康可歆，李昱驥

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.老年病科；2.胃腸外科，沈陽 110001）

載藥膠束改善吉西他濱對(duì)胰腺癌的治療效果

Drug?loaded Micelles Improve the Effect of Gemcitabine in Pancreatic Cancer Treatment

康可歆1，李昱驥2

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.老年病科；2.胃腸外科，沈陽 110001）

通過合成載吉西他濱普朗尼克?α?生育酚琥珀酸酯聚合物膠束，證明其可改善吉西他濱對(duì)胰腺癌的治療效果。

載吉西他濱膠束；胰腺癌；治療效果

胰腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)有逐漸增高的趨勢(shì)［1］，能早期診斷并接受手術(shù)的患者不足20%，故藥物治療的作用越來越被臨床醫(yī)生重視。目前胰腺癌的一線化療方案是以吉西他濱（gemcitabine，GEM）為主體的多藥聯(lián)合治療，但總體生存期（over rall survival，OS）僅為6.8個(gè)月［2］。為了提高藥物的治療作用，改善患者的生存時(shí)間，尋找新的治療方法迫在眉睫。有研究［3］表明，載藥膠束可以增加藥物在腫瘤細(xì)胞中的濃度和存留時(shí)間，更好的發(fā)揮其細(xì)胞毒作用。本研究設(shè)計(jì)了新的載GEM膠束，探討其對(duì)胰腺癌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

普朗尼克P123，生育酚琥珀酸酯（tocopherol succinate，TOS）和1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺［1?（3?Dimethylaminopropyl）?3?ethylcarbodi?imide hydrochloride，EDC］購自西格瑪公司（中國(guó)）。GEM購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC?1購自中國(guó)科學(xué)院培養(yǎng)收集細(xì)胞庫（上海，中國(guó)）。PANC?1細(xì)胞用10%胎牛血清1640培養(yǎng)液培養(yǎng)（HyClone公司，美國(guó)），細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2/95%空氣。實(shí)驗(yàn)小鼠購自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.2 方法

1.2.1 載GEM膠束的制備：將500 mg P123、76 mg TOS、和108 mg EDC溶解在5 mL的DMSO中。將混合物在氮?dú)猸h(huán)境中連續(xù)攪拌40 h。產(chǎn)生的化學(xué)聚合物用截留分子量3 000的透析袋透析1周，中途頻繁更換蒸餾水，產(chǎn)品進(jìn)行冷凍干燥。將5 mg堿化的GEM和50 mg P123?TOS交聯(lián)物（P/TOS）溶解于乙腈中且攪拌1 h。然后將以上有機(jī)混合物裝于透析袋中，用蒸餾水透析12～24 h。將最終收集到的載?GEM P/TOS（P/TOS?GEM）冷凍干燥。

1.2.2 P/TOS?GEM膠束的檢測(cè)：P/TOS?GEM的大小和電荷用馬爾文分析儀（英國(guó)）用來測(cè)量。載藥能力（drug loading capacity，DLC）通過光譜學(xué)進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)單來說，先將P/TOS?GEM（凍干后）溶于蒸餾水中，添加1∶50的甲醇。然后離心、留上清，在紫外可見光譜268 nm波長(zhǎng)下測(cè)量GEM的數(shù)量。DLC使用以下公式進(jìn)行計(jì)算：DLC（%）=（截留的GEM量/納米顆?？偭浚?00。

1.2.3 膠束體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)：透析法研究藥物釋放。首先將冷凍干燥的P/TOS?GEM溶解于蒸餾水，濃度為1 mg/mL。取1 mL的膠束分散物加到透析膜（分子量3 500）上，透析膜兩端是密封的。將裝有分散物的透析膜浸入到裝有25 mL釋放液的離心管中。磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4）和醋酸鹽緩沖溶液（ABS，pH5.0）分別作為釋放液。在特殊的時(shí)間點(diǎn)，需要對(duì)釋放液進(jìn)行等體積的更換。釋放到釋放液中的藥物量使用紫外可見光譜儀在268 nm進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 細(xì)胞毒性分析：對(duì)游離GEM和P/TOS?GEM在HepG2癌細(xì)胞中的抗癌效力通過MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞培養(yǎng)后接種到96孔板上，接種密度為1× 104/孔。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)20 h后使用不同濃度的藥物處理24 h。然后將培養(yǎng)基去除，將細(xì)胞用PBS洗滌2次。隨后加入溶解于PBS的MTT溶液（20 μL，50 mg/mL），并孵育4 h。去除上清液，使用DMSO（100 μL）提取甲瓚。使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。細(xì)胞存活率與未經(jīng)過處理的對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.2.5 載瘤小鼠模型的建立：取5周齡小鼠，行右側(cè)齒狀面注射PANC?1細(xì)胞懸液（1×106），當(dāng)腫瘤體積增大到100 mm3時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。腫瘤體積使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，腫瘤大小用公式V=a×b2/2計(jì)算（a和b分別代表腫瘤的最大和最小直徑）。

1.2.6 體內(nèi)抗腫瘤研究：將小鼠腫瘤模型分成3組，每組8只。其中2組每隔3 d經(jīng)尾靜脈分別注射同等劑量（150 mg/kg）的GEM和P/TOS?GEM，共注射3次。第3組為對(duì)照組。按時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的腫瘤體積和體質(zhì)量變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，2組數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠束的大小及載藥能力

制備P/TOS?GEM膠束的臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）為27 μg/mL，膠束的平均直徑約100 nm。DLC為27.43%±3.22%。

2.2 膠束在酸性的環(huán)境下更易釋放藥物

3組實(shí)驗(yàn)分別在不同的pH環(huán)境中進(jìn)行。結(jié)果顯示，在不同的環(huán)境中，GEM的釋放速度有著顯著區(qū)別。見圖1。24 h后在pH7.4，pH6.5，pH5.0的環(huán)境中，膠束的藥物釋放率分別為33.7%，48.6%和69.4%。在48 h后，pH7.4的環(huán)境下，藥物釋放率接近不足40%，而在pH5.0的環(huán)境下，藥物釋放率幾乎達(dá)到100%。結(jié)果提示膠束的藥物釋放率受pH環(huán)境的影響比較大，在pH5.0的環(huán)境下，膠束有較高的藥物釋放率。

圖1 P/TOS?GEM體外釋放實(shí)驗(yàn)

2.3 P/TOS?GEM的細(xì)胞毒性較游離GEM更強(qiáng)

采用MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)游離GEM和P/TOS?GEM對(duì)PANC?1細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，無論是游離的GEM還是P/TOS?GEM對(duì)PANC?1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用都呈現(xiàn)出濃度依賴性，見圖2。游離GEM的IC50為2.12 μg/mL，而P/TOS?GEM的IC50為0.5 μg/mL，提示P/TOS?GEM對(duì)PANC?1細(xì)胞有著更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。

圖2 游離GEM和P/TOS?GEM對(duì)PANC?1細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)

2.4 P/TOS?GEM對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)于游離GEM

對(duì)照組腫瘤體積逐漸上升，18 d時(shí)達(dá)到1 600 mm3，游離GEM和P/TOS?GEM均可抑制腫瘤體積增長(zhǎng)，其中P/TOS?GEM的抑制作用更加明顯，18 d時(shí)體積僅為700 mm3左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 游離GEM和P/TOS?GEM的體內(nèi)抗腫瘤作用

3 討論

胰腺癌嚴(yán)重威脅人類健康。因多數(shù)患者起病隱匿，診斷時(shí)多為中晚期，難以接受根治性手術(shù)［4?5］，目前5年生存率不足5%［6］。為了改善這一現(xiàn)狀，更多科研者的目光逐漸投向藥物治療。目前，治療胰腺癌的臨床一線用藥是以GEM為主體構(gòu)建的，但治療效果不盡理想。隨著納米技術(shù)的進(jìn)展，有學(xué)者［7］主張開發(fā)新的納米系統(tǒng)以提高藥物的治療效果。

本研究采用普郎尼克嵌段共聚物作為GEM的載體。共聚物由作為親水段的普郎尼克和疏水段的TOS構(gòu)成，合成的膠束直徑在100 nm左右，呈近球形結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道，只有直徑在200 nm以內(nèi)的膠束才能憑借其高穿透性和滯留效應(yīng)到達(dá)靶細(xì)胞。通過多次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有將普郎尼克和TOS聚合后構(gòu)成的膠束才有較高的藥物攜帶能力，達(dá)到了27.43%。而單純用普郎尼克生成的膠束，其攜藥能力不足10%，分析原因，可能與交聯(lián)后TOS作為疏水段，可以增加膠束的穩(wěn)定性，獲得更高的藥物攜帶能力有關(guān)［9］。

本研究探討了P/TOS?GEM在不同的pH環(huán)境下的藥物釋放情況，發(fā)現(xiàn)其具有pH依賴性藥物釋放的特點(diǎn)。在模擬血液的環(huán)境下（pH7.4），藥物的釋放速度減緩，提示其可以延長(zhǎng)藥物在血液系統(tǒng)內(nèi)存留的時(shí)間，這一特點(diǎn)可能與普郎尼克的親水段具有防污特性有關(guān)。而在腫瘤內(nèi)環(huán)境（pH5.0）下，藥物會(huì)得到充分的釋放，可以更充分地發(fā)揮作用。尤其是在實(shí)驗(yàn)的開始階段，在任何條件下，藥物的釋放率都很低，說明膠束系統(tǒng)具有很好的穩(wěn)定性，藥物被安全的包埋在膠束中。

就GEM而言，因?yàn)榫哂械头肿恿亢透咄ㄍ感缘奶攸c(diǎn)，可以更容易地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。但是，隨著周圍環(huán)境中藥物濃度的下降，GEM也很容易被泵出腫瘤細(xì)胞外，難以持久地發(fā)揮作用。而采用膠束作為藥物載體之后，膠束在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境下可以逐漸釋放GEM，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)藥物的濃度維持在一定的水平，減少藥物的流失，更能充分發(fā)揮藥物的抗腫瘤作用。

總之，本研究中合成的載GEM膠束可以增強(qiáng)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用，顯著抑制胰腺癌的增長(zhǎng)，具有實(shí)際的臨床意義，為胰腺癌的治療提供了新的思路。

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（編輯 于 溪）

R453.9

B

0258-4646（2017）03-0281-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.023

康可歆（1978-），女，講師，本科.

李昱驥，E-mail：liyuji74@163.com

2016-07-11

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