孫 莉，陳 琳,馬繼紅

妊娠早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者妊娠組織增殖與凋亡的研究

孫 莉，陳 琳,馬繼紅

目的 分析妊娠早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortions, RSA)患者妊娠組織(絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞)增殖與凋亡的情況，并探討其可能致病機(jī)制。方法 選取我院2014年1月—2015年12月婦產(chǎn)科收治的妊娠12周內(nèi)的RSA患者60例(RSA組)，藥物流產(chǎn)者60例(藥物流產(chǎn)組)，人工流產(chǎn)者60例(人工流產(chǎn)組)。采用DNA缺口原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)3組胎盤絨毛組織和蛻膜組織細(xì)胞凋亡情況，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)3組胎盤絨毛和蛻膜組織中胎盤生長(zhǎng)因子(placenta growth factor， PLGF)和凋亡相關(guān)因子Caspase-3的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析RSA組中二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 RSA組胎盤絨毛及蛻膜組織凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)均明顯高于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中PLGF表達(dá)水平均顯著低于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組(P<0.01)，Caspase-3表達(dá)水平均顯著高于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，RSA組胎盤絨毛及蛻膜組織中Caspase-3與PLGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.891,P=0.004;r=-0.927，P=0.001)。結(jié)論 妊娠早期RSA的發(fā)生可能與絨毛組織和蛻膜組織中，PLGF的表達(dá)不足導(dǎo)致絨毛及蛻膜細(xì)胞增殖障礙，以及Caspase-3表達(dá)增加導(dǎo)致絨毛及蛻膜細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。

流產(chǎn),習(xí)慣性；妊娠初期；絨毛；蛻膜；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortions, RSA)是指與同一性伴侶發(fā)生2次及其以上的自然流產(chǎn)[1-4]，其中早期流產(chǎn)占80%以上。導(dǎo)致RSA的原因除常見的遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道解剖異常、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)、感染及環(huán)境因素外[5]，仍有40%～60%的RSA原因不明[6]，故對(duì)妊娠早期RSA的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討有著重要的臨床意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織凋亡和增殖的平衡狀態(tài)對(duì)維持正常妊娠至關(guān)重要，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜組織中凋亡增多及增殖不足均可導(dǎo)致病理性妊娠甚至自然流產(chǎn)的發(fā)生[7-8]。血管生成是創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等多種生理和病理現(xiàn)象均會(huì)涉及的重要過程[9]。胎盤生長(zhǎng)因子(placenta growth factor， PLGF)主要由滋養(yǎng)細(xì)胞分泌，是血管生長(zhǎng)因子及抗血管生成因子的重要代表物質(zhì)[10-13]。細(xì)胞凋亡是正常體細(xì)胞維持穩(wěn)定的自我保護(hù)機(jī)制，Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中的一種活化酶，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。本研究通過免疫組織化學(xué)染色(組化)檢測(cè)妊娠早期RSA患者胎盤絨毛及蛻膜細(xì)胞中PLGF與Caspase-3的表達(dá)水平，以探討妊娠早期RSA患者胎盤絨毛及蛻膜細(xì)胞增殖及凋亡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在15～40歲，符合美國婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)2010年關(guān)于RSA的診斷標(biāo)準(zhǔn)；未接受其他治療；臨床資料完整。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并子宮肌瘤及其他腫瘤疾?。缓喜?yán)重呼吸、循環(huán)系統(tǒng)疾病[14]?；颊呔栽竻⒓硬⒑炇鹬橥鈺冶狙芯拷?jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 對(duì)象與分組 隨機(jī)選取我院婦產(chǎn)科2014年1月—2015年12月收治并確診的妊娠12周內(nèi)RSA患者60例(RSA組)，藥物流產(chǎn)者60例(藥物流產(chǎn)組)，人工流產(chǎn)者60例(人工流產(chǎn)組)作為研究對(duì)象。3組基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 3組流產(chǎn)患者一般資料比較±s)

1.3 研究方法 收集所有患者胎盤絨毛及蛻膜組織，將獲得的組織用無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗，除去血凝塊后用10%甲醛固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚4 μm，常規(guī)HE染色，觀察絨毛和蛻膜形態(tài)。將載玻片置于濃度為0.2%～0.5%的洗潔精中浸泡1 h后，沖洗風(fēng)干。

采用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)對(duì)絨毛及蛻膜組織中細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)定陽性和陰性對(duì)照。試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。光鏡下見細(xì)胞核有棕黃色顆粒計(jì)為陽性，即為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)高倍視野(200倍)計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

采用免疫組化SP法檢測(cè)胎盤絨毛及蛻膜組織中Caspase-3和PLGF含量[15]。Caspase-3兔抗人多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PLGF兔抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。按常規(guī)程序操作，一抗工作液濃度Caspase-3為1︰200，PLGF為1︰100，DAB顯色。陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液代替一抗。Caspase-3陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有黃色顆粒，PLGF陽性表達(dá)為胞質(zhì)中有棕黃色顆粒，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍視野(200倍)，用Motic Med數(shù)碼醫(yī)學(xué)影像軟件測(cè)定每個(gè)視野陽性染色部位的平均光密度值，代表絨毛及蛻膜組織中PLGF、Caspase-3表達(dá)水平，光密度值越大表示其表達(dá)越強(qiáng)[16]。

1.4 觀察指標(biāo) 比較3組患者胎盤絨毛及蛻膜組織AI值和PLGF、Caspase-3的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析RSA患者中PLGF與Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 AI值比較 TUNEL檢測(cè)顯示，RSA組胎盤絨毛及蛻膜組織AI值均明顯高于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組胎盤絨毛及蛻膜組織AI值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組流產(chǎn)患者胎盤絨毛 及蛻膜組織凋亡指數(shù)比較±s，%)

注：RSA組比較，bP<0.01

2.2 PLGF表達(dá) PLGF主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中PLGF表達(dá)水平均顯著低于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組(P<0.01)；藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中PLGF表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.3 Caspase-3表達(dá) Caspase-3主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)和蛻膜細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)中。RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中Caspase-3表達(dá)水平均顯著高于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組(P<0.05)；藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中Caspase-3表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 3組流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織 和蛻膜組織中PLGF表達(dá)水平比較

注：與RSA組比較，bP<0.01

表4 3組流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織 和蛻膜組織中Caspase-3表達(dá)水平比較

注：與RSA組比較，aP<0.05

2.4 相關(guān)性分析 RSA組胎盤絨毛組織和蛻膜組織中Caspase-3與PLGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.891,P=0.004;r=-0.927，P=0.001)。

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)關(guān)于細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和凋亡決定著組織細(xì)胞的數(shù)量。在妊娠生理過程中妊娠組織凋亡和增殖的平衡至關(guān)重要，妊娠組織凋亡或增殖異常會(huì)影響胎盤生長(zhǎng)、成熟及功能，引起病理性妊娠甚至自然流產(chǎn)的發(fā)生[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛組織中可見特征性的細(xì)胞凋亡，且較正常妊娠患者絨毛組織中顯著增加，說明滋養(yǎng)細(xì)胞過度凋亡可能是RSA發(fā)病原因之一[18]。目前在細(xì)胞凋亡研究中廣泛采用TUNEL染色法，其可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞。本研究即采用TUNEL染色法檢測(cè)妊娠組織的凋亡情況。

Caspase家族是一系列含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。Caspase-3處于Caspase凋亡傳導(dǎo)通路的下游，其高表達(dá)可啟動(dòng)線粒體/細(xì)胞色素c及Fas介導(dǎo)的凋亡通路，一旦活化將促使胎盤絨毛細(xì)胞大量凋亡，阻礙孕卵的發(fā)育，流產(chǎn)將不可避免[19]。血管發(fā)生和血管化是妊娠早期胚胎發(fā)育和胎盤形成的基礎(chǔ)，此過程主要由血管生成因子調(diào)控。血管生成因子調(diào)節(jié)異常會(huì)影響胚泡發(fā)育、受精卵著床、滋養(yǎng)細(xì)胞侵入、胎盤血管生成及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等一系列妊娠生理過程[20-21]。PLGF屬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員，作為參與血管發(fā)生和血管通透性調(diào)節(jié)的重要因子，其參與生殖過程各階段，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、增加血管通透性、促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與分化等多種生物學(xué)作用[22]。有研究顯示，PLGF可促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤活性及胎盤血管網(wǎng)絡(luò)形成，有助于正常胎盤的形成，并維持妊娠生理過程[23]。

本研究結(jié)果顯示，RSA組胎盤絨毛組織及蛻膜組織中Caspase-3水平顯著高于藥物流產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組，提示Caspase-3可能與RSA的發(fā)生有關(guān)。因?yàn)镃aspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵“誘導(dǎo)者”和“執(zhí)行者”，其高表達(dá)可使大量細(xì)胞凋亡，阻礙絨毛生長(zhǎng)，極有可能是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的重要原因之一。本研究結(jié)果還顯示，RSA組胎盤絨毛組織及蛻膜組織中PLGF表達(dá)水平顯著低于其他兩組，提示PLGF可能與RSA的發(fā)生有關(guān)，其在胎盤組織中的異常表達(dá)可能參與了早期胚胎停育的發(fā)生。本研究相關(guān)性分析顯示，RSA組胎盤絨毛組織及蛻膜組織中Caspase-3與PLGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示凋亡因子與PLGF兩因素間存在潛在相互作用。

綜上所述，RSA的發(fā)生可能與Caspase-3表達(dá)增加導(dǎo)致胎盤絨毛及蛻膜細(xì)胞過度凋亡，以及PLGF表達(dá)不足導(dǎo)致胎盤絨毛及蛻膜細(xì)胞增殖障礙有關(guān)，兩因素綜合作用使得維持絨毛正常發(fā)育的平衡狀態(tài)遭受破壞。本研究因病例采集范圍及時(shí)間有限，病例數(shù)較少，有待進(jìn)一步大樣本的深入研究。

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A Study on Proliferation and Apoptosis of Pregnancy Tissues in Early Recurrent Spontaneous Abortion Patients

SUN Li， CHEN Lin， MA Ji-hong

(Department of Gynecology and Obstetrics, Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082， China)

Objective To analyze proliferation and apoptosis conditions of pregnancy tissues (villi nutrient and decidua cells) in early recurrent spontaneous abortion (RSA) patients and to investigate the possible pathogenic mechanisms. Methods A total of 60 early RSA patients within 12 weeks of pregnancy (group A), medical abortion of 60 patients (group B) and 60 patients with induced abortion (group C) during January 2014 and December 2015 were recruited in this study. In three groups, apoptosis conditions of villi nutrient cells and decidual cells were detected by using DNA in situ end labeling method, and then expressions of placenta growth factor (PLGF) and apoptosis related factors Caspase-3 were detected by using immunohistochemical staining method. The correlation between PLGF and Caspase-3 expressions was analyzed in group A. Results In group A, values of apoptosis index (AI) of villi and decidual cells were significantly higher (P<0.01); expressions of Caspase 3 and PLGF were significant lower (P<0.01), and Caspase-3 expressions in villi and decidua cells were significantly higher than those in group B and C (P<0.05). Correlation analysis showed that Caspase-3 and PLGF expressions were negative correlation in group A (r=-0.891,P=0.004;r=-0.927,P=0.001). Conclusion The pathogenesy of early RSA may be related to proliferation disorder of villi and decidua cells induced by PLGF poor expression and excessive apoptosis of villi and decidua cells induced by increasing Caspase-3 expression.

Abortion, habitual; Pregnancy trimester, first； Villi； Decidua; Cell proliferation; Apoptosis

河北省計(jì)劃生育委員會(huì)2011年科研計(jì)劃課題(2011-A21)

050082 石家莊,解放軍白求恩國際和平醫(yī)院產(chǎn)科

R714.21

A

1002-3429(2017)01-0094-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.01.031

2016-08-20 修回時(shí)間：2016-10-30)