郭婕+李季平

牛膝為莧科牛膝屬植物牛膝的干燥根，產(chǎn)于河南、山東、江蘇等地，但以河南沁陽、武陟一帶所產(chǎn)“懷牛膝”療效好、產(chǎn)量大，是聞名國內(nèi)外的“四大懷藥”之一。它應(yīng)用歷史悠久，始載《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。本品味苦、酸，平。歸肝、腎經(jīng)；具有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功效。

懷牛膝含有甾體類、糖類、氨基酸、生物堿類、香豆素類等化合物，并含有鉀鹽及多種微量元素。多糖在中藥材中分布非常普遍，牛膝多糖具有提高肌體免疫功能、一直腫瘤生長及升高白細胞等多種生理活性，具有一定的抗氧化作用。近年來，隨著研究方法和技術(shù)的不斷提高，發(fā)現(xiàn)了新的生理作用，使懷牛膝的研究進入了新的階段。本文對懷牛膝的四種不同溶劑浸提液進行多糖含量測定，同時進行抑菌活性研究，探究懷牛膝提取物對不同菌株的抑菌作用。

一、材料與方法

（一）實驗材料與儀器

懷牛膝，購買于周口市同和堂藥店，干燥，粉碎。菌株均由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。

細菌培養(yǎng)基：牛肉膏2.5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂8.5 g，500 mL蒸餾水，PH 7.0-7.2，121℃滅菌30 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，蔗糖2 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，PH 7.0-7.2，121℃滅菌30 min。

（二）提取液的制備

準(zhǔn)確稱取材料50 g，4份，剪碎，用75%乙醇、75%丙酮、75%甲醇、蒸餾水，以料液比1：3，中火微波4 min，浸泡24 h，抽濾，重復(fù)2次，并合并濾液。將濾液在烘干箱中50℃濃縮至50 mL備用。

（三）牛膝多糖含量的測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。多糖在硫酸的作用下先水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。在測定多糖含量時，因難以得到相應(yīng)的多糖對照品，而常以葡萄糖等單糖作為對照。測定結(jié)果則以單糖來表示多糖的含量。

1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.8 mL濃度為250 ?g/mL的葡萄糖溶液，分置于試管中，各加蒸餾水補足至每管1.00 mL，再各加入6%的苯酚溶液1.00 mL，搖勻，依次加入98%的濃硫酸5mL，搖勻，靜止15 min后，置于40℃的條件下30 min，冷卻，于波長490 nm處測定吸光度D490nm。將待測管中葡萄糖濃度與吸光度作回歸處理，得回歸方程y=0.0270x-0.0094 R2=0.9946。

2.樣品中多糖含量測定

從不同提取方法的粗提取液中各取出1 mL，用蒸餾水適當(dāng)稀釋即為待測液，代替標(biāo)準(zhǔn)液，于波長490 nm處測定吸光度。根據(jù)回歸方程算出測量多糖的C0（?g/mL），按照以下公式計算提取物多糖的提取率（mg/g）。

提取率（mg/g）=C0VK×10-3/W

式中：C0-測量液多糖的濃度（?g/mL）；V-粗提取液體積（mL）；K-為稀釋倍數(shù)；W-原料干重（g）。

（四）抑菌活性實驗

1.抑菌液的制備

將利用四種溶劑提取得到的提取液于紫外燈光下滅菌40 min，將滅菌的濾紙片放入上述溶液浸泡15 min，對照組的濾紙片置于無菌生理鹽水中進泡15 min。

2.實驗操作

用濾紙片法，首先將以滅菌的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平放置待凝固。用無菌吸管吸取0.1 mL菌懸液加入到凝固的培養(yǎng)皿上，用無菌三角涂布棒涂布均勻。將以涂布好的培養(yǎng)皿劃分成4等分，作上標(biāo)記，中間做對照。用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片5 mm至于相對的部位。每個菌種做三個重復(fù)。最后細菌放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，霉菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。

二、結(jié)果與討論

（一）懷牛膝多糖的測定

結(jié)果表明，相同實驗條件下，各溶劑對樣品多糖的提取率順序為蒸餾水﹥75%乙醇﹥75%甲醇﹥75%丙酮。其中懷牛膝的提取液中，蒸餾水對多糖的提取率較高為15.51 mg/g；其次是75%乙醇，對多糖提取率為13.45 mg/g；75%丙酮對多糖提取率最低為7.45 mg/g。

（二）抑菌活性實驗結(jié)果

采用濾紙片法研究懷牛膝多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、根霉、曲霉的抑菌效果，以抑菌圈的有無和抑菌圈的直徑的大小為指標(biāo)，實驗結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，蒸餾水、75%甲醇、75%乙醇、75%丙酮四種溶劑浸提液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌有一定的抑制效果，各提取液的抑菌作用強度是75%乙醇>75%甲醇>75%丙酮>蒸餾水。其中，同一種提取液對不同菌種的抑菌作用強度依次為枯草桿菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>根霉、曲霉，但是75%甲醇提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌作用無明顯差別。總體來說，各種提取液對細菌的抑菌效果較好，對真菌沒有明顯的抑菌活性。

三、結(jié)論

本實驗采用微波輔助法提取懷牛膝多糖，結(jié)果表明不同提取劑對多糖的提取率存在明顯差別，其中蒸餾水對多糖的提取率較高為15.51 mg/g；其次是75%乙醇，對多糖提取率為13.45 mg/g；75%丙酮對多糖提取率最低為7.45 mg/g。并采用濾紙片法，以抑菌圈的有無和抑菌圈的直徑的大小為指標(biāo)，研究懷牛膝多糖提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、根霉、曲霉的抑菌效果。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的抑菌圈，根霉、曲霉培養(yǎng)基上無明顯抑菌圈，因此懷牛膝多糖提取液對細菌的抑菌效果較好。但植物提取液成分較為復(fù)雜，具體是哪種化合物對抑菌活性起著關(guān)鍵性作用，還需進一步研究。

基金項目：2015年河南省高等學(xué)校重點科研項目（編號：15A180065）