李 帆 姬 靜 史鵬燕 董文娟 劉 勇

體外誘導的粘蛋白抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞抗乳腺癌的研究

李 帆 姬 靜 史鵬燕 董文娟 劉 勇

目的 制備攜帶粘蛋白(MUC1)抗原基因的重組腺相關病毒(AAV/MUC1)，研究其感染樹突狀細胞(DC)所誘導的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)特異性殺傷腫瘤細胞的活性。方法 應用分子生物學方法制備高低度的重組腺相關病毒(AAV/MUC1)。AAV/MUC1體外感染外周血單核細胞，誘導分化為DC。DC與T淋巴細胞混合，刺激產(chǎn)生CTL。流式細胞技術檢測DC和CTL的分化和功能指標，MTS方法檢測CTL的殺傷活性和特異性。結(jié)果 成功制備的重組病毒(AAV/MUC1)滴度為6×1010拷貝/ml。感染單核細胞率為84.27%。所獲得的CTL對MUC1陽性的乳腺癌細胞株的殺傷率為(46.32±0.07)%。其殺傷作用具有MUC1抗原特異性和MHC-I類分子限制性的特征。結(jié)論 以MUC1抗原為靶點的CTL可有效地殺傷乳腺癌細胞，為乳腺癌提供了一條新的治療途徑。

樹突狀細胞；細胞毒性T淋巴細胞；粘蛋白；腺相關病毒；乳腺癌

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:012～015)

粘蛋白(MUC1)又稱糖類抗原CA15-3，是1種腫瘤相關抗原，具有較強的免疫原性。MUC-1在90%的乳腺癌中高表達，且MUC-1的表達量與乳腺癌患者的瘤負荷量成正相關[1-2]。腫瘤細胞表達的MUC1與正常細胞有所不同，是免疫細胞攻擊的重要靶點[3]。本研究的目的是以MUC1作為乳腺癌治療的靶點，為建立一種有效的靶向性細胞免疫治療的方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞和主要試劑

腺相關病毒(AAV)載體構(gòu)建系統(tǒng)(美國阿肯色大學贈送)，細胞株(ATCC公司)，細胞培養(yǎng)基和細胞因子(Life公司)，限制性內(nèi)切酶和MTS試劑(Promega公司)，單克隆抗體(BD公司)。引物由Invitrogen公司合成。MHC-I類分子配型相符的患者外周血細胞和MUC1抗原陽性的腫瘤組織標本來源于深圳市第二人民醫(yī)院。

1.2 攜帶MUC1基因的重組腺相關病毒的包裝和鑒定

采用常規(guī)RT-PCR方法從腫瘤組織中獲得MUC1 cDNA。PCR引物序列為ATGAATTCGCCTGCCTGAATCTGTTCTG和ATGGATCCAACCTGAGTGGAGTGGAATG。采用常規(guī)的分子克隆技術，將MUC1 cDNA插入腺相關病毒載體，獲得AAV/MUC1質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染293細胞，獲得AAV/MUC1病毒顆粒。按照斑點雜交法檢測病毒滴度。

1.3 制備MUC1抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)

按照常規(guī)方法，從80 ml乳腺癌患者的外周靜脈血中分離出人外周血單個核細胞，再分離出單核細胞和T淋巴細胞，在AIM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)。單核細胞培養(yǎng)體系中加入100 MOI AAV/MUC1，600 IU/ml GM-CSF以及100 IU/ml IL-4。5天后收獲懸浮的DC，并與T淋巴細胞混合，并加入20 IU/ml IL-2。繼續(xù)培養(yǎng)9天后收獲細胞。

1.4 AAV/MUC1感染效率的檢測

收獲1.3培養(yǎng)的DC，按常規(guī)方法，應用流式細胞技術檢測MUC1陽性細胞率，確定病毒感染單核細胞的感染率。

1.5 DC和CTL的功能檢測

應用常規(guī)的流式細胞技術分別檢測研究組(感染)和對照組(未感染)的細胞，DC的檢測指標為CD14、CD80、CD83、CD86、IL-10和IL-12，CTL的檢測指標為CD8、CD25、CD4、CD69和IFN-γ。

1.6 CTL特異性體外殺傷實驗

采用常規(guī)的細胞毒性檢測(MTS)方法。以上述所獲得的CTL為效應細胞，MUC1陽性細胞株MCF7以及MUC1陰性細胞株LNCap、HepG2為靶細胞[4-6]，細胞混合培養(yǎng)6 h后，測定OD值。計算效應細胞的殺傷率。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用PASW Statistics 18統(tǒng)計軟件。計量方法采用2組數(shù)據(jù)的比較均值t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 AAV/MUC1質(zhì)粒構(gòu)建及其病毒鑒定結(jié)果

RT-PCR結(jié)果如圖1A所示，MUC1 cDNA長度為927bp，與電泳結(jié)果一致。所構(gòu)建的AAV/MUC1質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果如圖1B所示，在927bp的位置出現(xiàn)陽性條帶，證明載體構(gòu)建成功。如圖2所示，AAV/MUC1的斑點深淺與6×1010copys/ml的標準品相近，因此確定所獲得的AAV/MUC1病毒滴度為6×1010copys/ml。

A為MUC1 cDNA PCR擴增結(jié)果電泳圖；B為重組 MUC1腺相關病毒載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖；1-4 為酶切結(jié)果；5為核酸Marker(0.1～10kb)。圖1 電泳圖

圖2 斑點雜交法檢測AAV/MUC1病毒滴度結(jié)果

2.2 AAV/MUC1的感染率

如圖3所示，AAV/MUC1感染后的DC，其MUC1抗原的表達率為84.27%，即病毒的感染率。

2.3 DC的功能檢測結(jié)果

AAV/MUC1感染的DC表達CD80、CD83、D86和IL-12的平均水平分別為88.23%、80.64%、88.81%和72.69%，明顯高于對照DC(P<0.01)，而CD14(5.76%)以及IL-10(3.06%)水平無明顯差別(P>0.05)，提示受病毒感染的DC的成熟度，抗原提呈功能較好，并傾向于刺激CTL產(chǎn)生。

2.4 CTL的功能檢測結(jié)果

在AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL中，CD69+CD8+雙陽性細胞的平均百分率為58.22%，明顯高于對照組(34.08%,P<0.01)，提示具有殺傷活性的CTL較多。而CD25+CD4+雙陽性的Treg細胞的平均百分率為7.83%，與對照組(11.56%)比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 CTL表達的γ干擾素(IFN-γ)水平的檢測結(jié)果

與對照組相比，AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL的IFN-γ表達水平較高，平均為44.26%，明顯高于對照組(20.34%)，表明CTL的殺傷活性較高(P<0.01)。

2.6 CTL的特異性體外殺傷實驗結(jié)果

如圖4A所示，AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL能有效地殺傷(裂解)MUC1陽性的乳腺癌細胞，對MCF7細胞株的殺傷率為(46.32±0.07)%，而對MUC1陰性的細胞株(LNCap和HepG2)沒有明顯的殺傷作用，殺傷率為(11.40±2.99)%和(9.94±3.33)%，而無AAV激活的CTL，其對MCF7的殺傷率為(12.47%±3.68)%。MCF7細胞組的殺傷率與其它組相比較存在顯著性差異(P<0.01)。如圖4B所示，在進行殺傷試驗之前，加入MUC1抗體或MHC-I類分子抗體，均可有效地抑制CTL殺傷腫瘤細胞的活性，殺傷率分別下降為(10.80±4.01)%和(10.91±3.29)%，與上述結(jié)果均存在顯著性差異(P<0.01)。

A為AAV/MUC1感染后的DC；B為對照組DC。圖3 流式細胞儀檢測MUC1抗原表達情況

A橫坐標以AAV/MUC1+MCF7為例，其代表的是AAV/MUC1激 活的CTL對MCF7的殺傷活性；B中MUC1抗體和MHC-I抗體代表CTL與MCF7混合前添加MUC1抗體或MHC-I類分子抗體。圖4 CTL的特異性體外殺傷實驗結(jié)果

3 討論

MUC1在正常細胞表達較弱或無表達，但在包括乳腺癌的多種腫瘤組織中高表達。由于癌組織中的MUC1糖基化不完全，使得MUC1核心蛋白暴露在細胞表面，容易為免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，且免疫原性較強，因此，MUC1是較理想的免疫攻擊的靶點。目前，將MUC1作為免疫治療靶點的研究卻很少。本研究的創(chuàng)新性在于將MUC1基因克隆至AAV病毒載體中，并制備相應的感染性病毒。被感染的DC將MUC1抗原信息提呈給T淋巴細胞，刺激其分化成為特異性殺傷乳腺癌細胞的CT。此研究結(jié)果具有臨床應用價值。

AAV載體是已知的最安全的病毒載體，不導致任何人體生理改變或病理變化。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)和食品及藥品管理局(FDA)連續(xù)多年宣布AAV是用于基因治療的最安全的病毒載體。AAV病毒本身免疫原性極低，而且本研究證實其對單核細胞具有較高的感染率(84.27%)，明顯高于通常的15%～30%蛋白轉(zhuǎn)染效率。因此，無論是實驗室研究和臨床應用，通過AAV攜帶抗原基因感染DC是DC負載抗原的最佳方法之一。

CD83分子是成熟DC的標志物，共刺激分子CD80和CD86是激活T淋巴細胞的必要信號[7]。這些CD分子表達水平與DC的成熟度和誘導細胞免疫反應等功能直接相關。DC的IL-12 的表達水平與DC誘導細胞免疫反應呈正相關，而IL-10的表達水平與DC誘導免疫抑制反應呈負相關[8]。本研究結(jié)果表明被AAV/MUC1感染的DC與對照組相比，CD80，CD83和CD86分子的表達水平顯著性地提高，提示DC具有強大的誘導細胞免疫反應的能力。本研究發(fā)現(xiàn)的高水

平的IL-12表達，低水平的IL-10表達，證明被AAV/MUC1感染的DC傾向于激發(fā)細胞免疫反應，產(chǎn)生CTL。

在T淋巴細胞亞群中，CD25+CD4+細胞代表的是調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Regulatory T cell,Treg)，其功能是抑制細胞免疫反應。CD69+CD8+細胞則代表被激活的CD8陽性T細胞[9]，即CTL，其主要功能是特異性裂解抗原陽性的靶細胞，具有MHC-I類分子限制性。在AAV/MUC1感染的DC刺激的T淋巴細胞亞群中，CD8+CD69+T細胞數(shù)量明顯增多，而CD25+CD4+Treg細胞數(shù)量減少，有利于CTL發(fā)揮最大的裂解靶細胞作用。抗原激活成熟的CD8淋巴細胞分泌IFN-γ，IFN-γ是免疫應答的正向調(diào)節(jié)劑，不僅能通過多種機制上調(diào)免疫應答，且能直接殺傷腫瘤和病毒感染的細胞[10]。本研究所獲得的CTL高表達IFN-γ，證明該CTL殺傷(裂解)乳腺癌細胞的功能較強。

針對腫瘤細胞的殺傷實驗證明，AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL對于MUC1陽性的乳腺癌細胞具有較強的殺傷(裂解)作用，但對于該抗原陰性的細胞無殺傷作用。進一步地，在殺傷實驗之前，分別以MUC1抗體和MHC-I類分子抗體封閉乳腺癌細胞之后，CTL對于乳腺癌細胞的殺傷作用被抑制。本研究證明該殺傷作用具有MUC1抗原特異性，即靶向性，且具有MHC-I分子限制性的。CTL的殺傷作用特征明顯。

本研究證明AAV/MUC1感染的DC及其激活的CTL功能較強，且CTL能有效地殺傷MUC1抗原陽性的乳腺癌細胞，殺傷作用具有特異性、靶向性特征。因此本研究結(jié)果為今后的臨床應用奠定了基礎。

[1] McGuckin MA,Walsh MD,Hohn BG,et al.Prognostic significance of MUC1 epithelial mucin expression in breast cancer〔J〕.Hum Pathol,1995,26(4):432-439.

[2] 康美和，熊漢鵬.MUC1基因，CA15-3與肺癌的臨床研究進展〔J〕.江西醫(yī)藥，2008，43(2):166-169.

[3] Soares MM,Mehta V,Finn OJ.Three different vaccines ba- sed on the 140-amino acid MUC1 peptide with seven tandemly repeated tumor-specific epitopes elicit distinct immune effector mechanisms in wild-type versus MUC1-transgenic mice with different potential for tumor rejection〔J〕.J Immunol,2001,166(11):6555-6563.

[4] Ren L,Marquardt MA,Lech JJ.Estrogenic effects of nonylphenol on pS2,ER and MUC1 gene expression in human breast cancer cells-MCF-7〔J〕.Chem Biol Interact,1997,104(1):55-64.

[5] Joshi MD1,Ahmad R,Yin L,et al.MUC1 oncoprotein is a druggable target in human prostate cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther,2009,8(11):3056-3065.

[6] Yu C1,Hu Y,Duan J,et al.Novel aptamer-nanoparticle bi- oconjugates enhances delivery of anticancer drug to MUC1-positive cancer cells in vitro〔J〕.PLoS One,2011,6(9):e24077.

[7] 高 超.CD83 分子的研究進展〔J〕.現(xiàn)代免疫學,2008，28(15):433-436.

[8] 孫 敬，洪杰華，鄭世民.IL-12及其免疫調(diào)節(jié)作用〔J〕.動物醫(yī)學進展,2010，31(2):111-114.

[9] 申 蓉，李麗珍.CD69與免疫功能的調(diào)節(jié)〔J〕.國外醫(yī)學(免疫學分冊),2004，27(1):24-27.

[10] Boehm U1,Klamp T,Groot M et al.Cellular responses to interferon-gamma〔J〕.Annu Rev Immunol,1997,15(15):749-795.

(編輯：吳小紅)

Research on MUC1 Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocytes for Breast Cancer

LIFan，JIJing，SHIPengyan，etal.

ShenzhenImmuclinBiomedIncorporated,Shenzhen,518000

Objective To study recombinant adeno-associated virus with human MUC-1 antigen gene(AAV/MUC1),and observe anti-tumor cell effects of MUC1 antigen-specific cytotoxic T lymphocytes(CTL)stimulated by dendritic cells(DC)infected by AAV/MUC1.Methods High titers of infectious AAV/MUC1 were packaged with molecular biological methods.After the monocytes were infected by AAV/MUC1,the dendritic cells(DC)were induced and generated.To generate CTL the DC were mixed with T lymphocytes.Function of the DC and CTL were detected by flow cytometry.Killing activity of the CTL against the breast cancer cells was tested by MTS.Results AAV/MUC1 was successfully generated with titers at 6×1010copies/ml.The infection rate in monocytes was 84.27%.The killing rates of the CTL were(46.32±0.07)%.The killing activity was MUC1 antigen-specific and MHC class I molecule-restricted.Conclusion MUC1 antigen-specific CTL’s effectiveness in killing breast cancer cell provides a new option in breast cancer treatment.

Dendritic cells;Cytotoxic T lymphocytes;MUC1;Adeno-associated virus;Breast cancer

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金(編號：JSGG20141118110447437)

518000 深圳益世康寧生物科技有限公司(李 帆，姬 靜，史鵬燕，董文娟)；518000 深圳市第二人民醫(yī)院(姬 靜)；518000 深圳北京大學香港科技大學醫(yī)學中心(劉 勇)

劉 勇

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.004

R737.9

A

1001-5930(2017)01-0012-04

2016-08-19

2016-12-15)