王珊珊，李泰雅，谷 舞，許 汝

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122）

北五味子多糖熱水浸提工藝優(yōu)化及體外抗氧化性能研究

王珊珊，李泰雅，谷 舞，許 汝

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113122）

研究熱水浸提北五味子多糖的提取工藝優(yōu)化，采用sevage法進(jìn)行粗多糖脫蛋白處理，并探究北五味子多糖對(duì)羥基自由基的清除能力。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，研究不同提取溫度、料液比和提取時(shí)間對(duì)北五味子多糖提取率的影響。結(jié)果表明，最佳提取工藝為：85℃下按料液比1∶30提取3 h，得到最大提取率為16.13%。獲得的粗多糖溶液，用sevage法重復(fù)處理5次，在最大限度地保證多糖含量的同時(shí)，使蛋白質(zhì)清除率達(dá)92.58%?？寡趸阅苎芯拷Y(jié)果表明：北五味子多糖濃度為10 mg／mL，處理1 h時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)96.61%，清除效果較對(duì)照Vc好。

響應(yīng)面分析；多糖；脫蛋白；羥基自由基

北五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，因其果實(shí)甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，是著名的滋補(bǔ)性中藥。［1］五味子有南北之分，據(jù)《本草綱目》記載“五味子南產(chǎn)者紅，北產(chǎn)者黑，入滋補(bǔ)藥，必用北者為良”。其藥理作用廣泛，可保護(hù)神經(jīng)中樞和肝臟。［2］五味子的主要活性成分有木脂素、多糖、萜類等［3］，早期研究多集中在五味子的脂溶性成分方面［4－7］，但傳統(tǒng)用藥習(xí)慣及許多五味子水提液的藥理活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其水溶性有效成分不能忽視，許多學(xué)者從五味子水提液中分離得到多糖，大量結(jié)果表明，多糖（polysaccharide）有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞和降血脂等生理功能［8－12］。北五味子的多糖類型為兩種均一多糖，多糖Ⅰ包括D－甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖組分；多糖Ⅱ包括D－半乳糖、醛酸、D－甘露糖、D－果糖、鼠李糖等單糖組分，目前，北五味子多糖已成為新藥的發(fā)展方向之一，北五味子作為具有多種藥理作用的傳統(tǒng)中藥材，適合進(jìn)行工廠化提取，并用于食品、保健產(chǎn)品、藥品等領(lǐng)域，現(xiàn)已有利用其藥理作用進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)品的制作［13－18］，這為未來北五味子藥理活性的深入研究［19－20］和發(fā)展提供了更廣闊的空間。本文采用傳統(tǒng)水浸提法對(duì)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)多糖進(jìn)行脫蛋白處理，研究其抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

北五味子干品：購于撫順市成大方圓連鎖藥店。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、95%乙醇、咔唑、半乳糖醛酸、氯仿、正丁醇、鄰二氮菲、過氧化氫、抗壞血酸、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

721G型可見分光光度計(jì)：上海精科儀器有限公司；FW100型高速粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH－6：常州國(guó)華電器有限公司；RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；低速臺(tái)式離心機(jī)TDL－40B：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 多糖及糖醛酸含量的測(cè)定

采用苯酚—硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，在恒溫條件下，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度與吸光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（μg／mL）為X軸、吸光度為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.006 6x－0.009 4，R2＝0.999 2。

測(cè)定糖醛酸含量：采用硫酸—咔唑法對(duì)五味子多糖的糖醛酸進(jìn)行含量測(cè)定，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度與吸光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)濃度（μg／mL）為X軸，吸光度為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.010 6x－0.006 5，R2＝0.999 3。

1.3 粗多糖的提取

圖2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將北五味子干品粉碎，過篩。取北五味子粉末5 g，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分別在不同的熱水浸提條件下進(jìn)行提取。離心、去沉淀，取上清液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮到30 mL，加入95%乙醇，使溶液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，進(jìn)行沉淀，靜置5 h后，將沉淀物離心干燥，即得北五味子粗多糖，多糖提取率為：

多糖提取率／%＝（多糖質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)×換算因子）／原料質(zhì)量×100。

1.4 換算因子測(cè)定

精確稱取60℃干燥恒重的實(shí)驗(yàn)室精制北五味子多糖10 mg，加水定容到100 mL容量瓶中，搖勻，作為多糖儲(chǔ)備液。精確量取多糖儲(chǔ)備液0.2 mL，加水至1 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測(cè)其吸光度。計(jì)算換算因子：

f＝W／CD

式中：W為多糖質(zhì)量，g；C為多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg／mL；D為多糖的稀釋因子。測(cè)得f＝1.75。

1.5 北五味子多糖脫蛋白優(yōu)化

采用sevage法進(jìn)行脫蛋白，將1.3步驟中提取的粗多糖配置成2%的粗多糖溶液100 mL，取30 mL，先測(cè)其蛋白質(zhì)及多糖濃度，再加入其體積的1／3的氯仿正丁醇混合液（氯仿∶正丁醇＝4∶1），震搖25 min，離心10 min，取上清測(cè)其蛋白質(zhì)及多糖濃度，重復(fù)上述步驟6次。

1.6 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1.6.1 配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

取10 mg牛血清白蛋白，用蒸餾水定容到50 mL，冷藏備用。

1.6.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取100 mg考馬斯亮藍(lán)G－250溶于50 mL 90%乙醇中，再加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水定容至1 000 mL。

在恒溫條件下，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，并用蒸餾水定容至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL，混勻后，放置2 min，在595 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸、吸光度為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.010 1x－0.023 1，R2＝0.998 2。

圖3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.7 北五味子多糖對(duì)羥基由基抗氧化性能測(cè)定

按照1.3和1.6步驟提取去蛋白等雜質(zhì)得北五味子多糖，配置不同濃度的待測(cè)樣品。采用鄰二氮菲－金屬鐵離子－H2O2體系：鄰二氮菲Fe2＋反應(yīng)生成Fe2＋－鄰二氮菲配合物，該配合物在536 nm波長(zhǎng)處有最大吸收；通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，而當(dāng)·OH氧化Fe2＋－鄰二氮菲成Fe3＋－鄰二氮菲時(shí)，536 nm波長(zhǎng)處最大吸收消失或減弱。當(dāng)反應(yīng)體系中存在·OH清除劑時(shí)，此氧化過程受到抑制，536 nm處最大吸收降低或不明顯，故可通過536 nm處吸光度比較抗氧化劑清除·OH的作用。

以Vc為參照物，取1.5 mmol／L鄰二氮菲溶液1.0 mL，加0.2 moL／L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）2.0 mL，充分混勻后，加1.5 mmol／L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，加入樣品溶液1.0 mL，每加一管立即混勻，加0.01%H2O2溶液1.0 mL。整個(gè)反應(yīng)體系共6 mL。反應(yīng)在37℃恒溫水浴中進(jìn)行，反應(yīng)1 h后，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。損傷組（A1）中用1.0 mL去離子水代替樣品溶液；未損傷組（A0）中用2.0 mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率：

清除率／%＝（AX－A1）／（A0－A1）×100

式中：AX為樣品組吸光度，A0為未損傷組吸光度，A1為損傷組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取6份北五味子粉末，每份5 g分別置于250 mL三角瓶中，按料液比1∶20加入100 mL蒸餾水，在90℃下分別水浴1、2、3、4、5、6 h，離心去沉淀，測(cè)定多糖含量。

由圖4可看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率先迅速增高后突然降低，之后保持平穩(wěn)，超過4 h后再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖的提取率幾乎沒有影響，在分析響應(yīng)面時(shí)可不考慮后兩個(gè)水平。當(dāng)水浴3 h時(shí)，提取率最高，為9.24%。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取6份北五味子粉末，每份5 g分別置于250 mL三角瓶中，按料液比1∶20加入100 mL蒸餾水，在50、60、70、80、90、100℃下水浴3 h。離心，去沉淀，測(cè)定多糖含量。

由圖5可以看出，在60～70℃時(shí)，多糖的提取率增長(zhǎng)并不明顯；當(dāng)溫度由70℃提高至80℃時(shí)，提取率迅速提高；80℃后再提高溫度，提取率又迅速下降。這種突增突降趨勢(shì)的出現(xiàn)可能是因?yàn)闇囟葘?duì)提取率影響較大。由圖可知最適提取溫度為80℃，在該溫度下提取率為14.43%。

圖5 提取溫度對(duì)提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取6份北五味子粉末，每份5 g分別置于250 mL三角瓶中，分別按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g／mL的體積加入蒸餾水，90℃下水浴3 h，離心去沉淀，測(cè)定多糖含量。

由圖6可以看出，隨著料液比的降低，提取率先增高后突然降低，但整體的提取率變化幅度與考察時(shí)間、溫度時(shí)不同，增幅較平緩，由此推測(cè)，料液比可能對(duì)多糖提取率的影響不大，由圖可知在料液比1∶30時(shí)提取率最高，為13.13%。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化北五味子多糖提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和CentraL Composite De-sign（CCD）設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以多糖提取率為響應(yīng)值，提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素，建立響應(yīng)值與影響因素間的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化北五味子多糖的最佳提取工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

圖6 料液比對(duì)提取率的影響

表1 多糖響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

利用Design－Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。從時(shí)間、溫度、料液比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得以

北五味子多糖提取率為響應(yīng)值的回歸方程：

Y＝16．00＋0．63A＋1．06B－0．29C－2．36AB－1．07AC＋0．84BC－1．42A2－1．04B2－2．05C2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

回歸模型方差分析結(jié)果表明（表3）：該模型回歸極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），回歸模型的決定系數(shù)R2＝0.989 2，調(diào)整系數(shù)0.995 8，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，表明該模型高度顯著，可以用于北五味子多糖提取理論預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響程度依次為：提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比；交互項(xiàng)AB、AC、BC極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多糖提取率有極顯著影響（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析及最佳提取工藝研究

北五味子多糖提取優(yōu)化的響應(yīng)面及其等高線見圖7。圖7列出了自變量中交互作用極顯著（P＜0.01）的三項(xiàng)AB、AC和BC。3組圖形直觀地反應(yīng)了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，在響應(yīng)面圖中，曲面越陡峭，則表示該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。等高線圖與響應(yīng)面圖相對(duì)應(yīng)，越接近等高線圖的中心，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值就越大，且等高線圖形狀接近橢圓形，表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。比較3組圖形可知，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)北五味子多糖提取率影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡峭；而料液比次之，曲線較為平緩。同時(shí)，3組圖形的交互作用都較明顯，等高線趨于橢圓形。

圖7a表示提取溫度和提取時(shí)間兩者交互作用對(duì)北五味子多糖提取率的影響?？梢钥闯鰞烧呓换プ饔脤?duì)提取率影響顯著，從圖7a可以看出，當(dāng)提取時(shí)間保持不變時(shí)，提取溫度越高越利于多糖的提取，這是因?yàn)闇囟仍礁?，分子熱運(yùn)動(dòng)越快，更易提取的進(jìn)行，提取溫度對(duì)提取率影響顯著；當(dāng)提取溫度保持不變時(shí)，多糖提取率隨提取時(shí)間呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

圖7b為提取時(shí)間和料液比及兩者交互作用對(duì)多糖提取率的影響。當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，隨著料液比的增加，多糖提取率先增大后減??；當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，北五味子多糖提取率先增大后減小。當(dāng)二者同時(shí)增大時(shí)有利于提取率的提高。

圖7c為提取溫度和料液比的交互作用對(duì)北五味子多糖提取率的影響。當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著提取溫度的增大，北五味子多糖提取率逐漸增大；當(dāng)提取溫度不變時(shí)，隨著料液比的增加，多糖提取率先增大后減小。兩者交互作用顯著，提取溫度和料液比均處于高水平時(shí)，提取率較高。

運(yùn)用Design Expert 8.0.6的響應(yīng)面分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到北五味子多糖的最優(yōu)提取條件：提取時(shí)間為2.7 h、提取溫度84.9℃、料液比為1∶30.37，該條件下提取率預(yù)測(cè)可達(dá)到最大值16.32%。為方便實(shí)際操作，將最優(yōu)提取條件簡(jiǎn)化為：提取時(shí)間3 h、提取溫度85℃、料液比1∶30，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到北五味子多糖提取率的平均值為16.13%，與預(yù)測(cè)值接近，說明此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的多糖熱水浸提提取工藝在實(shí)踐中可行。

所得粗多糖理化指標(biāo)見表4。由表4可看出，粗多糖中總糖含量較高，含有少量糖醛酸與蛋白質(zhì)雜質(zhì)。含糖醛酸是由于粗多糖組成多樣，而蛋白質(zhì)則是用上述方法從植物中提取所產(chǎn)生的雜質(zhì)。

表4 粗多糖產(chǎn)品理化指標(biāo)

圖7 各因素交互效應(yīng)對(duì)北五味子多糖提取率影響的曲面圖

2.3 北五味子多糖脫蛋白優(yōu)化分析

從圖8中可以看出第一次脫蛋白效果不是很明顯，但從第二次開始蛋白質(zhì)的含量迅速減少，到第六次時(shí)溶液中幾乎不含蛋白質(zhì)；從圖9中可以看出第一次多糖幾乎沒有損失而第二次之后多糖開始出現(xiàn)損失，但幅度不大，到第六次時(shí)多糖損失達(dá)到70%以上。綜合分析，sevage法條件溫和、處理容易、除蛋白效果明顯，對(duì)北五味子粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理5次既能將大部分蛋白雜質(zhì)除去，又在一定程度上保護(hù)了多糖的得率。不采用等電點(diǎn)法去除蛋白質(zhì)是由于對(duì)北五味子多糖中蛋白質(zhì)組成成分尚不清楚，無法選擇沉淀?xiàng)l件，而sevage法在較多文獻(xiàn)［3，19］中被采用。

圖8 sevage法蛋白脫除效果

圖9 sevage法對(duì)多糖損失的影響

2.4 北五味子多糖對(duì)羥基自由基的抗氧化性能分析

從圖10中可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，所有的北五味子多糖樣品都表現(xiàn)出明顯的羥基自由基清除能力，并隨著北五味子多糖濃度的增加，自由基清除率提高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在多糖濃度為10 mg／mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)到96.61%。隨著對(duì)照品Vc濃度的增加，清除率提高，但并不是很明顯，并且Vc在同樣濃度10 mg／mL時(shí)的清除率只有25.9%。綜上分析：北五味子多糖具有較好的清除能力，并且清除能力隨著濃度的增大而提高。

圖10 北五味子多糖對(duì)羥基自由基的清除能力

3 結(jié)論

通過對(duì)水浸提北五味子多糖的單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，考察提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)提取率的影響，得出提取溫度影響最大，其次為提取時(shí)間和料液比。最佳提取工藝為：料液比為1∶30，在85℃下提取3 h，得到提取率為16.13%；sevage法處理5次粗多糖溶液，蛋白質(zhì)清除率達(dá)92.58%；當(dāng)北五味子多糖濃度為10 mg／mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)96.61%，并且效果遠(yuǎn)好于Vc。

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［19］郭冷秋，張鵬，黃莉莉，等.五味子藥理作用研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34（4）：51－53.

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Optimization of hot water extraction process of schisandrae chinensis polysaccharide and its in vitro antioxidation property study

WANG Shan－shan，LI Tai－ya，GU Wu，XU Ru
（School of Life Engineering，Shenyang Institute of Technology，F(xiàn)ushun Liaoning 113122）

The hot water extraction of schisandrae chinensis polysaccharide under different conditions was studied.The crude polysaccharide was deproteinized by sevage method.The scavenging ability of schisandrae chinensis polysaccharide against hydroxyl free radical was researched.The effect of different extraction temperature，solid－liquid ratio and extraction time on extraction yield was researched by single factor and response surface analysis.The results showed that the maximum extraction yield was 16.13%with solid－liquid ratio of 1∶30 under 85℃ for 3 h.The crude polysaccharide solution was treated by sevage method repeatedly for 5 times，the clearance rate against protein could reach 92.58%，while keeping the polysaccharide in the maximum limit.The result of antioxidant performances showed that as the concentration of fructus schisandrae chinensis polysaccharide was 10 mg／mL and the processing time was 1 h，the clearance rate against hydroxyl free radical was 96.61%，which was much better than that of Vc.

response surface analysis；polysaccharide；deproteinize；hydroxyl radical

R 284.2

A

1007－7561（2017）01－0064－06

2016－07－17

省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201613201000017）.

王珊珊，1984年出生，女，講師.