趙晴，婁巖，孫燦，孔娟

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，沈陽(yáng) 110004；2.公共基礎(chǔ)學(xué)院計(jì)算機(jī)教研室，沈陽(yáng) 110122）

膽維丁乳對(duì)酵母多糖致多器官功能衰竭小鼠肝臟的作用

趙晴1，婁巖2，孫燦1，孔娟1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，沈陽(yáng) 110004；2.公共基礎(chǔ)學(xué)院計(jì)算機(jī)教研室，沈陽(yáng) 110122）

目的 研究膽維丁乳對(duì)酵母多糖致多器官功能衰竭小鼠肝臟損傷的作用。方法 C57 BL/6源性野生小鼠36只，隨機(jī)分為陰性對(duì)照（CON）組、膽維丁乳（CCE）組、酵母多糖（Z）組、CCE+Z組，每組各9只。CON組及Z組純水喂養(yǎng)，CCE組及CCE+Z組應(yīng)用膽維丁乳（20 μL溶于200 mL純水）避光喂養(yǎng)。14 d后Z組及CCE+Z組酵母多糖（500 mg/kg）腹腔注射。18 h后處死各組小鼠，留肝臟標(biāo)本行病理組織學(xué)檢查；檢測(cè)各組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量；應(yīng)用Western blotting、實(shí)時(shí)PCR方法測(cè)定各組小鼠肝臟組織白細(xì)胞介素6（IL?6）、白細(xì)胞介素18（IL?18）表達(dá)。結(jié)果 病理組織學(xué)顯示，CCE+Z組組織損傷較Z組輕，較對(duì)照組重。與CON組比較，血清ALT水平Z組、CCE+Z組升高；而CCE組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。IL?6、IL?18蛋白與mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與CON組及CCE+Z組比較Z組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 膽維丁乳對(duì)酵母多糖致肝臟損傷能夠起到一定的保護(hù)作用。

膽維丁乳；酵母多糖；細(xì)胞因子；肝臟損傷

維生素D是脂溶性維生素中的一種，是人體內(nèi)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究［1］認(rèn)為維生素D可作為一種激素參與并且調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生理功能。維生素D首先在肝臟25?羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為25?（OH）2D3，再經(jīng)腎臟的線粒體細(xì)胞色素P450氧化酶催化轉(zhuǎn)化為1，25?（OH）2D3。1，25?（OH）2D3才是有生物活性的，其發(fā)揮生物效應(yīng)需要依賴細(xì)胞內(nèi)特有的維生素D受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄才可實(shí)現(xiàn)［2］。維生素D受體存在廣泛，它與活化的1，25（OH）2D3結(jié)合后調(diào)節(jié)下游信號(hào)系統(tǒng)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)維生素D在免疫系統(tǒng)的許多通路中亦發(fā)揮有益的作用。1，25?（OH）2D3發(fā)揮作用是通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞來(lái)完成，可以幫助啟動(dòng)免疫反應(yīng)［3］。相關(guān)研究［4］也已證實(shí)，維生素D缺乏與修復(fù)免疫反應(yīng)有關(guān)，能降低白細(xì)胞的趨化作用，從而增加感染機(jī)會(huì)。膽維丁乳（每支含維生素D330萬(wàn)國(guó)際單位）是維生素D3與膽固醇的等克分子混合物，其作用與維生素D3相同。作為活性維生素D的前體，具有促進(jìn)鈣、磷吸收利用和骨正常鈣化的作用，目前廣泛應(yīng)用于臨床嬰幼兒維生素D缺乏性佝僂病的治療。酵母多糖誘導(dǎo)大鼠多器官衰竭模型近年研究中使用比較廣泛，腹腔注射酵母多糖混懸液后，可引起補(bǔ)體系統(tǒng)的活性成分、白三烯、前列腺素、溶酶體酶類、活性氧代謝產(chǎn)物等炎癥介質(zhì)廣泛釋放［5］。由于過(guò)度激活補(bǔ)體系統(tǒng)，從而引起全身性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟、腎臟、肺臟等多器官衰竭。

很多臨床研究［6?8］表明，維生素D與肝臟疾?。ㄗ陨砻庖咝愿渭膊?、非酒精性脂肪性肝疾病、肝炎等）密切相關(guān)。本研究在酵母多糖小鼠造模過(guò)程中預(yù)防性應(yīng)用膽維丁乳，探討膽維丁乳在肝臟損傷時(shí)的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究維生素D及其信號(hào)系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C57 BL/6源性野生小鼠36只，2月齡，體質(zhì)量25～30 g，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動(dòng)物飼料。隨機(jī)分為對(duì)照（CON）組、膽維丁乳（CCE）組、酵母多糖（Z）組、膽維丁乳+酵母多糖（CCE+Z）組，每組各9只。

1.2 動(dòng)物模型建立及標(biāo)本采集

CON組及Z組純水喂養(yǎng)，CCE組及CCE+Z組應(yīng)用膽維丁乳（20 μL溶于200 mL純水）避光喂養(yǎng)。4組小鼠飼養(yǎng)2周后，將酵母多糖（0.1 g）與0.9%氯化鈉溶液（2 mL）配制成混懸液，根據(jù)JANSEN等［9］方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，Z組及CCE+Z組無(wú)菌腹腔注射酵母多糖混懸液（500 mg/kg），CON組及CCE組無(wú)菌腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。腹腔注射18 h后，脫頸處死小鼠，經(jīng)右心室取血，離心后取上清，-20℃冷凍備用。提取肝臟組織，應(yīng)用OCT復(fù)合物包埋，-80℃冰箱冷凍至冰凍切片。蘇木精伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)變化。

1.3 血清ALT測(cè)定

經(jīng)右心室取血，離心后取上清，檢測(cè)血清ALT含量，采用Sigma公司試劑盒，貨號(hào)Catalog Number MAK055，依照說(shuō)明操作。

1.4 Western blotting檢測(cè)白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL?6）及白細(xì)胞介素18（interleukin 18，IL?18）蛋白表達(dá)

將小鼠肝臟組織清洗、稱重，按照1 mL組織蛋白裂解液（美國(guó)Boston Bioproduct公司）∶300 g組織的比例加入組織蛋白裂解液，用小剪刀剪碎，冰上勻漿3次，95℃加熱10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液移至新管，分裝-20℃凍存；測(cè)定蛋白濃度（美國(guó)BioRad公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒）；配置10%分離膠，1 h后配置濃縮膠；依照測(cè)定蛋白濃度計(jì)算上樣體積，上樣量為80 μg；室溫90 V恒壓電泳約2 h，4℃冰盒中60 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h；封閉液封閉1 h；4℃孵育一抗過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次5 min；室溫孵育二抗1 h；滴加ECL發(fā)光液發(fā)光。IL?6及IL?18為兔多克隆抗體，內(nèi)參β?actin為鼠多克隆抗體，均由美國(guó)Santa Cruz公司提供。

1.5 實(shí)時(shí)PCR測(cè)定小鼠肝臟中細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)

將小鼠肝臟組織提出后，按照試劑說(shuō)明書用TRizol法提取總RNA。提出的RNA溶于DEPC水，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，依照說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（采用美國(guó)Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒）。用實(shí)時(shí)PCR試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），依照說(shuō)明在實(shí)時(shí)PCR儀上對(duì)cDNA擴(kuò)增并行實(shí)時(shí)定量分析。檢測(cè)使用Primer 3.0設(shè)計(jì)合成特異性引物。引物設(shè)計(jì)序列如下：IL?6，P1，ATAGTCCTTCCTACCCC AATTTCC；P2，CTGACCACAGTGAGGAATGTCCA C。IL?18，P1，ACATCCGAAGCAACAAGC；P2，CGA AGTGAGAAGGCAACA。β?actin，P1，CACTGTGCC CATCTACGA；P2，GGTCTTTACGGATGTCAACG。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件處理，數(shù)據(jù)用x±s來(lái)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)的比較

腹腔注射酵母多糖及等量生理鹽水后，小鼠出現(xiàn)了不同程度的死亡情況。其中CON組及CCE組存活率為100%，Z組及CCE+Z組小鼠隨著時(shí)間推移存活率逐漸下降，至18 h處死前，Z組存活率為56%，CCE+Z組存活率為67%。Z組及CCE+Z組小鼠在腹腔注射酵母多糖6 h左右均出現(xiàn)了活動(dòng)減少，嗜睡，進(jìn)食、飲水量減少，排便增多，多汗，尿少，呼吸深大等癥狀，2組癥狀未見(jiàn)明顯差別。CON組及CCE組小鼠一般狀態(tài)良好。

2.2 各組小鼠肝臟組織損傷程度比較

CON組及CCE組小鼠肝臟紅潤(rùn)，大體無(wú)腫脹及充血。光鏡下可見(jiàn)2組小鼠肝組織中正常結(jié)構(gòu)存在，肝索整齊，肝細(xì)胞核圓形居中，核膜清晰無(wú)明顯改變（圖1A、1B）。Z組及CCE+Z組小鼠肝臟大小無(wú)明顯改變，稍顯暗紅。光鏡下可見(jiàn)Z組肝小葉中央靜脈及Ⅲ區(qū)肝竇擴(kuò)張淤血，肝細(xì)胞核空泡狀，局部可見(jiàn)肝細(xì)胞嗜酸性變及點(diǎn)狀壞死，并見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1C）；CCE+Z組病理改變較Z組輕，但比CON組重，肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)空亮或水樣變性，但未見(jiàn)明顯灶性壞死（圖1D）。

2.3 各組小鼠血清ALT水平比較

圖1 各組小鼠肝臟組織損傷程度比較Fig.1 Comparison of liver tissue damage in mice of each group

CON組、CCE組、Z組及CCE+Z組血清ALT水平分別為（37±3.7）U/L、（29±2.9）U/L、（80±8.0）U/L、（40±4.0）U/L。與CON組及CCE+Z組比較Z組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 小鼠肝臟組織中IL?6、IL?18蛋白及mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，IL?6、IL?18在各組的蛋白水平上表

達(dá)不同，Z組表達(dá)最多，CCE+Z組表達(dá)水平相對(duì)降低。與CON組及CCE+Z組比較Z組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL?6mRNA表達(dá)與Z組比較，CCE+Z組明顯降低（P＜0.05）；IL?18mRNA表達(dá)與CON組及CCE+Z組比較，Z組明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖2。可見(jiàn)預(yù)防性應(yīng)用膽維丁乳后，小鼠肝臟組織中的IL?6及IL?18表達(dá)不論是在蛋白水平還是mRNA水平都下降。

表1 各組小鼠肝臟組織中IL?6、IL?18蛋白及mRNA表達(dá)比較Tab.1 Comparison of protein and mRNA expression of IL?6 and IL?18 in liver tissue of mice in each group

圖2 各組小鼠肝臟組織中IL?6及IL?18蛋白表達(dá)Fig.2 IL?6 and IL?18 protein expression in liver tissue of mice in each group

3 討論

多器官衰竭是膿毒癥晚期的重要死亡原因，近年來(lái)已有數(shù)十種拮抗致炎因子藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)性治療階段，但療效遠(yuǎn)不如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示的效果理想［10］。酵母多糖是近年來(lái)應(yīng)用比較廣泛的致多器官衰竭模型藥物。它的機(jī)制是能夠引起無(wú)菌性腹膜炎，致使炎癥反應(yīng)遷延失控，過(guò)度激活補(bǔ)體系統(tǒng)，調(diào)動(dòng)炎性細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答。且酵母多糖是啤酒酵母菌細(xì)胞壁的提取物，不引入外源性細(xì)菌和內(nèi)毒素，可以致嚴(yán)重炎癥，而致病原因簡(jiǎn)單。本研究小鼠腹腔注射大量酵母多糖混懸液6 h后，出現(xiàn)活動(dòng)遲緩，抖動(dòng)，被毛濕臟，不喜進(jìn)食，呼吸狀態(tài)改變等癥狀，12 h左右開始出現(xiàn)死亡，可見(jiàn)小鼠的急性損傷涉及肝臟、腎臟、肺臟等多器官，大劑量腹腔注射酵母多糖已致小鼠多器官功能衰竭。結(jié)果顯示ALT升高、組織病理學(xué)發(fā)生改變，說(shuō)明肝臟出現(xiàn)了急性損傷的表現(xiàn)，表明造模成功。

IL?6是一種由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的多能單鏈黏蛋白細(xì)胞因子，在正常情況下可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與炎癥反應(yīng)，在抗感染防御中起重要作用，病理狀態(tài)下過(guò)度升高可造成機(jī)體的病理性損傷［11］。IL?18是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有多種調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子，主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞Th1細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等分泌、又能促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖和Th1型免疫應(yīng)答、促進(jìn)TNF?α、NO、GH?CSF等炎性細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生。同時(shí)該因子為一種強(qiáng)烈的TNF?α誘導(dǎo)因子，而TNF?α又通過(guò)正反饋通路刺激單核-巨噬細(xì)胞大量分泌IL?18，加速炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，造成細(xì)胞免疫介導(dǎo)的組織炎癥性損傷。

本研究結(jié)果顯示，酵母多糖混懸液行腹腔注射18 h后，純水喂養(yǎng)的小鼠肝臟組織損傷程度較膽維丁乳溶液喂養(yǎng)的小鼠明顯加重，因?yàn)榻湍付嗵歉骨蛔⑸浜蠼?jīng)腹腔中的腸系膜、大小網(wǎng)膜吸收入血進(jìn)入腸系膜靜脈，到達(dá)肝臟，首先對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，而膽維丁乳在一定程度上可以對(duì)這種毒性損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。肝功能改變?cè)谧⑸浣湍付嗵呛骦組小鼠血ALT明顯升高，而CCE+Z組小鼠下降，說(shuō)明維生素D信號(hào)系統(tǒng)有保護(hù)肝細(xì)胞損傷、抑制白細(xì)胞由血液向組織中轉(zhuǎn)移的能力。研究［12］顯示酵母多糖是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的強(qiáng)大激活劑，主要作用的靶細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞與之接觸后即分泌大量炎癥介質(zhì)（TNF?α、IL?1、IL?6、IL?18等）。大量酵母多糖入血雖然可產(chǎn)生直接的毒性作用，但大部分有害作用是由于巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本結(jié)果顯示細(xì)胞因子IL?6及IL?18在Z組表達(dá)最多，而CCE+Z組與之比較相對(duì)減少，與以往研究結(jié)果一致。

既往研究［10］中已表明活性維生素D對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝損傷存在保護(hù)作用，也有大量的研究［13］表明，維生素D具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎等作用，本研究從另一角度證明膽維丁乳對(duì)酵母多糖所致多器官衰竭的小鼠肝臟損傷亦存在保護(hù)作用，以后將進(jìn)一步探討膽維丁乳在此模型中對(duì)其他臟器的作用。

［1］張倩，劉忠厚.維生素D與健康研究進(jìn)展［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2010，（9）：678-682.DOI：10.3969/j.issn.1006?7108.2010.09.014.

［2］PIKE JW，MEYER MB.The vitamin D receptor：new paradigms for the regulation of gene expression by 1，25?dihydroxyvitamin D3［J］. Rheum Dis Clin North Am，2012，38：13-27.DOI：10.1016/j.rdc.20 12.03.004.

［3］董時(shí)軍，周英紅，李曉松，等.維生素D抗呼吸道感染免疫研究近況［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2010，26（8）：634-635.

［4］JUHA PV，SHIVAPRAKASH JM，KARL?HEINZ H，et al.De?creased preoperative serum 25?hydroxyvitamin D levels in colorec?tal cancer are associated with systemic inflammation and serrated morphology［J］.Sci Reports，2016.DOI：10.1038/srep36519.

［5］郭萌，李冠民，黃清泉.細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（5）：397-400.DOI：10.3969/j.issn.1005?4847.

［6］AGMON?LEVIN N，THEODOR E，SEGAL RM，et al.Vitamin D in systemic and organ?specific autoimmune diseases［J］.Clin Rev Al?lergy Immunol，2013，45（2）：255-266.DOI：10.1007/s12016?012?8342?y.

［7］KWOK RM，TORRES DM，HARRISON SA.Vitamin D and nonalco?holic fatty liver disease（NAFLD）：is it more than just an associa?tion?［J］.Hepatology，2013，58（3）：1167-1174.DOI：10.1111/apt. 12377.

［8］趙晴，婁巖，李丹，等.維生素D受體對(duì)急性肝臟損傷保護(hù)作用的研究［J］.實(shí)用藥物與臨床，2015，18（1）：24-27.DOI：10.14053/ j.cnki.ppcr.201501006.

［9］JANSEN MJ，HENDRIKS T，VERHOFSTAD AA，et al.Gradualde?velopment of organ damage in the murine zymosan?inducedmultiple organ dysfunction syndrome［J］.Shock，1997，8（4）：261-267.

［10］WHEELER DS，ZINGARELLI B，WHEELER WJ，et al.Novel pharmacologic approaches to the management of sepsis：targeting the host inflammatory response［J］.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov，2009，3（2）：96-112.

［11］趙曉琴，龍曉弘，鄺曉聰.全身炎癥反應(yīng)綜合征動(dòng)物模型發(fā)病機(jī)制的研究［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13（29）：3293-3297.DOI：10.3969/j.issn.1007?9572.

［12］ZHOU H，ZHANG W，GAO X，et al.Inhibition of zymosan?in?duced inflammatory factors expression by atra nanostructured lipid carriers［J］.J Ophthalmol，2016，2016：4952340.DOI：10.1155 /2016/4952340.

［13］VOSOUGHI N，KASHEFI P，ABBASI B，et al.The relationship be?tween vitamin D，clinical outcomes and mortality rate in ICU pa?tients：a prospective observational study［J］.J Res Med Sci，2016，21（4）：1735-1995.DOI：10.4103/1735?1995.189692.

（編輯 武玉欣）

Effect of Cholecalciterol Cholesterol Emulsion on Liver of Zymosan?induced Multiple Organ Failure in Mice

ZHAO Qing1，LOU Yan2，SUN Can1，KONG Juan1
（1.Department of Clinical Nutrition，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Computer，School of Fundamental Sciences，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To study the effect of cholecalciterol cholesterol emulsion（CCE）in the zymosan（Z）?induced acute hepatic injury.Meth?ods A total of 36 C57 BL/6 mice were randomly divided into 4 groups，namely negative control（CON）group，CCE group，Z group and CCE+Z group，respectively.There were 9 mice in each group.Mice from CON group and Z group were fed with pure water.Mice from CCE group and CCE+Z group were fed with cholecalciterol cholesterol emulsion 20 μL dissolved in 200 mL pure water which was kept in darkness.After 14 days，Z group and CCE+Z group were injected with zymosan at a dose of 500 mg/kg.After 18 hours，all the mice in each group were sacrificed.The liver tissues were harvested for histopathological examination.The serum ALT levels were determined.The molecular expression of IL?6 and IL?18 in liv?er tissue of mice were evaluated by Western blotting and real?time quantitative PCR method.Results The results of histopathological examination showed that liver tissue damage in CCE+Z group was lighter than that of Z group，and heavier than that of the CON group.Compared to the CON group，Z group had the highest serum ALT level，followed by CCE+Z group，while in Z group was significantly lower than that in CON group（all P＜0.05）.The expression of IL?6 and IL?18 protein and mRNA showed level of Z group was apparently higher than those of CON group and CCE+ Z group（allP＜0.05）.Conclusion Cholecalciterol cholesterol emulsion can play certain protective effect on zymosan?induced liver injury in mice.

cholecalciterol cholesterol emulsion；zymosan；cytokine；hepatic injury

R332

A

0258-4646（2017）03-0197-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81170065，81570811）

趙晴（1982-），女，主治醫(yī)師，碩士.

孔娟，E-mail：kongj1@sj?hospital.org

2016-09-02

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：