上官同強(qiáng) 韓風(fēng)雨 于秀玲* 齊 平 李洪澤

1.內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.內(nèi)蒙古博奧現(xiàn)代蒙中藥技術(shù)研究有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.內(nèi)蒙古天奇藥業(yè)集團(tuán)有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

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HPLC法同時(shí)測(cè)定血府逐瘀水蜜丸中3個(gè)易熱解成分的含量

上官同強(qiáng)1韓風(fēng)雨3于秀玲1*齊 平2李洪澤2

1.內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.內(nèi)蒙古博奧現(xiàn)代蒙中藥技術(shù)研究有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.內(nèi)蒙古天奇藥業(yè)集團(tuán)有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

目的：建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定血府逐瘀水蜜丸中梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯三種指標(biāo)成分含量的方法。方法：采用DIKMA Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為流動(dòng)相A(甲醇 ∶乙腈=80 ∶20)，流動(dòng)相B：0.5%磷酸水溶液，體積流量1.0mL/min，梯度洗脫0～8min，98%B；8～20min,98%→75%B；20～21min，75%→40%B；21～40min，40%B；分段波長(zhǎng)檢測(cè)：0～8min為210nm、8～25min為 403nm、25～40min為280nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：各成分色譜峰之間有良好的分離度，梓醇進(jìn)樣量在0.199～1.989μg(r2=0.9995)，羥基紅花黃色素A進(jìn)樣量在0.0392～0.392μg(r2=0.9991)，藁本內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.0204～0.204μg(r2=0.9992)與峰面積呈良好線性關(guān)系；平均回收率在99.21%～100.92%，RSD均小于2.0%；樣品中平均含量為：梓醇0.07%、羥基紅花黃色素A 0.09%、藁本內(nèi)酯 0.05%。結(jié)論：該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以真實(shí)反映血府逐瘀水蜜丸在干燥過(guò)程中的質(zhì)量變化。

血府逐瘀水蜜丸；高效液相色譜法；梓醇；羥基紅花黃色素A；藁本內(nèi)酯

血府逐瘀丸由血府逐瘀湯劑改成，血府逐瘀丸主要由柴胡、當(dāng)歸、生地、桃仁、紅花、赤芍、麩炒枳殼、桔梗、牛膝、川芎、甘草11味藥組成。是活血化瘀治則的基本方劑之一，具有活血化瘀、理氣止痛的功效,抗炎消腫，調(diào)節(jié)人體免疫功能，行氣活血化瘀，改善血液循環(huán)，促進(jìn)周?chē)⒀h(huán)暢通，解除組織瘀血，缺血、促進(jìn)滲出物吸收，恢復(fù)視力等作用[1]。方中桃仁、紅花活血化瘀，為君藥；赤芍、當(dāng)歸和川芎能夠增強(qiáng)主藥的功效，為臣藥。

近年來(lái)，水蜜丸較大蜜丸具有服用便宜的優(yōu)勢(shì)，在市場(chǎng)中越來(lái)越受到人們的認(rèn)可?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)藥典2015版標(biāo)準(zhǔn)[2]，只有大蜜丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并無(wú)水蜜丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。而水蜜丸的生產(chǎn)過(guò)程中較大蜜丸增加了干燥過(guò)程，可能導(dǎo)致制劑中有效成分損失。鑒于此，研究以血府逐瘀水蜜丸濕丸為研究材料，利用常溫晾干，60℃烘干，70℃烘干，80℃烘干四種干燥方式，通過(guò)測(cè)定羥基紅花黃色素A[3-5]、梓醇[6-7]、藁本內(nèi)酯[8-9]成分含量，并作出綜合評(píng)價(jià)，擬篩選出最適合血府逐瘀水蜜丸干燥的方法，為血府逐瘀水蜜丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本Shimadzu LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)(包括SIL-20AC Autosampler自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A3R Degassing Unit 脫氣單元，LC-20AT Solvent Delivery Unit 溶液輸送單元，CTO-20AC Column Oven柱溫箱，SPD-M20A Photodiode Array Detector高靈敏度二級(jí)管陣列檢測(cè)器，LabSolutions LC Workstation Ver.5 Multi LC-PDA (中文版)數(shù)據(jù)工作站，CBM-20Alite System Controller 網(wǎng)絡(luò)化系統(tǒng)控制器)；MS105DU電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒公司)；BDGC-EH-S-9型電熱烘箱(河南勃達(dá)微波裝備股份有限公司)，YUJ-16A制丸機(jī)(天水華圓制藥設(shè)備科技有限責(zé)任公司)，CHJ-150槽混機(jī)(天水華圓制藥設(shè)備科技有限責(zé)任公司)。1.2 材料 羥基紅花黃色素A(批號(hào)：111637-201308)、梓醇(批號(hào)：110808-201210)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)：111737-201507)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。血府逐瘀藥粉(批號(hào)：20160301)、煉蜜(批號(hào)：20160311)來(lái)源于內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司。甲醇(批號(hào)：876002)、乙腈(批號(hào)：876001)為VBS公司產(chǎn)品，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 血府逐瘀水蜜丸的制備 取血府逐瘀藥粉，過(guò)120目，加入適量煉蜜及水，合坨，制丸，拋光，選丸，按以下條件進(jìn)行干燥備用，詳見(jiàn)表1。常溫干燥：取200g濕丸，平鋪篩網(wǎng)上，置于室內(nèi)通風(fēng)干燥處陰干，至樣品水分低于8.0%。加熱烘干：取200g濕丸三份，平鋪篩網(wǎng)上，置于電熱恒溫烘箱中，分別以60℃、70℃、80℃干燥至樣品水分低于8.0%。

表1 干燥樣品信息

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取羥基紅花黃色素A、梓醇、藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別置于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取單個(gè)組分對(duì)照品溶液，用50%甲醇稀釋制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，其中含羥基紅花黃色素A 40μg/mL，梓醇 200μg/mL，藁本內(nèi)酯20μg/mL ；取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液稀釋2倍作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取1.0g精密稱(chēng)定，精密加入50%甲醇10mL，稱(chēng)重，超聲40min取出，放涼，補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取除紅花、川芎、當(dāng)歸、地黃外的各味藥材，按水蜜丸制備方法及供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。2.3 色譜條件色譜柱 DIKMA Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A：甲醇：乙腈=80∶20；流動(dòng)相B：0.1%磷酸水溶液，體積流量1mL/min，梯度洗脫0～8min，98%B；8～20min,98%→75%B；20～21min，75%→40%B；21～40min，40%B；分段變波長(zhǎng)測(cè)定：0～8min為210nm,8～25min為403nm，25～40min為280nm[10-12]；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL，進(jìn)樣器溫度4℃。

2.4 方法學(xué)考察2.4.1 專(zhuān)屬性考察 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按照“2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品中各待測(cè)成分色譜峰的分離度均大于1.5，其他雜質(zhì)峰與陰性溶液對(duì)待測(cè)成分均無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0mL，分別置于10mL量瓶中，用流動(dòng)相A定容，搖勻，與儲(chǔ)備液一起作為系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：梓醇Y=5.0275X-4.7431，r2=0.9995，線性范圍19.89～198.9μg；羥基紅花黃色素AY=7.3722X+3.3089，r2=0.9991，線性范圍3.92～39.2μg；藁本內(nèi)酯Y=12.6X+15.495，r2=0.9992，線性范圍2.04～20.4μg。見(jiàn)圖2。

2.4.3 精密度考察 精密吸取線性關(guān)系考察項(xiàng)下中間質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件注入液相色譜，記錄色譜圖，測(cè)定各待測(cè)物質(zhì)峰面積值。結(jié)果梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.74%、1.48%、1.33%，表明精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別與0、2、4、6、8、12h按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定各待測(cè)成分峰面積。結(jié)果供試品溶液在12h內(nèi)色譜峰面積無(wú)明顯變化，梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯的RSD分別為1.32%、1.95%、1.88%，表明供試品溶液在制備后12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定各物質(zhì)的量。結(jié)果梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.07%、0.09%、0.051%，RSD分別為1.37%、1.51%、1.91%。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取2.4.5項(xiàng)下的樣品6份，每份約1.0g，精密稱(chēng)定，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品，照上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果梓醇、羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯的平均回收率為100.44%、99.21%、100.92%。2.5 樣品測(cè)定 取血府逐瘀藥粉，過(guò)120目，加入適量煉蜜及水，合坨，制丸。分別置于80℃、70℃、60℃、常溫條件下干燥。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品，照上述色譜條件注入液相色譜，記錄色譜圖，與常溫條件下樣品比較，計(jì)算相對(duì)含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

地黃中梓醇的檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，紅花中羥基紅花黃色素A檢測(cè)波長(zhǎng)為403nm，川芎和當(dāng)歸中的藁本內(nèi)酯的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，各成分之間紫外吸收情況差異較大，為提高分析方法的靈敏度，采用單標(biāo)檢測(cè)確定各成分保留時(shí)間，采用分時(shí)段波長(zhǎng)對(duì)三種成分進(jìn)行測(cè)定，最終各成分均在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別檢測(cè)，響應(yīng)信號(hào)好，其他成分干擾小，提高了方法的專(zhuān)屬性。

實(shí)驗(yàn)中的三種成分熱穩(wěn)定性均不好，選用超聲提取。且血府逐瘀水蜜丸化學(xué)成分非常復(fù)雜，各成分極性不一致，實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈與水相不同比例的提取效果，以及超聲時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇：0.5%磷酸水溶液=1∶1，超聲40min時(shí)，三種成分組分提取基本完全。故本實(shí)驗(yàn)的提取方法為以甲醇：0.5%磷酸水溶液=1∶1為溶劑，超聲40min。對(duì)3種指標(biāo)成分進(jìn)行HPLC分析時(shí)，對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)組成比例進(jìn)行篩選，比較了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%甲酸構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)，分別進(jìn)行等度與梯度洗脫。結(jié)果表明，甲醇-乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫的分析效果較好。

血府逐瘀水蜜丸與已有國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)的血府逐瘀大蜜丸相比，制劑工藝中增加了加熱干燥過(guò)程，而且中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分復(fù)雜。為更有效保證藥品質(zhì)量，全面提升藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定血府逐瘀水蜜丸中梓醇、羥基紅花黃色素A及藁本內(nèi)酯三種熱不穩(wěn)定性成分的含量。該方法重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠綜合評(píng)價(jià)血府逐瘀水蜜丸在干燥后的內(nèi)在質(zhì)量，在藥典標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上提高了血府逐瘀丸的質(zhì)量控制水平，可用于血府逐瘀水蜜丸的制劑工藝研究中干燥溫度的考察及控制中間體的質(zhì)量，并為血府逐瘀水蜜丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

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(編輯：穆麗華)

Simultaneous Determination of Three Labile Pyrolysis Components in Xuefuzhuyu Water-honeyed Pill by HPLC

Shangguan Tongqiang1HAN Fengyu3YU Xiuling1*QI Ping2LI Hongze2

1.Inner Mongolia Tianqi Han&Mongolia Pharmaceutical Co, Chifeng 024000,China； 2.Inner MongoliaInner Mongolia Boao Modern Mongolian-Chinese Medicine Technology Research co, Chifeng 024000,China； 3.Inner Mongolia TianqiPharmaceutical industry investment Co, Chifeng 024000,China

Objective To establish an HPLC method for the dete1rmination of catalpol、hydroxysafflor yellow A、ligustilide in Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill.Methods Three target components were separated byDIKMA Diamonsil C18(2) column (250 mm × 4.6 mm, 5.0 μm) with a gradient mobile phase consisting of methanol-acetonitrile (80 ∶20, A)-0.5% phosphoric acid (B) (0～8.0 min, 98% B; 8.0～20.0 min, 98%→75% B; 20.0～21.0 min,75%→40% B;21.0～40.0 min,40% B)at a flow rate of 1.0 mL/min,and simultaneously quantificated by variable detection wavelength: 0～8.0 min, 210 nm; 8.0～25.0 min, 403 nm; 25.0～40.0 min, 280 nm.The column temperature was 30℃and injection volume was 10 μL.Results The calibration curve of catalpol、hydroxysafflor yellow A and ligustilide were linear within 0.199～1.989μg(r2=0.9995), 0.0392～0.392μg(r2=0.9991) and 0.0204～0.204μg (r2=0.9992).The average recovery rates were 99.21%～100.92%,RSDwas all below 2.0%.The average contents of catalpol、hydroxysafflor yellow A and ligustilide in Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill were 0.07%, 0.09% and 0.051%.Conclusion The method is simple, accurate and reliable for the quality control of Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill.

Xuefu Zhuyu Water-honeyed Pill; HPLC; Catalpol ;Hydroxysafflor yellow A; Ligustilide

2016-10-21

上官同強(qiáng)(1978-)，男，漢族，本科，主要從事中藥制劑、化藥合成等領(lǐng)域的應(yīng)用研究。E-mail:751067671@qq.com

于秀玲(1984-)，女，漢族，碩士，主要從事生物技術(shù)在藥品、食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究。E-mail:343981667@qq.com

R914.1

A

1007-8517(2017)01-0012-04