（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

大麻素受體1對坐骨神經結扎大鼠神經病理性疼痛的影響及機制

李曉倩，包娜仁，張再莉，馬虹

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

目的 觀察鞘內注射大麻素受體1（CB1）激動劑和拮抗劑對坐骨神經結扎大鼠行為學、痛閾以及脊髓組織中CB1表達的影響，探討CB1在神經病理性疼痛中的作用及機制。方法 SD大鼠隨機分為4組：假手術組（sham組）、坐骨神經結扎組（SNL組，鞘內注射30 μL DMSO）、CB1激動劑組［AM841組，坐骨神經結扎前3 d鞘內注射5 μg AM841（溶于30 μL DMSO）］、CB1拮抗劑組［AM281組，坐骨神經結扎前3 d鞘內注射5 μg AM281（溶于30 μL DMSO）］。Sham組僅暴露坐骨神經而不結扎。其余各組均行右側坐骨神經結扎術，術后1、3、5、7、10、14 d觀察大鼠行為學變化，測定各組大鼠的熱痛閾、機械性痛閾；Western blotting法檢測脊髓組織中CB1表達。結果 與sham組相比，SNL組術后各觀察點大鼠逐漸出現術側后肢足趾并攏、熱痛覺過敏和機械異常性疼痛等癥狀，同時脊髓組織中CB1表達降低（P＜0.05）；AM841組脊髓CB1表達增加，抑制坐骨神經結扎所引起的熱痛閾和機械性痛閾降低（P＜0.05）；AM281組脊髓CB1表達進一步降低、大鼠痛覺異常增大（P＜0.05）。結論 脊髓CB1參與神經病理性疼痛的調節(jié)，給予外源性大麻素CB1激動劑可以減輕坐骨神經結扎引起的神經病理性疼痛。

大麻素受體；神經病理性疼痛；脊髓；大鼠

神經病理性疼痛是由于腫瘤、感染、自身免疫 等因素導致神經系統(tǒng)損傷或功能紊亂引起的一種慢性疼痛，其疼痛程度重且多伴有自主神經功能紊亂，臨床治療效果欠佳［1?2］。目前神經病理性疼痛機制尚未明確，深入探討其機制對臨床中尋求有效的鎮(zhèn)痛方案至關重要。脊髓是聯(lián)系外周和高級神經中樞，是傷害性信息傳遞的中轉站。越來越多的研究［3?4］發(fā)現大麻素受體（cannabinoid receptors，CB）參與疼痛中樞敏化形成介導慢性疼痛調節(jié)。既往研究［5］發(fā)現大鼠經鞘內注射選擇性CB2激動劑WIN55、212?2可以通過抑制神經炎癥遞質釋放、對抗興奮性氨基酸毒性和調控鈉通道過度開放等多靶點緩解機械性痛覺過敏，而脊髓水平CB1是否參與神經病理性疼痛的調節(jié)鮮有報道。本研究觀察大鼠坐骨神經結扎后脊髓CB1表達以及鞘內注射CB1激動劑、拮抗劑對坐骨神經結扎（sciatic nerve li?gation，SNL）大鼠行為學和痛閾的影響，探討CB1在神經病理性痛中作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要儀器

雄性Sprague?Dawley大鼠160只，體質量240～260 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。AM841、AM281、Dimethyl sulfoxide（DMSO，美國Cayman Chemical公司）；兔抗大鼠CB1抗體（美國Sigma公司）；鼠爪機械痛閾測定儀（意大利UgoBasi?le公司）、大鼠爪熱痛閾測定（意大利UgoBasil公司）、圖像分析系統(tǒng)（武漢華海公司）、酶標儀（美國BIO?TEK公司）由中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備［6］：水合氯醛腹腔注射麻醉后，常規(guī)消毒，于大鼠右側大腿后中部切開縱向切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，于股骨后找到坐骨神經主干，用4?0絲線在坐骨神經的中段間隔2 mm結扎4條線，結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動為宜，僅留下縊痕而不阻斷神經血供，然后以生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合。假手術組大鼠僅暴露坐骨神經而不結扎。所有手術步驟都在無菌環(huán)境下操作。

1.2.2 鞘內注射［7］：麻醉下，用27號針頭注射器在脊髓T9～12節(jié)段緩慢穿刺脊髓，當針頭進入蛛網膜下腔時，動物可立即出現甩尾反應。然后緩慢注入藥物。鞘內用藥有CB1激動劑AM841、拮抗劑AM281（溶于30 μL DMSO）、等量DMSO，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.3 實驗分組：大鼠隨機分為4組，每組40只。假手術組（sham組），坐骨神經結扎前3 d鞘內注射DMSO 30 μL，開腹并暴露坐骨神經而不結扎；SNL組，坐骨神經結扎前3 d鞘內注射DMSO 30 μL，開腹暴露右側坐骨神經并結扎；CB1激動劑組（AM841組）：坐骨神經結扎前3d鞘內注射AM841（5μg/30μL）；CB1阻斷劑組（AM281組）：坐骨神經結扎前3 d鞘內注射AM281（5 μg/30 μL）。1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.4 疼痛一般行為學測定［8］：術后大鼠單籠飼養(yǎng)，觀察大鼠的精神狀態(tài)、進食和飲水、傷口愈合情況以及大鼠安靜時的姿勢運動能力。

1.2.5 機械性痛閾及熱痛閾測定［9］：分別于SNL前3 d及術后1、3、5、7、10、14 d，上午8時至10時，室溫保持在20～24℃，待大鼠安靜后，采用電子自動爪觸覺測試儀測定各組大鼠右足機械刺激縮爪閾值（paw withdrawal threshold，PWT），將刺激針對準右足底并逐漸增加刺激力量，大鼠感覺到痛覺后移開足部，設備記錄并顯示大鼠移開右足瞬間的最大值，即PWT。照射內側第1足趾的著力點，采用輻射熱測痛儀測定各組大鼠右足輻射熱刺激縮爪潛伏期（paw withdrawal latency，PWL），單次照射不超過20 s，以免損傷照射部位。測定值精確到0.1 s。測定3次，每次間隔5 min，取平均值。

1.2.6 Western blotting測定大鼠脊髓組織中CB1蛋白表達：大鼠完成痛閾測定后處死，取術側L4～6節(jié)段脊髓組織，提取總蛋白溶液，進行SDS?PAGE電泳將蛋白濕轉至PVDF膜上，5%牛奶封閉后加入抗CB1抗體，4℃過夜，洗膜后再用HRP標記的山羊抗兔IgG雜交，37℃2 h。最后加入ECL試劑反應1～2 min顯像，用掃描儀行蛋白條帶掃描并進行蛋白條帶半定量分析。以CB1和GAPDH的比值作為表達強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件，計數資料采用χ2檢驗；計量資料結果以x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）比較組間差異，使用post hoc進行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠疼痛一般行為學比較

4組大鼠術后體質量無明顯下降，進食和飲水無明顯改變。sham組大鼠術后行為學表現較術前無明顯改變，而SNL組大鼠術后隨時間進展逐漸出現術側后肢足趾并攏，足外翻以及反復舔舐術側后肢等癥狀；與SNL組比較，AM841組出現上述癥狀大鼠的數目明顯降低，舔舐術側后肢次數減少，而AM281組上述癥狀加重，甚至出現觸摸痛體征，舔舐次數明顯增多。見表1。

2.2 4組大鼠機械性痛閾的比較

各組大鼠術前基礎機械性PWT差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與sham組比較，從術后第1天開始SNL組大鼠術側右足PWT值逐漸降低，持續(xù)至手術后第14天，而在第5天和第7天達最低水平（P＜0.05）。與SNL組比較，AM841組術后各觀察點PWT值明顯升高（P＜0.05），而AM281組PWT值進一步降低（P＜0.05）。術后各時間點SNL組、AM841組和AM241組大鼠與sham組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

表1 各組大鼠坐骨神經結扎后各時間點行為學變化Tab.1 Behavior changes in rats of 4 groups at different time points after SNL

圖1 4組大鼠SNL后1、3、5、7、10、14 d右足機械刺激PWT比較Fig.1 Comparison of 4 groups of PWT in right paws at 1，3，5，7，10，14 d after SNL

2.3 各組大鼠熱痛閾比較

熱痛閾的變化與機械痛閾的變化趨勢大體一致。各組大鼠術前基礎熱痛閾（PWL）的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與sham組相比，術后各時間點SNL組大鼠術側右足出現PWL降低，術后第5和7天達最低水平（P＜0.05）。與SNL組相比，AM841組術后各觀察點PWL值明顯升高（P＜0.05）而AM281組PWL值進一步降低（P＜0.05）。術后各時間點SNL、AM841和AM241 3組大鼠與sham組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.4 各組大鼠脊髓組織中CB1蛋白表達比較

Western blotting結果顯示：與sham組比較，術后各觀察點（第5天和第7天差別最為明顯）SNL組大鼠脊髓組織中CB1蛋白明顯下降（P＜0.05），與SNL組比較，AM841組術后各觀察點大鼠脊髓組織中CB1蛋白表達明顯增加，而AM281組CB1蛋白表達進一步降低（均P＜0.05），見表2和圖3。

圖2 4組大鼠SNL后1、3、5、7、10、14 d右足熱刺激PWL比較Fig.2 Comparison of 4 groups of PWL in right paws at 1，3，5，7，10，14 d after SNL

圖3 SNL后5、7 d各組大鼠脊髓CB1蛋白表達Fig.3 Comparison of spinal CB1 protein levels at 5 and 7 days after SNL in four groups by Western blotting

3 討論

神經病理性疼痛具有癥狀多樣、發(fā)病機制復雜、無法在人體中模擬研究等特點，因此選擇合適的動物模型是深入研究其分子機制的必要手段。SNL是目前使用最廣泛的神經病理性疼痛模型之一，具有高度的重復性。本研究制作的SNL大鼠模型術后精神和飲食狀態(tài)正常，逐漸出現后肢足趾并攏，足外翻以及反復舔舐術側后肢等現象，且PWT和PWL隨時間下降明顯，表明模型建立成功。

表2 各組大鼠SNL后各時間點脊髓組織中CB1蛋白表達Tab.2 Spinal CB1 protein levels at different time points after SNL

坐骨神經損傷后可以引起局部組織的炎癥反應，引起5?HT緩激肽等內源性物質大量釋放，從而活化外周感受器，并將傷害性刺激傳入脊髓［10］。脊髓作為傷害性信息傳遞的中轉站，損傷后組織中免疫反應細胞通過改變表面受體迅速發(fā)生活化，同時釋放出大量炎癥介質、P物質等致痛因子，參與神經病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展［11?12］。越來越多的研究［3?4］發(fā)現CB在應激、疼痛等病理情況下也迅速發(fā)生變化。人體內主要存在2種CB，CB1和CB2，均為G蛋白耦聯(lián)受體，生理狀態(tài)下可調節(jié)某些神經遞質（谷氨酸、γ?氨基丁酸等）的釋放，被單?；视王ッ秆杆俳到猓?0］。大麻素對神經系統(tǒng)的影響最初是在1996年被發(fā)現，SHEN等［13］指出大麻素可減少海馬組織切片的谷氨酸釋放從而對抗興奮性氨基酸對神經元的毒性作用。近年來，隨著研究深入發(fā)展，CB激活后還參與疼痛中樞敏化形成介導慢性疼痛調節(jié)。YAO等［5］對L5脊神經結扎大鼠鞘內注射選擇性CB2激動劑WIN55、212?2能夠明顯減輕大鼠的機械痛敏，而給予CB1受體拮抗劑利莫那班可逆轉WIN55、212?2的保護作用［14］。不僅如此，敲除CB1基因的小鼠神經敏感性增加，神經功能學評分較野生型相比明顯異常，且恢復速度緩慢［15］，基因克隆進一步發(fā)現CB1和CB2總氨基酸序列44%同源，跨膜區(qū)氨基酸序列68%同源，可能在神經病理性疼痛中存在共同的作用靶點［16］。本研究中對SNL模型大鼠鞘內注射A841激動劑，術后各觀察點右足PWL值和PWT值均明顯升高，獲得良好的鎮(zhèn)痛效果，而給予CB1拮抗劑后逆轉了上述的鎮(zhèn)痛作用。本研究中PWT值和PWL值在術后5 d和7 d變化最明顯（降低2倍以上）。同樣Western blotting檢測鞘內注射AM841能明顯增加脊髓中CB1的表達，而注射CM281則進一步抑制CB1的表達，與PWT值和PWL值的變化趨勢相符，表明通過注射外源性CB1可以有效上調脊髓組織中的CB1表達，從而緩解疼痛，與既往研究［3，17］結果一致。

綜上所述，本研究觀察鞘內注射CB1激動和拮抗劑對SNL大鼠行為學、痛閾以及脊髓組織中CB1表達的影響，證實CB1參與神經病理性痛中的發(fā)生和發(fā)展，給予外源性CB1可以有效緩解疼痛，為臨床治療提供了新的治療靶點。

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（編輯 武玉欣）

Mechanism and Effects of Cannabinoid Receptor 1 on Sciatic Nerve Ligation?induced Neuropathic Pain in Rat Model

LI Xiaoqian，BAO Naren，ZHANG Zaili，MA Hong
（Department of Anesthesiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To observe the effects of intrathecal injection（IT）of agonist and antagonist of cannabinoid receptor 1 on pain threshold in rat model of sciatic nerve ligation（SNL）induced neuropathic pain，and investigate the role and mechanism of CB1 in neuropathic pain.Methods Male Sprague?Dawley rats were randomly divided into 4 groups：sham group（intrathecal normal saline，IT DMSO），SNL group（SNL+IT 30 μL DMSO），AM841 group（SNL+IT 5 μg AM841，dissolved in 30 μL of DMSO）and AM281 group（SNL+IT 5 μg AM281，dissolved in 30 μL of DMSO）.IT was given 3 days before surgery.Sham group only had sciatic nerve exposure but without ligation.SNL model in the other three groups were established by right sciatic nerve ligation.The thermal and mechanical thresholds were assessed by paw withdrawal latency（PWL）to radiant heat and von Frey filaments at 1，3，5，7，10 and 14 days as well as behavior after SNL.Spinal expressions of CB1 were assessed by West?ern blotting.Results Compared with the sham group，symptoms of rats in SNL group，such as heat hyperalgesia，mechanical allodynia and poste?rior paws prone to close together，were gradually appeared in the observation time points，with lower spinal proteins expression of CB1（P＜0.05）. AM841 group exhibited increased proteins expression of CB1 and inhibited SNL?induced heat hyperalgesia and mechanical allodynia（P＜0.05）. AM281 group further decreased expression of CB1 and amplified the pain abnormality（P＜0.05）.Conclusion Spinal CB1 participates in the regulation of neuropathic pain，and exogenous cannabinoid CB1 agonists can alleviate the SNL?induced neuropathic pain.

cannabinoid receptor；neuropathic pain；spinal cord；rat

R741.02

A

0258-4646（2017）03-0205-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.004

國家自然科學基金（81601053）；遼寧省教育廳科學研究項目（LK201636）

李曉倩（1984-），女，主治醫(yī)師，博士.

馬虹，E-mail：mahong5466@yahoo.com

2016-08-20

網絡出版時間：