董合玲，徐曉陽，趙軍

DONG He-ling1，XU Xiao-yang2，ZHAO Jun1

谷氨酰胺補充和電刺激對C2C12肌管蛋白合成通路的影響

董合玲1，徐曉陽2，趙軍1

DONG He-ling1，XU Xiao-yang2，ZHAO Jun1

骨骼肌占整個機體質(zhì)量的40%～50%，對生命質(zhì)量的維持具有非常重要的作用。蛋白質(zhì)更新可以增加骨骼肌質(zhì)量［29］，而運動時蛋白質(zhì)代謝呈現(xiàn)出復(fù)雜的動態(tài)過程，與機體運動方式、運動量、運動強度、運動時間、營養(yǎng)的補充劑量及時間等有關(guān)。谷氨酰胺（Glutame，Gln）是人體含量最多的條件性必需氨基酸，主要在骨骼肌中合成。在運動機體中，谷氨酰胺可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成代謝和降低肌肉蛋白質(zhì)的降解，增長肌肉力量，維持機體的生理功能［1］。因此，運動員在運動訓(xùn)練中，合理補充一定量的谷氨酰胺對運動機能的提高是非常重要的。但是，機體對谷氨酰胺的需要量有一定的限度，過量補充只能造成谷氨酰胺的過代謝，增加肝臟代謝負擔(dān)。目前，補充谷氨酰胺的研究關(guān)鍵是確定在不同情況下、不同時間段的所需劑量。

細胞內(nèi)有多條蛋白代謝調(diào)控通路，如Ras/MAPK通路、AMPK通路、PI3K/Akt/mTOR通路、Calcineurin/NFAT通路、MEK/ERK/p90RSK等，它們在細胞內(nèi)部構(gòu)成一個復(fù)雜有序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其中起核心作用的是mTOR通路［26，29］。mTOR，即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，在細胞的增殖、生長和分化過程中起中心調(diào)控作用［23］，參與蛋白質(zhì)合成代謝。mTOR經(jīng)上游因子作用激活后，主要通過4E-BP1、S6K1兩個下游因子的磷酸化，進一步調(diào)控機體蛋白的代謝及細胞的生長和增殖。mTOR通路在骨骼肌的生長發(fā)育尤其是運動性骨骼肌肥大中發(fā)揮重要的作用，而S6K1則是運動導(dǎo)致mTOR激活的直接反映因子和蛋白質(zhì)合成增加的標(biāo)志因子［19］。研究證明，對mTOR通路的抑制能阻斷95%的肌肉肥大效應(yīng)［7］。目前，mTOR通路與運動關(guān)系的研究主要集中在3種類型的運動練習(xí)中，分別為急性的一次性抗阻運動、高頻電刺激模擬抗阻運動和低頻電刺激模擬耐力運動，而相關(guān)長時間系統(tǒng)性運動類型的研究相對較少。此外，大部分研究是關(guān)于mTOR通路在運動后恢復(fù)早期中作用的研究，而在恢復(fù)后期mTOR通路影響的研究相對較少。而且，運動時肌肉收縮激活mTOR信號通路的具體機制還不清楚。比較普遍的看法是，類似耐力訓(xùn)練形式的運動可激活骨骼肌細胞AMPK通路，抑制mTOR信號通路，而類似抗阻訓(xùn)練形式的運動則激活mTOR通路［4，27］。

本研究的實驗對象為C2C12（Mouse C3H muscle myoblast）細胞，分化的C2C12肌管可完成與在體骨骼肌細胞同樣的收縮［5］，同時避免了在體實驗中其他器官、組織、細胞和激素的影響，能更實時的研究運動刺激和谷氨酰胺補充對骨骼肌細胞蛋白質(zhì)合成的影響。適宜的運動可以促進蛋白質(zhì)合成，谷氨酰胺的適量補充也可以促進蛋白質(zhì)的合成，但其機制仍不完全清楚。mTOR通路是骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝的主要調(diào)控通路，而關(guān)于谷氨酰胺補充與mTOR通路關(guān)系的研究較少。本實驗通過采用電刺激模擬運動訓(xùn)練方案（15 V，30 ms，3 Hz，90 min）以及補充谷氨酰胺（10 mmol/L，48 h）方案，測定肌管的蛋白質(zhì)含量，以及mTOR通路中mTOR mRNA和S6K1 mRNA的相對表達率，研究電刺激模擬運動與谷氨酰胺補充對蛋白質(zhì)含量及mTOR通路的影響，為運動損傷及恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

C2C12細胞（小鼠骨骼肌肌母細胞株，購自南方醫(yī)科大學(xué)解剖教研室）；DMSO、DEPC、L-谷氨酰胺（美國sigma公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，MBCHEM公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基、馬血清（美國GIBCO公司）；Primer、引物合成（美國Invitrogen公司）；RIPA裂解液、BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；SYBR premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司）。

1.2 谷氨酰胺孵育及電刺激方案

C2C12細胞常規(guī)培養(yǎng)，取生長狀態(tài)好的細胞傳代于35 cm的6孔板培養(yǎng)皿中，加入4 mmol/L谷胺酰胺含10%胎牛血清的生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞鋪滿皿底面積的90%以上時，加入含2%馬血清的分化培養(yǎng)基分化5天。谷氨酰胺孵育組在10 mmol/L谷氨酰胺分化培養(yǎng)基中孵育48 h，其他組繼續(xù)分化，待所有組細胞分化7天時，開始進行電刺激或無刺激實驗。采用GRASS S48 Stimulator型電刺激器電刺激共分化7天的C2C12肌管，強度為15 V，30 ms，3 Hz，90 min。電刺激后0 h、6 h、18 h、24 h收樣。

1.3 實驗分組：

單獨對照組（Con）；單獨谷氨酰胺組（Gln）；根據(jù)電刺激的收樣時間，單獨電刺激組分為：單獨電刺激后0 h收樣組（Es0）、單獨電刺激后6 h收樣組（Es6）、單獨電刺激后18 h收樣組（Es18）、單獨電刺激后24 h收樣組（Es24）；谷氨酰胺孵育+電刺激組分為：谷氨酰胺孵育加電刺激后0 h收樣組（Gln+Es0）、谷氨酰胺孵育加電刺激后6 h收樣組（Gln+ Es6）、谷氨酰胺孵育加電刺激后18 h收樣組（Gln+Es18）、谷氨酰胺孵育加電刺激后24 h收樣組（Gln+Es24）。共計10組。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 C2C12肌管總蛋白濃度測定

采用碧云天研究所提供的二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒。將待測樣品上清棄去，用預(yù)冷的PBS洗2次。加入RIPA裂解液（200μL/皿），冰上裂解30 min，4℃離心（12 000 g，10 min），吸取上清。依照試劑盒說明書測定蛋白含量，同時制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。C2C12細胞蛋白量單位用每平方厘米皿底面積含有的蛋白微克數(shù)來表示（g/ cm2）。

1.4.2 測定C2C12肌管中mTOR mRNA和S6K1 mRNA表達

1.提取細胞內(nèi)總RNA

用Trizol裂解液裂解C2C12肌管，按常規(guī)方法提取純化總RNA，溶于適量DEPC水后分裝，取適量測其純度和總量，其余于－80℃冰箱保存。

2.RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

按試劑說明書配RT反應(yīng)液，總體積10μL：5×Prime-Script Buffer 2μL；PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 0.5μL；Random 6mers（100μmol/L）0.5μL；Oligo dT Primer（50 μmol/L）0.5μL；Total RNA 2μL；DEPC水4.5μL。使用反轉(zhuǎn)錄儀將RT反應(yīng)液中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件如下：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，30 min。將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA于－80℃冰箱保存。

3.定量PCR

按照說明書配制PCR反應(yīng)液，總體積25μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL；引物混合液/內(nèi)參引物2μL；RT反應(yīng)液2μL；DEPC水8.5μL。引物序列：mTOR上游5'-ATGGCGGATGATCTAAAGCGA-3'；mTOR下游5'-GGCACTGTCGTTAGCCACT-3'，S6K1上游5'-CCATCACACACCACGTCAAG-3'，S6K1下游5'-TTGCGTACCAGGAAGACTTTG-3'。PCR反應(yīng)液混勻后在熒光PCR儀上擴增目的基因：95℃預(yù)變性30 s一個循環(huán)，然后執(zhí)行（95℃變性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30s）45個循環(huán)，最后72℃再延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后，采用55℃～95℃間隔1℃2s進行融解曲線分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

研究數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，各數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，并用單因素方差分析進行各組間的差異顯著性檢驗。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 C2C12分化過程中總蛋白含量的變化

由表1數(shù)據(jù)可知，C2C12細胞分化前6天總蛋白含量變化呈上升趨勢，且每天的總蛋白含量與前一天比較均有極顯著差異（P＜0.01），六天后總蛋白含量變化趨于穩(wěn)定，無顯著差異（P＞0.05）。

表1 本研究不同分化天數(shù)后C2C12肌管總蛋白含量的變化結(jié)果（g/cm2，±SD）Table 1 Protein Content of Different Differentiation Time in C2C12

表1 本研究不同分化天數(shù)后C2C12肌管總蛋白含量的變化結(jié)果（g/cm2，±SD）Table 1 Protein Content of Different Differentiation Time in C2C12

注：@表示與前一天細胞總蛋白比較，有顯著差異（P＜0.05）；@@表示與前一天細胞總蛋白比較，有極顯著差異（P＜0.01）。

43.30±0.10 46.49±0.01@@47.52±0.13@48.95±0.10@@53.81±0.32@@55.47±0.74@@54.96±0.60 55.19±1.01 54.28±0.92 54.99±0.24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

2.2 不同濃度谷氨酰胺孵育后C2C12肌管總蛋白含量變化由表2數(shù)據(jù)可知，與4 mmol/L組相比，0 mmol/L組、2 mmol/L組C2C12肌管總蛋白含量極顯著降低（P＜0.01），10 mmol/L組C2C12肌管總蛋白含量極顯著升高（P＜0.01）。因此，谷氨酰胺的補充濃度為10 mmol/L。

2.3 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管總蛋白含量變化

由表3數(shù)據(jù)可知，與Con組蛋白含量相比，Gln、Es18和

Es24組極顯著升高（P＜0.01），Es6組極顯著降低（P＜0.01），

Es0組無顯著變化（P＞0.05）。與Gln相比，Gln+Es18、Gln+ Es24組蛋白含量均極顯著升高（P＜0.01），Gln+Es6組蛋白含量極顯著降低（P＜0.01），Gln+Es0組無顯著變化（P＞0.05）。Gln+Es組各收樣時間點的蛋白含量變化趨勢與Es組相似，但整體水平上升，且Gln+Es6組的蛋白含量顯著高于Es6組（P＜0.05）。

表2 不同濃度谷氨酰胺孵育后C2C12肌管總蛋白含量變化（±SD）Table 2 Total Protein Content with Different Concentration of Glutamine

表2 不同濃度谷氨酰胺孵育后C2C12肌管總蛋白含量變化（±SD）Table 2 Total Protein Content with Different Concentration of Glutamine

注：與4 mmol/L組（正常培養(yǎng)組）比較，#表示有顯著差異（P＜0.05）；##表示有極顯著差異（P＜0.01）。

蛋白含量（g/cm2）34.37±0.96##36.59±0.83##38.87±0.20 38.63±0.34 38.25±0.01 41.93±0.43##39.20±0.86 39.17±0.45 39.30±0.11 GLN濃度（mmol/L）0 2 4 6 8 1 0 12 16 20

表3 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管總蛋白含量的變化（g/cm2、±SD）Table 3 Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on the Protein Content

表3 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管總蛋白含量的變化（g/cm2、±SD）Table 3 Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on the Protein Content

70.86±1.23##74.62±0.40＄＄##分組Con Gln Es Gln+Es 0 h 55.7±0.79 58.6±1.10##56.8±0.55 59.1±0.67##6 h 18 h 24 h 48.89±1.43##*53.76±0.85＄＄##68.36±1.67##72.90±1.50＄＄##

2.4 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管mTOR mRNA表達變化

由表4數(shù)據(jù)可知，Gln組mTOR mRNA相對表達率顯著高于Con組（P＜0.05）。Es0組mTOR mRNA相對表達率略低于Con組（P＞0.05），Es6組略高于Con組（P＞0.05），但顯著高于Es0組（P＜0.05）；Es18組極顯著高于Con組（P＜0.01）。Gln+Es組與Es組相比，mTOR mRNA相對表達率大體趨勢相同，先上升后下降，但Es組是在電刺激后18 h達到高峰，而Gln+Es組是在電刺激后6 h達到高峰。說明，谷氨酰胺促進電刺激后肌管mTOR的提前激活。

2.5 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管S6K1 mRNA表達變化

由表5數(shù)據(jù)可知，Gln組S6K1 mRNA相對表達率顯著高于Con組（P＜0.05）。Es0組S6K1 mRNA相對表達率略低于Con組（P＞0.05），Es6組顯著高于Con組（P＜0.05），Es18組略高于Con組（P＞0.05），但仍顯著高于Es0組（P＜0.05）。Gln+Es組與Es組相比，S6K1 mRNA相對表達率大體趨勢相同，先上升后下降，但整體表達水平顯著上升（P＜0.05）。此外，Gln+Es中各組與Gln組相比，均無顯著差異（P＞0.05），說明，電刺激對谷氨酰胺孵育的C2C12肌管S6K1 mRNA表達無顯著影響。

表5 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管S6K1 mRNA相對表達率比較Table 5 Expression of mTOR mRNA in C2C12 Myotubes

3 分析與討論

谷氨酰胺是人體含量最多的條件性必需氨基酸，主要在骨骼肌中合成，是增長肌肉力量的必需營養(yǎng)素，與運動能力有密切的聯(lián)系。關(guān)于運動中谷氨酰胺的代謝，需根據(jù)運動類型分析。1）短時間大強度運動（＜l h）后血漿谷氨酰胺水平普遍上升。一方面原因是大強度運動產(chǎn)生大量氨，促使谷氨酸與氨合成增加，血漿谷氨酰胺水平上升；另一方面，運動導(dǎo)致體內(nèi)水分丟失、循環(huán)血量減少，亦是其上升的原因。2）長時間（≥1 h）運動后血漿谷氨酰胺水平普遍下降。其原因是機體對谷氨酰胺的利用率上升，同時，谷氨酰胺合成酶的最大活性下降。3）在超長時間運動中，機體開始適應(yīng)運動，且糖原得到及時補充，因此，谷氨酰胺消耗和生成接近平衡，表現(xiàn)為運動后無明顯變化。運動機體中骨骼肌大量消耗能量物質(zhì)的同時，蛋白質(zhì)降解大于合成，機體處于負氮平衡。而谷氨酰胺是氮流動的重要載體和蛋白合成前體，當(dāng)機體合成的谷氨酰胺不能滿足其自身需求時，需適時的補充外源性谷氨酰胺［1，3］。因此，補充外源性谷氨酰胺對運動機體維持正常功能起到非常重要的作用。補充谷氨酰胺可促進蛋白合成，抑制蛋白降解，這與國內(nèi)、外許多實驗結(jié)論相符合［2，31］。

氨基酸不但是蛋白質(zhì)合成的必需前體物質(zhì)，也可作為信號因子和調(diào)節(jié)因子參與蛋白質(zhì)代謝。作為調(diào)控因子的氨基酸可以調(diào)控代謝通路中細胞內(nèi)蛋白合成酶的活性，如某些成分的mRNA表達［22］。研究證明，mTORC1是核內(nèi)體和溶酶體的表面調(diào)控因子，mTORC1一旦激活，繼而調(diào)控下游蛋白翻譯起始和/或翻譯延伸因子的磷酸化和活性，mTORC1主要下游因子有4E-BP1、S6K1、eIF2a等［7］。HeLa細胞模型的研究證明，谷氨酰胺可通過激活mTOR而促進細胞蛋白合成，mTOR激活主要依賴做為必需氨基酸的谷氨酰胺的吸收和快速流出［13，15，25］。然而，谷氨酰胺調(diào)控骨骼肌質(zhì)量的具體機制尚不完全清楚，肌肉收縮如何影響mTOR通路的機制也存有疑問，激素的變化、鈣離子含量的高低、機械收縮-電變化、組織細胞局部低氧、營養(yǎng)狀況等均可能與之相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，S6K1在運動后發(fā)生顯著變化的時間點不同，但共同點是S6K1在運動結(jié)束后的變化具有延遲性［20，25］。另外，有研究證明，骨骼肌S6K1激活與上游因子mTOR激活并不一定存在絕對一致性［6］，在mTOR激活的情況下，S6K1并不一定激活［16］。

圖1 谷氨酰胺孵育加電刺激后C2C12肌管蛋白含量及mTOR信號通路的指標(biāo)變化柱狀圖Figure 1.Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on mTOR and S6K1 Protein

本實驗結(jié)果顯示，Gln組蛋白含量極顯著高于Con組，可見，谷氨酰胺可促進蛋白合成，抑制蛋白降解。與Con組蛋白含量相比，Es6組極顯著下降，Es18、Es24組蛋白含量極顯著上升，說明，本實驗應(yīng)用的電刺激方案，電刺激后6 h可引起骨骼肌蛋白降解，總蛋白含量下降，而電刺激后18 h合成大于降解，蛋白含量上升。機體運動時，骨骼肌中能量物質(zhì)大量被消耗，引起蛋白質(zhì)降解大于合成，機體處于負氮平衡，表現(xiàn)為骨骼肌總蛋白含量的下降。運動結(jié)束后，蛋白質(zhì)的降解和合成之間新的平衡被重新建立［6］，骨骼肌總蛋白含量不再處于下降趨勢［8，10］，隨著時間的延長，總蛋白含量上升。Gln+Es組各時間點的蛋白含量變化趨勢與Es組相似，但整體水平有所上升，且Gln+Es6組的蛋白含量顯著高于Es6組，說明，谷氨酰胺補充有利于電刺激后C2C12肌管蛋白含量的維持和升高。

與蛋白含量的結(jié)果相似，谷氨酰胺可促進C2C12肌管mTOR mRNA表達。氨基酸不但是蛋白質(zhì)合成的必需前體物質(zhì)，也可作為信號因子和調(diào)節(jié)因子參與蛋白質(zhì)代謝。單獨電刺激后即刻，C2C12肌管mTOR mRNA未大量表達，而是從電刺激后6 h開始表達上升，電刺激后18 h已大量表達。肌肉收縮影響mTOR通路機制目前還不清楚，激素的變化、鈣離子含量的高低、機械收縮-電變化、組織細胞局部低氧、營養(yǎng)狀況等均可能與之相關(guān)。Gln+Es組與Es組相比，mTOR mRNA相對表達率大體趨勢相同，先上升后下降，但Es組是在電刺激后18 h達到峰值，而Gln+Es組是在電刺激后6 h達到峰值，說明，谷氨酰胺可以使電刺激后C2C12肌管mTORmRNA表達提前。有研究顯示，在運動后恢復(fù)期攝入富含亮氨酸的EAA+CHO混合溶液時，mTOR信號通路進一步增強，可引起更大的肌肉蛋白質(zhì)合成［9，21］?？梢?，營養(yǎng)與運動結(jié)合具有增強mTOR通路的作用。

與mTOR mRNA表達相似，Gln組與Es6組的S6K1 mRNA相對表達率顯著高于Con組。Gln+Es組與Es組相比，S6K1 mRNA相對表達率大體趨勢相同，呈現(xiàn)先上升后下降，但整體表達水平顯著上升。單獨谷氨酰胺或電刺激均通過mTOR通路影響mTOR mRNA表達，繼而影響S6K1 mRNA表達，谷氨酰胺補充使電刺激后C2C12肌管S6K1 mRNA表達上升進一步增加。有研究發(fā)現(xiàn)，S6K1在運動后發(fā)生顯著變化的時間點不同，但共同點是S6K1在運動結(jié)束后的變化具有延遲性［12，18，30］。此外，Gln+Es中各組與Gln組相比，均無顯著差異，說明，電刺激對谷氨酰胺孵育的C2C12肌管S6K1 mRNA表達無顯著影響。

總之，運動訓(xùn)練中合理補充一定量的谷氨酰胺對運動員非常重要，但過量補充只能造成谷氨酰胺的過分代謝，增加肝臟代謝負擔(dān)［11，17，24，28］。雖然，谷氨酰胺可增加運動后機體的蛋白代謝，但仍無可靠數(shù)據(jù)證實谷氨酰胺可減輕運動損傷造成的疼痛。雖然，谷氨酰胺是運動員營養(yǎng)補劑之一，但仍無充足數(shù)據(jù)支持關(guān)于谷氨酰胺補充的營養(yǎng)處方制定。因此，補充谷氨酰胺的關(guān)鍵所在是確定不同情況下補充谷氨酰胺的劑量和時間。此外，mTOR mRNA與S6K1 mRNA的表達并不完全一致，因此，谷氨酰胺是否會通過其他通路或因子影響蛋白合成仍需更多研究證實。

4 結(jié)論

1.單獨補充谷氨酰胺和單獨電刺激均可增加C2C12肌管中蛋白質(zhì)含量、mTORm RNA和S6K1 mRNA的表達。推斷谷氨酰胺和電刺激可通過mTOR通路促進C2C12肌管蛋白合成，進而促進肌管恢復(fù)。

2.單獨電刺激后，C2C12肌管mTOR mRNA相對表達率在電刺激后6 h達高峰，而S6K1 mRNA相對表達率在電刺激后18 h達高峰?？梢姡琺TOR通路中mTOR mRNA表達和S6K1 mRNA表達在時間上不同步。

3.谷氨酰胺與電刺激聯(lián)合作用后，肌管蛋白含量進一步增加，且mTOR mRNA表達提前達到峰值，S6K1 mRNA穩(wěn)定表達在高水平。谷氨酰胺聯(lián)合電刺激通過mTOR信號通路促進mTOR mRNA的表達，進而促進下游因子S6K1 mRNA表達，進一步促進C2C12肌管蛋白合成和肌管恢復(fù)。

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Effects of Glutamine and Electrical Stimulation on Protein Content Pathway in C2C12

目的： CC 22 CC1122肌管為細胞模型，探討電刺激模擬運動與谷氨酰胺補充對 CC 22 CC1122肌管蛋白質(zhì)含量及mmTTOORR通路的影響，進一步探明谷氨酰胺補充與蛋白質(zhì)代謝之間的關(guān)系。方法：谷氨酰胺孵育分化 55天的肌管4488 hh后，給予一次電刺激（1155 VV，3300 mmss， 33 HHzz，9900 mmiinn）。分別在電刺激后 00 hh、 66 hh、1188 hh和2244 hh收樣。實驗共1100組，單獨對照組（CCoonn）；單獨谷氨酰胺組（GGllnn）；單獨電刺激后不同時間點取樣組（EEss 00、EEss 66、EEss1188、EEss2244）；谷氨酰胺孵育加電刺激后不同時間點取樣組（Gllnn++EEss 00、Gllnn++EEss 66、Gllnn++EEss1188、Gllnn++EEss2244）。BBCCAA法測定各組肌管蛋白含量；RTT--PPCCRR法測定各組mTOR mmRRNNAA表達量及其下游因子 SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達量。結(jié)果： 11）與CCoonn相比，GGllnn組的蛋白含量、mmTTOORR及 SS 66 KK 11 mmRRNNAA均顯著升高（ PP＜ 00..0055）。 22）單獨電刺激（EEss）后，隨收樣時間延長，肌管蛋白含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。EEss 66極顯著下降（ PP＜ 00..0011），EEss1188極顯著上升（ PP＜ 00..0011）。而mmTTOORR和 SS 66 KK 11 mmRRNNAA的表達沒有下降，呈現(xiàn)先上升后恢復(fù)正常的趨勢。 33）谷氨酰胺和電刺激（Gllnn++EEss）聯(lián)合作用后，無論是蛋白含量，還是mmTTOORR及 SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達，具有與單獨電刺激相似的作用趨勢，且Gllnn++EEss各組數(shù)值均高于EEss各組（ PP＜ 00..0055）。此外，EEss組mmTTOORR表達在電刺激后1188 hh達高峰，而Gllnn++EEss組在 66 hh達高峰。結(jié)論： 11）單獨電刺激、單獨補充谷氨酰胺、兩者的聯(lián)合作用，均可通過mmTTOORR通路中mTOR mmRRNNAA和 SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達上升，增加蛋白合成，促進蛋白含量上升及肌管恢復(fù)。 22）谷氨酰胺使電刺激后 CC 22 CC1122肌管mTOR mmRRNNAA表達提前， SS 66 KK 11 mmRRNNAA表達穩(wěn)定處于高水平。

谷氨酰胺補充，mmTTOORR，電刺激， CC 22 CC1122肌管

Objective：This paper discusses the effects of glutamine and electrical stimulation on protein content and mTOR pathway in C2C12，and provides theoretical reference for how glutamine improving sports performance and recovery.Method：After 5 days of differentiation，C2C12 myotubes were incubated in 4mM or 10mM dose of glutamine for 48 hours，and then myotubes were stimulated to contract 90mins at 15v，3Hz，30ms.Samples were colllected in 0h，6h，18h，and 24h respectively after electrical stimulation.Therefore，there were 10 groups，including control group（Con），glutamine group（Gln），electrical stimulation group of different time point（sEs0 Es6，Es18，Es24），glutamine plus electrical stimulation of different time points（Gln+Es0，Gln+Es6，Gln+Es18，Gln+ Es24）.BCAProteinAssay Kit was used to measure total protein conten（tμg/cm2）.mTOR mRNAand S6K1 mRNA were measured by RT-PCR.The expression of each transcript was measured by the 2-ΔΔCt method using the threshold cycle（Ct）value.Results：1）Total protein content，mTORmRNA and S6K1mRNA expression of Gln was greater than that of Con（P＜0.05）.2）With the extension of collecting time after electrical stimulation（Es），muscle protein content showed a trend of decline followed by rise.That of Es6 decreased significantly（P＜0.01），but that of Es18 increased significantly（P＜0.01）.The expression of mTOR and S6K1 mRNArose first，and then came back to normal level.3）The trends of protein content，mTORmRNA and S6K1mRNA of Es was similar with Gln+Es，but the overall level rose（P＜0.05）.And the mTOR mRNA expression of Es reached the peak happened in 18 hour，while Gln+Es reached the peak in 6 hour.Conclusion：1）Electrical stimulation，glutamine can promote expression of mTOR mRNAand S6K1 mRNAthrough mTOR pathway，increase protein synthesis，and promote the rise of protein content and recovery.2）Glutamine can make the expression of mTORmRNA advance in C2C12 muscle tube after electrical stimulation，and the expressionof S6K1mRNAstableinahighlevel.

glutamine；mTOR；electricalstimulation；C2C12muscletube

1002-9826（2017）01-0104-07

10.16470/j.csst.201701013

G804.7

：A

2016-05-05；

：2016-10-31

董合玲，女，講師，博士，主要研究方向為運動營養(yǎng)生化及信號通路傳導(dǎo)。

1.暨南大學(xué)體育學(xué)院，廣東廣州510632；2.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631 1.Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.South China Normal University，Guangzhou 510631，China.