19分別在28℃搖床中220 r/min搖動(dòng)培養(yǎng),接著離心收集農(nóng)桿菌菌體,將兩者A600分別調(diào)整為1.5和1.0后1∶1混合,黑暗處?kù)o置3 h后,選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的煙草葉片進(jìn)行注射。

3 d后,用蔡司LSM780倒置激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。DAPI染色時(shí),在觀察前將其注入煙草葉片,DAPI和mVenus分別用405 nm和514 nm激光激發(fā),發(fā)射光檢測(cè)波長(zhǎng)分別為410～503 nm和519～621 nm,物鏡為40×、數(shù)值孔徑為1.3的油鏡。

1.2.8 水稻原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化

水稻原生質(zhì)體的制備及亞細(xì)胞定位的方法參見(jiàn)Zhang等[22]的方法進(jìn)行。將10～12 d左右的水稻黃化苗的莖稈部分切成0.5 mm左右大小,然后在酶解液(1.0%纖維素酶RS,0.5%離析酶R-10,0.6 mol/L甘露醇,10 mmol/L MES,pH 5.7,10 mmol/L CaCl2和0.1% BSA)中酶解5～7 h;酶解結(jié)束,用40 μm尼龍篩過(guò)濾獲得濾液,離心收集其中的原生質(zhì)體,用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,將目的質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到獲得的原生質(zhì)體中,培養(yǎng)16～36 h后,通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。DAPI染色時(shí),將DAPI與轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體混勻,使DAPI終濃度為20 μg/mL,放置5 min左右觀察,拍照方法同上。

1.2.9 酵母轉(zhuǎn)錄激活活性分析

按照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Alkali Cation Yeast Transformation Kit,MP Biomedicals)說(shuō)明書,將目標(biāo)質(zhì)粒pDBLeu-OsEIL2和對(duì)照質(zhì)粒pDBLeu分別轉(zhuǎn)入酵母菌株Mav203;30℃生長(zhǎng)3 d左右,挑選單個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,30℃搖床220 r/min條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng),然后用無(wú)菌蒸餾水稀釋,獲得1、10-1、10-2、10-34個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度各吸取6 μL分別在含有0 mmol/L和70 mmol/L 3-AT(Sigma)的亮氨酸和組氨酸缺陷型培養(yǎng)基SD/-Leu-His平板上培養(yǎng),根據(jù)其生長(zhǎng)情況分析其轉(zhuǎn)錄活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsEIL2克隆與序列分析

根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)LOC_Os07g48630在接種紋枯菌后表達(dá)量顯著上調(diào)。通過(guò)基因登錄號(hào)在Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站(http:∥rice.plantbiology.msu.edu/Analyses_Search_locus.shtml)搜索該基因,發(fā)現(xiàn)其位于7號(hào)染色體上,具有2個(gè)剪接變體,但只有非編碼區(qū)序列不同,因此編碼相同的氨基酸,編碼區(qū)核苷酸序列長(zhǎng)1 782 bp,編碼593個(gè)氨基酸,分子量65.1 kD,等電點(diǎn)5.213 4。根據(jù)Mao等[16]的研究,將該基因命名為OsEIL2,其編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥EIN3同源,屬于EIN3/EILs轉(zhuǎn)錄因子家族(圖1),在乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有重要作用。通過(guò)RT-PCR方法,本研究克隆了OsEIL2的全長(zhǎng)編碼序列。

2.2 OsEIL2在OsEIL2-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)受到特異性抑制

由于該基因在抗病反應(yīng)中表達(dá)量上調(diào),為研究其功能,便選取OsEILs家族中不太保守的位于OsEIL2 3′端的300個(gè)堿基對(duì),構(gòu)建OsEIL2-RNAi載體。由于OsEIL1和OsEIL2的相似性最高(圖1a),因此為了進(jìn)一步確定基因沉默的特異性,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分別檢測(cè)兩者在OsEIL2-RNAi水稻和野生型‘TG394’中的表達(dá)量。如圖2a所示,與‘TG394’相比,OsEIL2在6號(hào)株系中的表達(dá)顯著下調(diào),而在2、21、22、25號(hào)株系中則極顯著下調(diào),而OsEIL1在各轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)與對(duì)照間無(wú)顯著差異(圖2b)。以上結(jié)果表明OsEIL2在其RNAi植株中的表達(dá)受到了特異性抑制。

圖1 水稻OsEILs蛋白與擬南芥AtEIN3進(jìn)化關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of rice OsEILs and Arabidopsis EIN3

圖2 轉(zhuǎn)基因水稻中OsEIL2的表達(dá)受到特異性抑制Fig.2 The expression of OsEIL2 is specifically suppressed in the transgenic rice

2.3 OsEIL2-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)紋枯病的感病性增強(qiáng)

本研究選擇表達(dá)量顯著下調(diào)的OsEIL2-RNAi株系做了進(jìn)一步的抗病性檢測(cè),鑒定結(jié)果表明(表2),抗病對(duì)照‘YSBR1’與感病對(duì)照 ‘Lemont’間差異達(dá)極顯著水平,說(shuō)明鑒定試驗(yàn)可靠。OsEIL2-RNAi株系比野生型均更加感病(圖3),平均病情指數(shù)比野生型高1.5以上,在0.01顯著水平上,OsEIL2-RNAi轉(zhuǎn)基因植株病情指數(shù)與野生型間均存在顯著差異。以上結(jié)果表明OsEIL2在水稻對(duì)紋枯病的抗性中起著正調(diào)控作用。

圖3 OsEIL2-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻接種紋枯病菌表型Fig.3 Phenotype of OsEIL2-RNAi transgenic events inoculated with Rhizoctonia solani

品種/干擾系Cultivar/RNAiline平均病情指數(shù)Averagediseaseindex5%顯著水平5%Significantlevel1%顯著水平1%SignificantlevelLemont6.8380aAOsEIL2-Ri-6-17.2106aAOsEIL2-Ri-22-16.4639abAOsEIL2-Ri-21-16.3632abAOsEIL2-Ri-2-16.2587abAOsEIL2-Ri-25-16.2236bAWT4.7132cBYSBR13.2038cB

1) WT表示野生型植株,‘Lemont’和‘YSBR1’分別為高感和抗病對(duì)照;平均病情指數(shù)為15個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值,方差分析和多重比較通過(guò)DPS 3.01完成,小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05),大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。 WT: Wild type. ‘Lemont’ is a highly susceptible variety; ‘YSBR1’ is a resistant variety; average disease scores are the means of 15 biological replicates; analyses of variety and multiple comparison test are completed using DPS 3.01 and different lowercase letters represent significant differences (P<0.05) while different capital letters represent highly significant differences (P<0.01).

2.4 OsEIL2定位于水稻和煙草細(xì)胞核

蛋白序列分析表明,OsEIL2包含一個(gè)核定位信號(hào),預(yù)示其可能定位于細(xì)胞核。本研究分別采用水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究。激光共聚焦掃描顯微鏡照片(圖4)顯示,OsEIL2-mVenus融合蛋白的熒光特異性地出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染化細(xì)胞的細(xì)胞核部位,且能與細(xì)胞核指示劑DAPI的藍(lán)色熒光很好地疊加,而空白載體對(duì)照的黃色熒光(為便于與DAPI疊加,此處用綠色代表其熒光信號(hào))則出現(xiàn)在細(xì)胞的各個(gè)部位,表明OsEIL2特異性地在水稻原生質(zhì)體和煙草葉肉細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。

2.5 OsEIL2在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活功能

為了檢測(cè)OsEIL2是否具有轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)行了酵母單雜交試驗(yàn)。由于酵母Mav203本身有一定的組氨酸本底表達(dá),所以轉(zhuǎn)化pDBLeu-OsEIL2載體和對(duì)照空載體的酵母在選擇培養(yǎng)基(selective dropout-leucine-histidine,SD-L-H)上都能正常生長(zhǎng)(圖5a)。但是,當(dāng)在SD-L-H培養(yǎng)基中加入組氨酸合成酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1, 2,4-triazole, 3-AT)后,只有轉(zhuǎn)化pDBLeu-OsEIL2載體的酵母生長(zhǎng)正常,而轉(zhuǎn)化pDBLeu空載體的酵母不生長(zhǎng)(圖5b),表明OsEIL2具有激活報(bào)告基因表達(dá)的功能,即具有轉(zhuǎn)錄激活功能。

2.6 OsACO1在OsEIL2-RNAi植株中的表達(dá)受抑制

植物的抗病反應(yīng)常常與SA和ET/ JA之間的協(xié)同或拮抗有關(guān),為了進(jìn)一步探究OsEIL2介導(dǎo)的對(duì)紋枯病的抗性機(jī)制,我們通過(guò)qRT-PCR的方法,檢測(cè)了在OsEIL2-RNAi植株中,PR1a、OsACO1等植物激素標(biāo)記基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,OsEIL2沉默后,一個(gè)乙烯合成關(guān)鍵酶的編碼基因OsACO1表達(dá)量顯著下調(diào)(圖6a),而SA通路的相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)明顯變化(圖6b)。

3 討論

水稻全基因組測(cè)序的完成、生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展為水稻基因的研究提供了極大的便利。本研究基于基因芯片數(shù)據(jù),對(duì)接種紋枯菌后差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)OsEIL2的表達(dá)受紋枯菌的誘導(dǎo),OsEIL2蛋白與擬南芥EIN3轉(zhuǎn)錄因子同源,預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白包含一個(gè)核定位信號(hào),通過(guò)水稻原生質(zhì)體和煙草葉肉細(xì)胞證實(shí)其定位于細(xì)胞核,并具有轉(zhuǎn)錄激活的特性,進(jìn)一步接種發(fā)現(xiàn)OsEIL2正調(diào)控水稻對(duì)紋枯病的抗性。

圖4 OsEIL2在水稻原生質(zhì)體和本生煙中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of OsEIL2 in rice protoplast and Nicotiana benthamiana

圖5 酵母中OsEIL2轉(zhuǎn)錄活性分析Fig.5 Transactivation analysis of OsEIL2 protein in yeast

圖6 OsACO1和PR1a在OsEIL2-RNAi 植株中的表達(dá)情況Fig.6 The expression of OsACO1 and PR1a in OsEIL2-RNAi transgenic lines

Mao等[16]的研究表明,在OsEIL1超表達(dá)水稻中OsACO1的表達(dá)上調(diào),與其結(jié)果相一致,在OsEIL2-RNAi植株中,乙烯合成基因OsACO1(圖6)的表達(dá)顯著下調(diào),然而這個(gè)結(jié)果與Jun等[23]的結(jié)果相矛盾,他們發(fā)現(xiàn)在OsEIN2沉默植株中的OsACO1的表達(dá)上升。OsACOs催化乙烯合成的最后一步反應(yīng),將ACC氧化成乙烯[24]。已經(jīng)知道,在擬南芥中,EIN3等乙烯轉(zhuǎn)錄因子還受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)控,乙烯處理能夠上調(diào) F-box蛋白EBF2的轉(zhuǎn)錄,而EBF2能識(shí)別、結(jié)合并介導(dǎo)EIN3的降解,從而使乙烯反應(yīng)不至于過(guò)強(qiáng)[25-26],因此推測(cè)OsEIL2與OsACO1之間也存在某種反饋調(diào)節(jié),具體機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

在雙子葉植物中,已經(jīng)證明ET和JA介導(dǎo)的抗病機(jī)制在植物防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要作用,尤其是對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌,而SA介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性通常對(duì)活體和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌有效[27-29]。紋枯菌是死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌[30],OsEIL2-RNAi植株中OsACO1的表達(dá)下降,推測(cè)內(nèi)源乙烯的合成受到影響,導(dǎo)致更加感病,而SA通路相關(guān)基因無(wú)明顯變化,這與之前的研究相一致,進(jìn)一步說(shuō)明針對(duì)不同類型的病原菌單子葉和雙子葉植物可能有相同的抗病響應(yīng)機(jī)制。Helliwell等[4]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將內(nèi)源乙烯合成量增加后,水稻對(duì)紋枯病抗性增強(qiáng),這從反面印證了本研究的結(jié)果,但其發(fā)現(xiàn)PR基因表達(dá)的升高是對(duì)紋枯病抗性增強(qiáng)的原因之一,而本研究則未發(fā)現(xiàn)PR基因表達(dá)的降低。這些矛盾的結(jié)果,使全面研究乙烯合成、乙烯信號(hào)傳導(dǎo)和其他因子在OsEIL2介導(dǎo)的水稻抗病反應(yīng)中的作用變得十分必要。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)OsEIL2蛋白可能通過(guò)參與調(diào)控乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑并反饋乙烯合成途徑影響乙烯激素的合成,進(jìn)而調(diào)節(jié)水稻對(duì)紋枯病的抗性,該結(jié)果不僅為研究水稻中該類EIN3轉(zhuǎn)錄因子參與抗病的重要功能揭開(kāi)序幕,而且可為揭示寄主植物對(duì)不同類型病原菌表現(xiàn)出不同抗病反應(yīng)的分子機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Transcription factor OsEIL2 positively regulates rice resistance to sheath blight

Shi Yanlong, Xu Guojuan, Wang Xuli, Wang Guoliang

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

Sheath blight, caused byRhizoctoniasolani, is one of the three most destructive diseases in rice (Oryzasativa), which causes severe yield losses and bad quality under favorable disease conditions. Genechip data showed that the expression ofOsEIL2, a homolog of theArabidopsis(Arabidopsisthaliana)ETHYLENEINSENSITIVE3 (EIN3), was significantly induced in rice byR.solaniinfection, suggesting a possible involvement ofOsEIL2 in the defense againstR.solani. In this study, we generatedOsEIL2-RNAi transgenic events through agrobacteria-mediated transformation. Quantitative RT-PCR assays showed that the transcription ofOsEIL2 was specifically silenced in these transgenic events. Inoculation results showed that theOsEIL2 RNAi plants displayed more susceptibility toR.solani. Further, subcellular localization analyses revealed that OsEIL2 was localized in the nucleus of rice protoplasts and tobacco leaves. Yeast one-hybrid assays showed that OsEIL2 exhibited transcriptional activity. In addition, the transcripts ofOsACO1, a key gene for ethylene biosynthesis, was down-regulated in theOsEIL2-RNAi plants. Taken together, we conclude that OsEIL2, an ortholog ofArabidopsisEIN3, is a transcription factor and positive regulator of rice resistance toR.solani.

Oryzasativa; rice sheath blight; disease resistance; OsEIL2; transcription factor

2016-03-24

2016-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31671984);轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2012ZX08009001)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31471737)

S435.111

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.008

* 通信作者 E-mail: lilywang0313@163.com；wang.620@osu.edu