張曉巖 張先鈞 賈 煒 蒲小燕 王海燕 梁 宏 李鳳輝 張 杰

(青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810016)

·基礎(chǔ)研究·

西紅花苷對急性高海拔低氧條件大鼠腦海馬P53 表達及凋亡的影響

張曉巖 張先鈞 賈 煒 蒲小燕 王海燕 梁 宏 李鳳輝 張 杰

(青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810016)

目的 探討西紅花苷提前用藥對急性高海拔低氧條件下大鼠腦海馬神經(jīng)細胞凋亡及P53表達的影響。方法 SD大鼠隨機分為低氧對照組和低氧用藥組，用藥組每天肌肉注射西紅花苷(50 mg/kg)，對照組每天肌肉注射相同劑量的 0.9% NaCl，連續(xù)給藥3 d后運至海拔4 200 m，在第1、3、5、7天取材。TUNEL 法檢測大鼠腦海馬CA1區(qū)細胞凋亡，通過RT-PCR 方法檢測腦海馬P53 mRNA 水平，通過Western印跡法檢測P53蛋白水平。結(jié)果 與低氧對照組相比，用藥組大鼠腦海馬細胞凋亡率在第1、3、5、7天明顯降低(P<0.05)；P53 mRNA及蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 西紅花苷能通過下調(diào)急性高海拔低氧條件下大鼠腦海馬 P53的表達、降低腦海馬細胞的凋亡率達到保護腦海馬神經(jīng)元的作用。

西紅花苷;低氧;P53;凋亡

急性低氧條件常引起不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷〔1〕，因此，利用藥物干預保護急性低氧條件下腦神經(jīng)是高原腦病研究的主要方向之一。藏紅花為鳶尾科植物番紅花(Crocus sativus L.)的干燥柱頭,傳統(tǒng)醫(yī)學研究認為其性平、味甘,歸心、肝經(jīng),具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神、抗抑郁等功效,《本草品匯精要》記載“主散郁調(diào)血，寬胸膈，開胃進食，久服滋下元，悅顏色，及治傷寒發(fā)狂”。西紅花苷(Crocin)是藏紅花主要有效成分可以抑制腦海馬β-淀粉樣蛋白誘導的細胞凋亡〔2〕、抗氧化，治療腦梗死，對神經(jīng)變性損壞和缺血性腦損傷有保護作用，改善學習記憶障礙等〔3，4〕。然而，西紅花苷調(diào)控急性低氧條件下腦海馬細胞凋亡的具體分子機制并不十分清楚。本實驗初步探討西紅花苷抑制急性低氧條件下腦海馬凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠，體重約180～200 g,北京大學實驗動物中心提供，許可證編號SCXK(京)2011-0012。在動物房中適應環(huán)境1 w后開始進行實驗。

1.2 藥品與試劑 西紅花苷(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO.,LTD.)；dUTP擊知末端標記測定法(TUNEL)試劑盒(Promega公司)，烏拉坦(Adamas Reagent Co.,Ltd.)；小鼠抗大鼠β-actin一抗(Abcam)；小鼠抗大鼠P53一抗(Abcam)；山羊抗小鼠二抗及辣根過氧化物酶顯色試劑盒(武漢博士德)；總RNA提取試劑盒；DNA Marker I、瓊脂糖(TIANGEN)。β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′,下游引物5′-CAACACAGCCTGGATGGCTA-3′(480 bp)；P53上游引物5′-AAGCCCTCCAAGTGTCAGC-3′,下游引物5′-CGTCACCATCAGAGCAACG-3′(372 bp)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 儀器 CX31-32C02奧林巴斯光學顯微鏡，PM-20 型全自動顯微攝影儀，DYCZ-24DN型雙垂直電泳槽，DYY-7C型電泳儀，5418R高速離心機，TC-XP-G基因擴增儀等。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及取材 雄性SD大鼠96只，隨機分為低氧對照組、低氧用藥組。低氧用藥組每天肌肉注射西紅花苷一次(50 mg/kg)〔5〕，低氧對照組每天肌肉注射相同體積的0.9%NaCl，連續(xù)給藥3 d后運至高海拔低氧環(huán)境(青海省果洛州甘德縣,海拔4 200 m)。第1、3、5、7天取材，25%烏拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,斷頭處死，快速取出全腦冰上剝離海馬，置于液氮中保存。

1.4.2 TUNEL 法檢測腦海馬細胞凋亡 按TUNEL檢測試劑盒說明操作。取各組大鼠腦海馬常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水，然后室溫0.85% NaCl 沖洗5 min;磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，接著蛋白酶 K(20 μg/ml)消化30 min(37℃)，PBS 沖洗5 min;而后緩沖液室溫下處理5 min，加入100 μl TUNEL 反應混合液于37℃孵育60 min，PBS 沖洗，然后加入檸檬酸緩沖液(SSC)終止反應。PBS 沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度復染，光鏡下觀察細胞核呈棕褐色染色的細胞為TUNEL染色陽性細胞，在400倍下觀察5個不連續(xù)的視野。采用Image Pro Plus 4.5 圖像分析軟件進行凋亡細胞計數(shù)。

1.4.3 RT-PCR檢測 按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取大鼠海馬組織RNA,測RNA濃度；然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進行實驗，測DNA濃度。進而進行PCR擴增。PCR反應體系：模板2 μg,引物各1 μl，Mix 25 μl，用ddH2O補至50 μl。PCR體系反應條件：95℃ 5 min,95℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min,4℃ 1 h，30個循環(huán)。凝膠電泳條件：2%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳液，5 μl樣品上樣量，3 μl MarkerⅠ上樣量，電壓100 V，電泳時間35 min。取出凝膠，用BIO-RAD凝膠成像儀成像拍攝圖片，用Quantity one 軟件檢測P53與β-actin相對表達量。

1.4.4 Western印跡法檢測P53蛋白表達 提取大鼠腦海馬組織蛋白，用BCA法測定蛋白量。取30 μl蛋白樣品上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移1.5 h至硝酸纖維素膜(NC)上，5%脫脂奶粉封閉2 h后與1∶500稀釋的小鼠抗大鼠β-actin一抗，1∶100稀釋的小鼠抗大鼠P53一抗于4 ℃過夜，與1∶1 000稀釋的二抗室溫孵育30 min，再與化學發(fā)光劑(ECL)室溫作用1 min，曝光、顯影和定影。膠片掃描后，采用Quantity One軟件對顯影條帶進行分析，以目的條帶與β-actin條帶灰度的比值作為蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL法檢測腦海馬細胞凋亡 低氧用藥組凋亡率在第1、3、5、7天明顯低于低氧對照組(P<0.05)。低氧對照組凋亡率于第1、3、5天高表達；第7天有所下降且與組內(nèi)其他時間比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低氧用藥組凋亡率在第1、3、5、7天逐漸升高但仍然低于低氧對照組(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 TUNEL 法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細胞結(jié)果(↑凋亡細胞，×400)

組別1d3d5d7d低氧對照組12.65±0.911)15.90±2.191)18.72±1.141)10.18±0.681)低氧用藥組2.32±0.781)4.90±1.141)7.05±0.821)8.98±0.671)t/P值-19.21/0.00-9.97/0.00-18.47/0.00-2.77/0.02

與同組其他時間比較：1)P<0.05；下表同

2.2 RT-PCR結(jié)果 低氧用藥組相對表達量在第1、3、5、7天明顯低于低氧對照組(P<0.05)。低氧對照組P53 mRNA的相對表達量于第1、3天、5天高表達，第7天有所下降且與組內(nèi)其他組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低氧用藥組P53 mRNA的相對表達量在第1、3、5、7天逐漸升高但仍然低于低氧組(P<0.05)。見圖2，表2。

2.3 Western印跡檢測P53蛋白表達結(jié)果 低氧用藥組相對表達量在第1、3、5、7天明顯高于低氧對照相(P<0.05)。低氧對照組P53蛋白的表達量于第1、3、5天逐漸升高，第7天有所下降(P<0.05)；低氧用藥組P53蛋白的表達量在第1、3、5、7呈逐漸上升趨勢且兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3，表2。

圖2 各組大鼠海馬P53 mRNA的表達

圖3 Western印跡檢測各組P53蛋白的表達

組別P53/β-actinmRNA1d3d5d7dP53/β-actin蛋白1d3d5d7d低氧對照組0.27±0.021)0.34±0.021)0.31±0.031)0.20±0.011)0.32±0.021)0.35±0.021)0.40±0.021)0.28±0.011)低氧用藥組0.07±0.021)0.12±0.011)0.16±0.011)0.18±0.011)0.06±0.011)0.13±0.011)0.21±0.021)0.25±0.011)t/P值-30.40/0.00-33.28/0.00-15.25/0.00-3.74/0.00-34.92/0.00-28.35/0.00-21.14/0.09-5.45/0.00

3 討 論

西紅花作為傳統(tǒng)中藏藥材，其活性成分西紅花苷具有抗氧化、增強神經(jīng)元活性等作用，具有治療神經(jīng)變性損壞、抑制神經(jīng)元凋亡〔6，7〕等諸多療效。神經(jīng)系統(tǒng)在高海拔低氧的特殊環(huán)境中形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能將會發(fā)生很大的變化，而海馬神經(jīng)細胞極易受到低氧環(huán)境的損傷。本實驗說明，在高海拔急性低氧環(huán)境中西紅花苷能明顯改善腦海馬神經(jīng)元凋亡，達到急性低氧條件下的神經(jīng)保護作用。

P53是最常見的促凋亡基因之一，P53及其相關(guān)基因在腦組織中的表達調(diào)控已成為缺血缺氧神經(jīng)元死亡機制中的一個關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。急性低氧腦病病因是大腦急性缺氧，海馬是缺氧性腦損傷中最敏感的腦區(qū)，海馬存在明顯的細胞凋亡，因此認為，檢測大鼠海馬組織中P53蛋白的表達情況可作為反映腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的間接指標。P53是神經(jīng)元損傷后主要的調(diào)節(jié)因子，P53可轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)和 Bcl-2家族相互作用，促進 Bax和抑制Bcl-2的表達，引起蛋白底物的降解導致細胞色素C 釋放，從而激活相關(guān)caspase引起凋亡〔8，9〕。西紅花苷提前用藥干預可抑制P53表達，顯著下調(diào)P53促凋亡基因，對高海拔低氧條件下腦海馬神經(jīng)元有保護作用，明顯抑制海馬神經(jīng)元腦神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生及抗低氧損傷和修復功能，說明西紅花苷通過下調(diào)P53對急性低氧條件下腦海馬神經(jīng)元有明顯的保護作用。下調(diào)P53促凋亡基因的可能機制與西紅花苷抑制神經(jīng)元細胞凋亡、對抗神經(jīng)細胞損傷、增強免疫等有關(guān) 。因而，P53在急性低氧誘導凋亡的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。所以，抑制低氧性腦損傷導致神經(jīng)元細胞的凋亡、增強海馬神經(jīng)元抗缺氧及抗自由基損傷的能力、改善腦缺氧狀態(tài)，可能是西紅花苷作用機制之一。

1 Petrova EB,Dimitrova MB,Ivanov IP,etal.Effect of acute hypoxic shock on the rat brain morphology and tripeptidyl peptidase I activity〔J〕.Acta Histochem,2016;118(5):496-504.

2 Asadi F,Jamshidi AH,Khodagholi F,etal.Reversal effects of crocin on amyloid β-induced memory deficit:modification of autophagy or apoptosis markers〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,2015;139(Pt A):47-58.

3 Rajaei Z,Hosseini M,Alaei H.Effects of crocin on brain oxidative damage and aversive memory in a 6-OHDA model of Parkinson′s disease〔J〕.Arq Neuropsiquiatr,2016;74(9):723-9.

4 Sarshoori JR,Asadi MH,Mohammadi MT.Neuroprotective effects of crocin on the histopathological alterations following brain ischemia-reperfusion injury in rat〔J〕.Iran J Basic Med Sci,2014;17(11):895-902.

5 張曉巖，喻 靜，張先鈞，等.西紅花苷-1 對急性低氧條件下大鼠學習記憶及海馬 SIRT1 表達的影響〔J〕.中草藥,2013;44(10):1314-7.

6 Ochiai T,Shimeno H,Mishima K,etal.Protective effects of carotenoids from saffron on neuronal injury in vitro and in vivo〔J〕.Biochim Biophys Acta,2007;1770(4):578-84.

7 Chen L,Qi Y,Yang X.Neuroprotective effects of crocin against oxidative stress induced by ischemia/reperfusion injury in rat retina〔J〕.Ophthalmic Res,2015;54(3):157-68.

8 Endo H,Kamada H,Nito C,etal.Mitochondrial translocation of p53 mediates release of cytochrome c and hippocampal CA1 neuronal death after transient global cerebral ischemia in rats〔J〕.J Neurosci,2006;26(30):7974-83.

9 Murase S,Poser SW,Joseph J,etal.p53 controls neuronal death in the CA3 region of the newborn mouse hippocampus〔J〕.Eur J Neurosci,2011;34(3):374-81.

〔2016-07-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effect of crocin on expression of P53 and apoptosis in hippocampus under hypoxia at high altitude in rats

ZHANG Xiao-Yan，ZANG Xian-Jun， JIA Wei，et al.

Qinghai University Medical College，Xining 810016，Qinghai，China

Objective To observe the effect of crocin in advance of the medication on the apoptosis and P53 expression in hippocampus under hypoxia at high altitude in rats.Methods SD rats were randomly divided into hypoxia control and hypoxia treatment groups． The SD rats in treatment group were injected Crocin once daily(50 mg·kg-1·d-1) and the model group were injected the same dose of 0.9% Nacl for 3 days，and then they were shifted to high altitude 4 200 m and then the samples were taken at 1 d，3 d，5 d，7 d. The apoptosis of nerve cells was determined by TUNEL. P53 protein was detected by Western blot and mRNA was detected by RT-PCR.Results Compared with the control group， treatment group showed significantly lower in the apoptosis rate at 1，3，5，7 d(P<0.05). The results of RT-PCR showed that P53 mRNA in hippocampus of rats was lower in treatment group than that of control group at 1, 3, 5,7 d (P<0.05). Western blot showed that P53 protein in hippocampus of rats was obviously lower in treatment group than that of control group at 1,3, 5, 7 d (P<0.05).Conclusions Crocin pretreatment could reduce the expression of P53 and the apoptosis in hippocampus at acute high altitude hypoxia conditions，and protect the nerve cells in hippocampus and ameliorate the nerve function by regulating the P53 signal.

Crocin; Hypoxia;P53;Apoptosis

國家自然科學基金項目(No.81260685)；青海省科技廳“基礎(chǔ)研究”項目(No.2016-ZJ-708)

張曉巖(1974-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事低氧環(huán)境腦神經(jīng)的保護研究。

R282.7

A

1005-9202(2017)01-0001-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.001