黃 琴

食管癌相關(guān)基因4(ECRG4)在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)及臨床意義

黃 琴

目的 分析ECRG4基因在肝細(xì)胞肝癌組織(HCC)中的表達(dá)與甲基化情況，并探討其臨床意義。方法 分別采用免疫組化法、MSP-PCR兩種方法，檢測50例肝癌組織、對(duì)應(yīng)癌旁組織及31例正常肝組織中的ECRG4蛋白的表達(dá)和ECRG4啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，并探討兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果 ECRG4蛋白在肝癌組織、癌旁肝組織中表達(dá)水平顯著低于正常肝組織(P<0.05)，在肝癌組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁肝組織(P<0.05)；且ECRG4肝癌組織的甲基化檢出率明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織(P<0.05)。ECRG4蛋白低表達(dá)率與ECRG4甲基化檢出率明顯相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 ECRG4 在HCC組織中表達(dá)下調(diào)與其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化存在明顯的關(guān)聯(lián)性，在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

肝腫瘤;基因,ECRG4;腫瘤轉(zhuǎn)移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:034～036)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)威脅全世界人民的的常見惡性腫瘤之一。目前國內(nèi)關(guān)于ECRG4基因在HCC方面的研究尚未見報(bào)道，因此本研究采用應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測ECRG4蛋白的表達(dá)情況；并采用甲基化特異性 PCR(methylation specific-PCR，MSP-PCR)檢測HCC組織中 ECRG4 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，探討 ECRG4 在HCC中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究中50例HCC患者均為我院2012年至2015年收治的，手術(shù)前均未做放療和化療，以術(shù)后組織病理學(xué)結(jié)果明確腫瘤類型。年齡29～70歲,男性36例,女性14例，高分化癌18例，低分化癌32例；FIGO分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期8例，Ⅱ期4例，Ⅲ期30例，Ⅵ期8例；使用組織標(biāo)本為手術(shù)切除的HCC癌組織和癌旁2 cm以外的正常食管粘膜上皮，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟水化。

1.2 主要試劑及儀器

石蠟組織 DNA 提取試劑盒(GTpureTM)來自上?；蚩萍脊?；抗ECRG4的多克隆抗體及PV9000 試劑購自美國Zymed公司，一抗?jié)舛葹?∶100。蛋白酶 K 和 DNA marker DL2000購自大連Takara公司；Wizard DNA cleanup 樹脂純化試劑盒購自 Promega 公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組化檢測

將常規(guī)脫蠟水化的標(biāo)本切片PBS 漂洗 3 次(3 min/次)，3% H2O2室溫孵育 10～20 min后再PBS 溶液漂洗 3 次(3 min/次)。然后浸于預(yù)熱的含0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中加熱 20 min分鐘，自然冷卻后PBS 溶液漂洗 3 次(3 min/次)。滴加抗 ECRG4 蛋白一抗，保持4 ℃孵育一夜。PBS 溶液漂洗 3 次(3 min/次)后加入PV9000試劑，室溫 20～25 min，PBS 溶液漂洗 3 次再加試劑2抗，37 ℃約30 min。鏡下觀察DAB溶液的顯色反應(yīng)，直至充分顯色后停止。然后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，持續(xù)5～10 s，并分別用不同濃度(70%、85%、100%)的乙醇脫水3 min，最后浸于二甲苯 10 min后封片。結(jié)果評(píng)定：0 分：組織未見染色；1分：染色程度均呈現(xiàn)輕度染色或呈現(xiàn)為中強(qiáng)度但染色細(xì)胞比例<25%；2 分：染色程度均中度染色或染色細(xì)胞比率達(dá)25%～50%；3 分：細(xì)胞染色程度深者>50%。并采用正常組織評(píng)分分別減去癌組織評(píng)分、癌旁組織評(píng)分的差值來判定是否存在ECRG4 蛋白低表達(dá)，差值<0則為無低表達(dá)(陰性)，差值=1 則弱低表達(dá)(陽性)，差值>1則為低表達(dá)明顯(強(qiáng)陽性)。

1.4 甲基化特異性 PCR

①DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾/純化：按照說明書操作，采用GTpureTM組織 DNA提取試劑盒提取石蠟組織標(biāo)本基因組 DNA，以 EpiTect Kit 進(jìn)行提取樣本的亞硫酸氫鹽修飾與純化，并于-20℃條件下保存。

②引物設(shè)計(jì)及合成：采用 MethPrimer 軟件根據(jù)ECRG4 基因序列分別進(jìn)行特異引物的設(shè)計(jì)，具體如下。甲基化引物：上游序列MF：5′-GTTTTGGAGTTTAGGGGTTGC-3′；下游序列MR：5′-AAAAAAATACGAACGAACAAACG-3′；大小 180bp。非甲基化引物：上游序列UF：5′-G-TTTTGGAGTTTAGGGGTTGTG-3′；下游序列 UR：5′-AAAAAAAATACAAACAAACAAACAC-3′；大小 170 bp。

③ECRG4基因擴(kuò)增：純化DNA作為模板，采用MSP-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性8 min；95 ℃變性 50 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共35個(gè)循環(huán)。

④判定標(biāo)準(zhǔn)。甲基化陽性：用甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，分為完全甲基化(僅有甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段)和不完全甲基化(甲基化引物與非甲基化引物均擴(kuò)增出相應(yīng)片段)；甲基化陰性：僅用非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶。甲基化和非甲基化的特異性引物均可擴(kuò)增出相應(yīng)的目標(biāo)基因片段，無其他條帶干擾，說明該技術(shù)較可靠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件完成數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)分析工作。根據(jù)數(shù)據(jù)具體的適用條件選用檢驗(yàn)或四格表精確檢驗(yàn)行定量資料的組間比較(獨(dú)立的兩兩比較)，P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織中 ECRG4 基因表達(dá)情況

HCC癌組織、癌旁組織、正常組織中ECRG4蛋白低表達(dá)率分別為78.00%(40/50)和44.00%(28/50)、9.68%(3/28)，肝癌組織、癌旁組織中ECRG4蛋白低表達(dá)率均明顯高于正常組織的，肝癌組織ECRG4蛋白低表達(dá)率高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 HCC組織中 ECRG4 蛋白表達(dá)情況比較/例

2.2 HCC組織中 ECRG4 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況

肝癌組織、癌旁組織、正常組織中ECRG4 基因甲基化檢出率分別為 58.0%(29/50)、32.0%(16/50)和3.2%(1/31)， 肝癌組織、癌旁組織均明顯高于正常組織，肝癌組織 ECRG4 甲基化的檢出率高于癌旁組織，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 HCC組織中 ECRG4 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況/例

2.3 ECRG4 基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與HCC臨床特征的相關(guān)性

癌組織中ECRG4 基因甲基化與其低表達(dá)百分率呈明顯正相關(guān)性(γ=0.823，P=0.008)；癌旁組織中ECRG4基因甲基化與其低表達(dá)百分率呈正相關(guān)性(γ=0.597，P=0.044)；癌旁組織中ECRG4基因甲基化與其低表達(dá)百分率無相關(guān)性(γ=0.140，P=0.309)。

3 討論

肝細(xì)胞肝癌(HCC)是1類發(fā)病率較高的惡性腫瘤，且HCC基因組表現(xiàn)出復(fù)雜性及多樣性，因此，為了HCC的早期診斷、預(yù)后判斷及靶向性治療，加大對(duì)HCC中基因表達(dá)及基因改變的研究具有重要的理論及臨床意義[1]。目前，有關(guān)抑癌基因的研究早已成為分子生物學(xué)和腫瘤遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來最新發(fā)現(xiàn)的定位于正常人體染色體 2q14.1～14.3、具有抑癌基因特征的ECRG4 基因得到許多腫瘤遺傳學(xué)專家的關(guān)注。ECRG4基因是通過 mRRNA 差異顯示技術(shù)從正常食管組織和高癌家族中分離出的一條差異表達(dá)序列[2]。早期有研究表明ECRG4 高表達(dá)于大量正常組織中，但在食管癌組織及許多其他腫瘤組織中低表達(dá)，被初步認(rèn)定為候選抑癌基因，且認(rèn)為ECRG4 的表達(dá)過量能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖[3]。

ECRG4主要是通過啟動(dòng)子DNA 甲基化過程參與基因表達(dá)調(diào)控，ECRG4高甲基化在胃癌、食管癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤組織中頻繁出現(xiàn)[4-5]。然而，對(duì)于 ECRG4 基因甲基化在肝細(xì)胞癌中的研究目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)， 肝癌組織、癌旁組織ECRG4 蛋白低表達(dá)百分率分別為78.00%(40/50)和44.00%(28/50),明顯高于正常組織蛋白低表達(dá)百分率9.68%(3/28)；肝癌組織、癌旁組織ECRG4 基因甲基化的檢出率分別為 58%(29/50)、32%(16/50)，高于正常組織ECRG4 基因的3.2%(1/31)，提示ECRG4 基因在HCC中表達(dá)下調(diào)，且其啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)高甲基化，此結(jié)論與既往ECRG4 基因在其他腫瘤中的研究結(jié)果大致相同。根據(jù)既往關(guān)于抑癌基因 ECRG4的理論研究可發(fā)現(xiàn)ECRG4 基因主要是通過參與了NF-KB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄激活，下調(diào) NF-KB 通路的效應(yīng)分子的表達(dá)，阻斷細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期停滯于 G1-S 期[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，ECRG4 基因在HCC組織中的表達(dá)下調(diào)與其異常甲基化表現(xiàn)為明顯的相關(guān)性，推測 ECRG4 基因的異常甲基化在HCC組織中具有腫瘤特異性，可能導(dǎo)致 ECRG4 對(duì)NF-KB信號(hào)通路的調(diào)控失靈，HCC細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，與HCC的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。因此，一定程度上，可以推測ECRG4 基因可作為HCC早期診斷的1種特異性指標(biāo)，并輔助性用于監(jiān)測HCC的發(fā)生、發(fā)展。最重要的是ECRG4 基因可作為進(jìn)一步研究HCC診治的潛在分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。因此，我們的研究中指出的ECRG4 的低表達(dá)及高甲基化在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用這一研究結(jié)果具有一定的理論與臨床實(shí)際意義，當(dāng)然，本研究一定程度上受到實(shí)際條件的限制，樣本量有限，日后還需要增加樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證，其具體的分子生物學(xué)作用機(jī)理也值得進(jìn)一步深入研究。

ECRG4 基因在HCC組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常組織，這與ECRG4 基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化密切相關(guān)，并在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，可進(jìn)一步探究ECRG4 基因的抑癌作用，為探索肝細(xì)胞肝癌的臨床診斷與治療新途徑提供新方向。

[1] 張真瑜.TIPE1在肝細(xì)胞肝癌中的作用及機(jī)制研究〔D〕.山東大學(xué),2013.

[2] 馬尚林，李文梅，游顏杰.卵巢癌中 ECRG4 基因啟動(dòng)子甲基化的研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2016,24(10):1623-1625.

[3] Li LW，Yu XY，Yang Y，et al.Expression of esophageal can- cer related gene 4(ECRG4)，a novel tumor suppressor gene，in esophageal cancer and its inhibitory effect on the tumor growth in vitro and in vivo〔J〕.Int J Cancer,2009,125(7):1505-1513.

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[5] Baird A，Lee J，Podvin S，et al.Esophageal cancer-related g- ene 4at the interface of injury，inflammation，infection，and malignancy〔J〕.Gastrointest Cancer，2014,2014(4):131-142.

[6] Chen J，Liu C，Yin L，et al.The tumor-promoting function of ECRG4 in papillary thyroid carcinoma and its related mechanism〔J〕.Tumour Biol,2015,36(2):1081-1089.

(編輯：吳小紅)

Expression of Esophageal Cancer Related Gene 4(ECRG4)in Hepatocellular Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

HUANGQin.

ShanghaiSixthPeople'sHospitalofEasternHospital,Shanghai,201306

Objective To study the expression of esophageal cancer-related gene 4(ECRG4)in hepatocellular carcinoma(HCC)and the methylation condition of ECRG4 of promoter region in gastric cancer tissues,and their clinical significance.Methods Immunohistochemistry and MSP-polymerase chain reaction(PCR)were used to detect the protein expression level of ECRG4 and its methylation condition in 50 cases of HCC tissues,the adjacent non-tumor tissues and in 31 cases of normal liver tissue respectively.Explore the correlation between the protein expression of ECRG4 and the methylation condition.Results The protein expression level of ECRG4 in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues both were significantly lower than normal liver tissues(P<0.05).The protein expression level of ECRG4 in HCC tissues was significantly lower than adjacent non-tumor tissues(P<0.05).The methylation rates of ECRG4 of promoter region in gastric cancer tissues were significantly higher than adjacent non-tumor tissues and normal gastric tissues(P<0.05).The low expression level and methylation rates of ECRG4 had significantly positive correlation(P<0.05).Conclusion The down-regulation of ECRG4 expression is associated with high methylation of ECRG4 promoter region in gastric cancer tissues，which is of great importance for the occurrence and development of HCC.

Hepatocellular carcinoma;Genes ECRG4;Tumor metastasis

201306 上海市第六人民醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.011

R735.7

A

1001-5930(2017)01-0034-03

2016-09-07

2016-12-15)