奚卓，薛一雪，馬珺，劉云會

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學教研室，沈陽 110122）

miR?29s家族對人腦膠質(zhì)瘤干細胞生物學行為的影響

奚卓1，薛一雪2，馬珺2，劉云會1

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004；2.基礎醫(yī)學院神經(jīng)生物學教研室，沈陽 110122）

目的 研究miR?29s家族在膠質(zhì)瘤干細胞（GSCs）中的表達水平，以及對GSCs生物學行為的影響是否存在差異。方法8例膠質(zhì)瘤患者術中取腫瘤標本，制備成GSCs。應用實時PCR方法檢測miR?29a、miR?29b和miR?29c的內(nèi)源性表達。CCK?8方法檢測GSCs增殖，Transwell小室方法檢測GSCs的遷移侵襲，流式細胞儀檢測GSCs的凋亡。結果 miR?29a、miR?29b和miR?29c在GSCs中低表達，外源性提高表達量后，可以抑制GSCs的增殖、遷移和侵襲能力，促進GSCs的凋亡。結論 miR?29s家族在GSCs中起抑癌基因的作用，家族成員中以miR?29a的抑癌能力最強且起到主導作用。

膠質(zhì)瘤干細胞；miR?29a；miR?29b；miR?29c；生物學行為

多形性膠質(zhì)母細胞瘤是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高、侵襲性最強、最易復發(fā)的一種［1］，目前標準的治療方法是手術切除聯(lián)合放、化療，但患者的5年生存率仍不足5%［2］。膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）是膠質(zhì)瘤細胞中的少數(shù)亞群細胞，具有自我更新、多向分化及無限增殖的能力。

miR?29s家族有miR?29a、miR?29b和miR?29c，在不同腫瘤組織中作用不同［3?4］。在人腦膠質(zhì)瘤組織中，miR?29s為抑癌基因，miR?29a和miR?29c可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力［5］。因為GSCs與膠質(zhì)瘤的復發(fā)及侵襲性生長存在密切關系，所以本研究希望通過檢測miR?29s在GSCs中的表達以及其家族成員對GSCs生物學行為的影響，為研究GSCs的靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源

8例膠質(zhì)瘤組織均取自2015年中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第一神經(jīng)外科手術患者，其中男5例，女3例，年齡26～67歲，4例位于頂葉，2例位于額葉，2例位于顳葉。術后病理：5例為多形性膠質(zhì)母細胞瘤，3例為間變性星形細胞瘤。所有患者均為首次發(fā)病，術前未接受放、化療，手術均為開顱切除，術中選擇未壞死、未囊變的腫瘤組織。術后病理均由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病理科診斷。8例患者針對手術及研究均簽署知情同意書，研究方案由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 GSCs的分離和培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤組織術中取出后，放入PBS緩沖液，于冰盒中轉(zhuǎn)運至實驗室。無菌條件下取腫瘤組織（約1 cm3），反復PBS沖洗，剪切成碎塊至乳糜狀，胰酶消化、過濾，后予以1 000g5 min離心，棄上清。組織團塊應用GSCs培養(yǎng)液重懸，并放入懸浮培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。GSCs培養(yǎng)液包括：無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，其中添加20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），20 ng/mL表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和2%B27。細胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過近2周的培養(yǎng)，細胞球形成，而殘留在瓶中的未形成細胞球的細胞為非膠質(zhì)瘤干細胞（non?glioma stem cells，non?GSCs）。目前研究［6］已經(jīng)針對干細胞的分化和增殖能力進行鑒定，因為實驗方法相同，本研究未再進行鑒定。

1.3 RNA的提取和實時熒光定量PCR

總RNA應用Trizol reagent從GSCs及non?GSCs中提取，RNA樣品稀釋后測定RNA濃度。然后應用Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄，應用TaqMan Universal Master MixⅡ和Taq?Man MicroRNA Assay（miR?29a、miR?29b、miR?29c和U6）進行實時熒光定量PCR。應用7500 Fast Real?Time PCR System測定CT值，以U6為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達量。

1.4 miR?29s的瞬時轉(zhuǎn)染

miR?29a、miR?29b和miR?29c對應的miRNA激動劑和其陰性對照（nonsense scrambled sequence，Scr）均由上海吉瑪公司合成。應用Lipofectamine 3000 reagent（Life Technologies Corporation，Carls?bad，CA，USA）將miR?29s miRNA激動劑和其陰性對照轉(zhuǎn)染至GSCs中，得到過表達miR?29s的GSCs，然后應用qRT?PCR檢測miR?29a、miR?29b和miR?29c的轉(zhuǎn)染效率，實驗分為：未轉(zhuǎn)染的GSCs組（Control組），轉(zhuǎn)染陰性對照的GSCs組（Scr組），轉(zhuǎn)染miR?29a miRNA激動劑組（pre?miR?29a組），轉(zhuǎn)染miR?29b miRNA激動劑組（pre?miR?29b組），轉(zhuǎn)染miR?29c miRNA激動劑組（pre?miR?29c組）。

1.5 GSCs增殖能力檢測

應用CCK?8方法（Cell Counting Kit?8，中國南通碧云天公司），檢測過表達miR?29a、miR?29b和miR?29c后，GSCs增殖能力的變化。將成球的GSCs應用胰酶消化成單細胞懸液，以100 μL、3 000/孔接種于96孔懸浮細胞培養(yǎng)板中，每組設5個副孔，轉(zhuǎn)染48 h后每孔加入10 μL的CCK?8溶液，避光孵育3 h，在450 nm波長處檢測光密度值。

1.6 GSCs遷移侵襲能力的檢測

GSCs的遷移和侵襲能力實驗應用Transwell小室（8 μm孔徑）進行檢測。瞬轉(zhuǎn)48 h的GSCs，應用胰酶消化成單球，1 000g5 min離心，棄上清，用100 μL GSCs培養(yǎng)液重懸，細胞計數(shù)20 000/mL，并加入小室的上室，下室則加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。后將小室取出，PBS中輕輕涮洗小室，小室內(nèi)面用棉簽輕輕擦拭。配置固定液：甲醇∶冰乙酸= 3∶1。將小室于固定液中固定30 min，再次應用PBS涮洗，吉姆薩染色30 min。然后將小室洗凈，置于倒置顯微鏡下觀察，并計數(shù)5個隨機視野的細胞數(shù)做均值計數(shù)。GSCs侵襲實驗中，步驟與遷移實驗步驟相似，但小室上室鋪細胞之前需要涂蓋500 ng/μL的Matrigel膠，37℃放置4 h。

1.7 GSCs凋亡能力的檢測

應用流式細胞儀檢測miR?29s過表達后對GSCs凋亡能力的影響。瞬轉(zhuǎn)48 h后的GSCs以1 000g5 min離心，然后用PBS洗滌2次，相同轉(zhuǎn)數(shù)離心，棄上清。然后用Annexin V?FITC/PI kit凋亡檢測試劑盒進行檢測，首先加入500 μL工作液重懸細胞，然后加入5 μL FITC及PI，室溫，避光反應15 min。最后使用流式細胞儀分析樣品，使用CELLQuest 3.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。統(tǒng)計分析時采用右側(cè)上、下象限百分數(shù)的和代表總的凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以x±s表示。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。2組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR?29s在正常膠質(zhì)細胞中的表達

在正常膠質(zhì)細胞中，相對于miR?29a，miR?29b和miR?29c的表達量顯著減少（P均＜0.01），見圖1A。

2.2 miR?29s在GSCs中低表達

與non?GSCs比較，miR?29a、miR?29b和miR?29c在GSCs中均呈低表達（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），且將non?GSCs的表達統(tǒng)一后，miR?29a在GSCs中的表達相對于其他2個家族成員，表達量更低。但與正常膠質(zhì)細胞比較，miR?29a、miR?29b和miR?29c在non?GSCs中的表達無統(tǒng)計學差異，見圖1B。

2.3 過表達miR?29s后轉(zhuǎn)染效率的驗證

圖1 miR?29a，miR?29b和miR?29c在正常膠質(zhì)細胞和GSCs中的內(nèi)源性表達（n=5）Fig.1 The expression of miR?29a，miR?29b and miR?29c in the human normal astrocytes and glioma stem cell（n=5）

瞬時轉(zhuǎn)染miR?29a、miR?29b和miR?29c各自對應的miRNA激動劑以及共同的陰性對照Scr后，應用實時PCR進行轉(zhuǎn)染效率的驗證，結果顯示轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染效率最高，見圖2A。

2.4 過表達miR?29s后抑制GSCs的增殖

相對于Scr組，過表達miR?29a、miR?29b和miR?29c后均可抑制GSCs的增殖能力（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），且以miR?29a抑制的最明顯，而Con?trol組與Scr組之間無統(tǒng)計學差異。見圖2B。

2.5 過表達miR?29s后抑制GSCs的遷移侵襲

當GSCs中miR?29a、miR?29b和miR?29c外源性表達升高后，GSCs的遷移（P均＜0.01）和侵襲（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）能力均受到抑制，且家族成員中仍以miR?29a的抑制效果最明顯，miR?29c的抑制能力最差。見圖2C。

2.6 過表達miR?29s后促進GSCs的凋亡

將miR?29a、miR?29b和miR?29c各自的miRNA激動劑轉(zhuǎn)染至GSCs中，使細胞中miR?29a、miR?29b和miR?29c的表達量升高后，會明顯促進GSCs的凋亡（P均＜0.01），且以miR?29a促進的最明顯（36%），相對于Scr組（11.8%），提高了（24.2%）。見圖2D。

3 討論

很多研究者認為，miRNAs在GSCs中的異常表達以及它們對GSCs生物學行為的影響可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關，例如miR?101、miR?152、miR?330和miR?145等［7?10］。在不同腫瘤組織中，miR?29s家族功能不同，甚至在同一疾病中的功能也不相同［11?12］。在人腦膠質(zhì)瘤中，miR?29s家族為低表達，且均起抑癌基因的作用，但miR?29s家族在GSCs中的表達以及家族成員之間對GSCs生物學行為的影響尚不明確。本研究結果發(fā)現(xiàn)相對于non?GSCs，miR?29s家族各個成員在GSCs中也為低表達，且以miR?29a表達下降最為明顯，此結果與miR?29s家族在膠質(zhì)瘤細胞系中的表達一致。外源性增強miR?29a、miR?29b和miR?29c的表達后，GSCs的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，而GSCs凋亡受到促進，結果說明miR?29s家族在GSCs中確實起到抑癌基因的作用。

本研究結果顯示，相對于miR?29b和miR?29c，外源性提高miR?29a的表達后，可以更明顯的抑制GSCs的增殖、遷移侵襲，促進細胞凋亡。說明miR?29a在GSCs中的抑癌作用更顯著。為了解釋這個現(xiàn)象，在人正常膠質(zhì)細胞中檢測了miR?29a、miR?29b和miR?29c的內(nèi)源性表達，結果顯示miR?29a的表達明顯高于miR?29b和miR?29c。與本研究結果相同，miR?29a被證實在正常乳腺細胞中主要表達，且功能上在miR?29s家族中也起主導作用［13］。所以，在GSCs中，miR?29a在miR?29s家族的抑癌作用中起主導作用。在miR?29s家族影響膠質(zhì)瘤細胞生物學行為機制研究方面，目前針對miR?29a、miR?29b和miR?29c的研究很多，如miR?29a和miR?29c可以通過影響CDC42的表達來抑制細胞的增殖、遷移、侵襲［14?15］，但在GSCs中的機制研究暫時沒有。

圖2 miR?29a、miR?29b和miR?29c轉(zhuǎn)染效率的驗證及過表達miR?29a、miR?29b和miR?29c后對GSCs生物學行為的影響（n=5）Fig.2 The transfection efficiency of miR?29a，miR?29b，miR?29c and over?expression of miR?29a，miR?29b and miR?29c influence the bi?ological behaviors of GSCs（n=5）

綜上所述，miR?29s家族在GSCs中低表達，且發(fā)揮抑癌基因的作用，家族成員中以miR?29a的抑癌能力最強且發(fā)揮主導作用。但miR?29s家族影響GSCs生物學行為的機制，還需在后續(xù)的實驗中進行研究。希望目前的研究可以為進一步研究miR?29s家族在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用提供參考，并為研究GSCs的功能提供理論支持。

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（編輯 于 溪）

Effects of miR?29s Family on the Biological Behaviors of Glioma Stem Cells

XI Zhuo1，XUE Yixue2，MA Jun2，LIU Yunhui1
（1.Department of Neurosurgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Neurobiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To investigate the expression of miR?29s in the glioma stem cells，and explore how the members of miR?29s affect the bio?logical behaviors of glioma stem cells.Methods Eight patient specimens were used to culture glioma stem cells.Real?time PCR was adopted to test the expression of miR?29s.CCK?8 analysis was performed to test the proliferation，Transwell was used to test cell migration and invasion，and flow?cytometry analysis was carried out to test apoptosis.Results miR?29a，miR?29b and miR?29c were decreased in glioma stem cells.Over?ex?pression of miR?29s could inhibit the proliferation，cell migration and invasion，but promote apoptosis of glioma stem cells.Conclusion miR?29s acts as a cancer suppressor gene in the glioma stem cells，and miR?29a plays the dominant functional role in the family.

glioma stem cells；miR?29a；miR?29b；miR?29c；biological behaviors

R739.41

A

0258-4646（2017）03-0201-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.003

國家自然科學基金（81672511，81573010）；遼寧省科學技術計劃（2015225007）；中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院自由研究者計劃（201304）

奚卓（1984-），男，主治醫(yī)師，博士.

劉云會，E-mail：liuyh_cmuns@163.com

2016-09-26

網(wǎng)絡出版時間：