喬 寧 閻振鑫 尼秀梅 代惠潔 竺曉平 孔令廣

（1濰坊科技學(xué)院，山東壽光 262700；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室，山東泰安 271018；3山東壽光富康制藥有限公司研發(fā)部，山東壽光 262700）

番茄黃化曲葉病毒抗性檢測DNA提取方法的優(yōu)化及應(yīng)用

喬 寧1，2 閻振鑫3 尼秀梅1 代惠潔1，2 竺曉平2* 孔令廣2

（1濰坊科技學(xué)院，山東壽光 262700；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室，山東泰安 271018；3山東壽光富康制藥有限公司研發(fā)部，山東壽光 262700）

通過對傳統(tǒng)DNA提取方法進行優(yōu)化和改進，得到一種快速提取番茄DNA的方法。綜合比較改進法、商品化試劑盒（經(jīng)典法）和其他試劑盒（快速法）提取番茄DNA的效果。結(jié)果表明：改進法相比經(jīng)典法提取的DNA質(zhì)量稍有差別，但用時較少，完全可以滿足后續(xù)PCR試驗要求，尤其適用于番茄黃化曲葉病毒的大規(guī)模抗性檢測；同時該法無液氮及其他有毒溶劑的加入，不僅節(jié)省了試驗時間和試驗成本，而且大大降低了試驗的危險性。

番茄黃化曲葉病毒；DNA提取；抗性檢測

番茄是一種營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值均較高的蔬菜作物，現(xiàn)在已經(jīng)成為基因工程和分子生物學(xué)的重要研究對象。番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellowleaf curl virus，TYLCV）的發(fā)生嚴(yán)重制約了世界各地的番茄生產(chǎn)，培育優(yōu)良抗病品種是防治該病毒最有效和最經(jīng)濟的途徑，而番茄抗病材料的篩選及其抗性基因的快速準(zhǔn)確鑒定是番茄抗病育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。傳統(tǒng)的植物基因組DNA提取方法操作步驟較為繁瑣，而且需要加入氯仿等有毒物質(zhì)，在很大程度上增加了試驗難度，減緩了試驗進程。因此，在番茄黃化曲葉病毒抗性基因檢測過程中，探索一種更為快捷有效的DNA提取方法以利于對其進行一系列的分子生物學(xué)研究顯得十分重要。

傳統(tǒng)DNA提取方法主要有CTAB法（Doyle & Doyle，1987；宋艷波 等，2011；李金璐 等，2013）和SDS法（蔡朝輝 等，2000；Kamiya & Kiguchi，2003；盧東柏 等，2008）。采用這兩種方法提取DNA需要進行多次提純才能夠達到后期試驗要求，高等植物的細胞中均含有細胞膜、酚類及多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在使得DNA提取過程變得繁瑣復(fù)雜，CTAB法和SDS法都是先溶解細胞，再用氯仿等有機溶劑除去多糖、蛋白質(zhì)等，最后用異丙醇或乙醇沉淀洗滌DNA獲得相應(yīng)產(chǎn)物；在長期的試驗過程中還發(fā)現(xiàn)其他一些問題：如進行葉片研磨時，需要使用液氮和體積較大的容器，技術(shù)含量較高，所需的試驗材料較多、試驗時間較長，而獲得的DNA數(shù)量和質(zhì)量也受到一定的限制，容易影響后續(xù)的PCR檢測及試驗結(jié)果。謝艷等（2001）、Collard等（2007）、程文等（2016）成功運用堿裂解法提取了煙草、水稻、大豆種子等植物的DNA，該方法高效快捷，但是對樣品新鮮度和植物種類有較高要求，而且提取的DNA純度較低，應(yīng)用范圍有一定的局限性。目前用于植物DNA提取的商品化試劑盒，主要借助硅膠膜吸附柱特異性吸附DNA的特點，其原理是在裂解液的作用下使植物細胞發(fā)生裂解，暴露出核酸等物質(zhì)，再用洗柱液把雜質(zhì)等去除掉，而DNA在高鹽濃度下特異性結(jié)合于硅膠膜中，洗脫后所得DNA濃度和純度都較高，適合進行后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。磁珠法也是近幾年發(fā)展起來的一種新型DNA提取方法，該方法高效快速、通用性好，但成本較高，很難大規(guī)模推廣應(yīng)用（李正美 等，2013）。

目前，番茄黃化曲葉病毒抗性基因的檢測與鑒定仍以PCR技術(shù)為主，其中番茄DNA的提取主要是使用商品化的試劑盒或者CTAB法（蔣振 等，2014；田兆豐 等，2014；鄭積榮 等，2015）。本試驗是在SDS法的基礎(chǔ)上，結(jié)合硅膠膜吸附柱的優(yōu)點，得到一種快速提取番茄DNA的方法；并分別以改進法、商品化試劑盒（經(jīng)典法）和其他試劑盒（快速法）提取的番茄DNA為模板，以TY1-2F/ TY1-2R、SCAR3-F/SCAR3-R為引物進行PCR檢測，為大量番茄樣品的TYLCV抗性快速鑒定提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年8月，在濰坊科技學(xué)院濰科種業(yè)公司育苗基地的番茄種植棚中隨機選取10株濰科粉1號（呂金浮 等，2014）植株，每株從上、中、下部共采集10片新鮮葉片，取其中5片凍存于-40℃冰箱備用；陽性對照為先正達公司的番茄品種齊達利；陰性對照為本實驗室保存的番茄品種Moneymaker。

1.2 試驗試劑

植物基因組DNA提取盒、2×Taq Master Mix、DNA結(jié)合液（Binding Buffer 1）等購自北京全式金生物科技有限公司；硅膠膜吸附柱、一管式植物DNAout等購自北京天恩澤生物科技有限公司。

參 考 Ji等（2007）、Verlaan等（2013）的方法設(shè)計引物序列，并由北京華大基因 科技 有 限公 司 合成。TY1-2F（5′-3′）：CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT，TY1-2R（5′-3′）：CAACGGAGGGAGCATATCAT；SCAR3-F（5′-3′）：GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC，SCAR3-R（5′-3′）：GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC。

1.3 試驗方法

1.3.1 番茄DNA提取 本試驗采用3種DNA提取方法。試劑盒法（經(jīng)典法）：參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書進行。改進法：① 采用直徑6 mm的打孔器打取番茄葉片，放進2 mL離心管中，加入100 μL DNA提取液Ⅰ（2×）（0.5 mol·L-1NaOH，5 mmol·L-1EDTA，2% SDS，4% PVP），再加入100 μL無菌水，混勻后加入1顆直徑6 mm的鋼珠，置于高通量組織研磨器中研磨；② 研磨后加入50 μL KAC溶液（3 mol·L-1KAC，5 mol·L-1醋酸）與450 μL DNA結(jié)合液混勻，12 000 r·min-1離心60 s；③ 小心吸取上清液200～300 μL，加到硅膠膜吸附柱中，靜置1 min，12 000 r·min-1離心30 s；④ 棄廢液，再加入650 μL洗柱液（10 mmol·L-1Tris-HCl，pH=7.5；70%乙醇），12 000 r·min-1離心30 s；⑤ 棄廢液，空甩30 s，把殘留的液體徹底去除掉；⑥ 取干凈的1.5 mL離心管，在吸附柱的中間部位加入60 ℃預(yù)熱的無菌水30～40 μL，12 000 r·min-1離心30 s，收集樣品DNA溶液。試劑盒法（快速法）：參照一管式植物DNAout試劑盒說明書進行。

1.3.2 提取方法比較 分別采用經(jīng)典法和改進法提取同一番茄植株葉片DNA，且每種方法中再分別設(shè)置選用冷凍樣品與新鮮樣品各0.1 g和0.2 g處理，10次重復(fù)，并分別記錄提取時間；然后采用瓊脂糖凝膠電泳法（上樣量均為5 μL，下同）進行檢測。

分別采用改進法和快速法提取同一番茄植株葉片DNA，由于快速法試劑盒說明書推薦的樣品量為0.1 g，故兩種方法中均分別設(shè)置選用冷凍樣品與新鮮樣品各0.1 g處理，3次重復(fù)；然后采用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。

采用改進法提取番茄植株葉片DNA，分別設(shè)置步驟②中添加50 μL KAC溶液和不添加KAC溶液2個處理，其他步驟相同，3次重復(fù)；然后采用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。

1.3.3 TYLCV抗性的PCR檢測 分別以1.3.2提取的番茄DNA為模板，以TY1-2F/TY1-2R、SCAR3-F/SCAR3-R為引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系（25 μL）為：2×PCR-Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol·L-1）各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，觀察并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品量對DNA提取方法的影響

圖1 不同樣品量對DNA提取方法的影響

由圖1可見，采用經(jīng)典法和改進法提取的DNA條帶都比較清晰明顯，效果較好，兩種方法提取的DNA純度均能滿足后續(xù)試驗要求；但經(jīng)典法（提取10個樣品平均用時40 min）較改進法（提取10個樣品平均用時30 min）用時較長。取樣量分別為0.1 g和0.2 g時，提取的DNA只是在亮度上有輕微的差別；采用冷凍樣品和新鮮樣品提取的DNA無明顯區(qū)別。

2.2 不同提取方法對DNA提取結(jié)果的影響

由圖2可見，采用改進法提取的DNA條帶清晰明顯；采用快速法雖然用時較少，但基本沒有條帶顯示，可以推測一管式植物DNAout試劑盒不適合番茄基因組DNA的提取。

圖2 采用改進法和快速法提取的DNA電泳結(jié)果

由圖3可見，在改進法步驟②中添加或不添加KAC溶液對DNA提取結(jié)果無明顯影響。

圖3 不同KAC含量對改進法DNA提取結(jié)果的影響

2.3 TYLCV抗性檢測結(jié)果

由圖4可見，采用經(jīng)典法提取的DNA均能獲得良好的目的條帶；采用改進法，冷凍樣品和新鮮樣品的樣品量為0.1 g的擴增效果均明顯優(yōu)于樣品量為0.2 g；而采用快速法提取的DNA沒有擴增出目的條帶。另外，加入KAC溶液后提取的DNA目的條帶較清晰。

通過檢測可知，供試番茄濰科粉1號具有較好的TYLCV抗性，結(jié)果與呂金浮等（2014）對濰科粉1號品質(zhì)特性的描述相符。

圖4 TYLCV抗性檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗基于傳統(tǒng)的提取植物基因組DNA的SDS法，結(jié)合商品化試劑盒的優(yōu)點，經(jīng)簡化得到一種快速提取DNA的方法。由于商品試劑盒的保密性，無法獲得試劑的具體成分及濃度，因此自行配制提取緩沖液和洗柱液等試劑，只是借用試劑盒中的結(jié)合緩沖液，經(jīng)大量試驗驗證改進法提取的DNA能夠滿足番茄黃化曲葉病毒的抗性鑒定；本試驗中樣品研磨使用的是高通量組織研磨器（寧波新芝，SCIENTZ-48），一次最多可處理49個樣品，很大程度上加快了研磨速度；如果沒有該設(shè)備，也可用6 cm研缽替代，但將研磨液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管時會有部分損失?？傊?，改進法將商品化試劑盒和傳統(tǒng)方法的液氮研磨步驟進行了簡化和改進，同時避免了苯酚和氯仿等有毒試劑的加入，極大地節(jié)省了提取時間和試驗成本，降低了試驗危險性，非常適合番茄樣品的大規(guī)模抗性檢測。

本試驗結(jié)果表明，當(dāng)樣品量較少（0.1 g）時，采用改進法提取的DNA擴增效果較好，這可能是因為樣品量較大時DNA中殘留較多的酚/多糖等物質(zhì)，干擾了后續(xù)PCR反應(yīng)；同時，樣品量少也可以避免假陽性現(xiàn)象的發(fā)生。另外，在步驟②中加入KAC溶液后所得DNA的PCR擴增結(jié)果較好，可能是KAC的參與進一步促使大量蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，以致未對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制，這與盧東柏等（2008）的研究結(jié)論一致。

本試驗所涉及的3種方法均未使用RNA酶來降解DNA中殘留的RNA，主要基于以下幾個方面的考慮：第一，試驗證實殘留的RNA不會干擾后續(xù)的PCR擴增；第二，節(jié)省了RNA酶的孵育時間；第三，RNase A較為昂貴，節(jié)約了這部分試驗成本。因此，在本試驗提取的DNA電泳圖譜中會看到殘留的RNA。

在實際科研工作中，所采集的樣品數(shù)量往往較多，無法在有限的時間內(nèi)完成DNA提取工作，這就必須對樣品進行冷凍保存，因此本試驗對冷凍樣品和新鮮樣品進行了比較，結(jié)果顯示兩者均可以獲得明亮的目的條帶，并無明顯差別。通過對番茄基因組DNA提取方法的改進和優(yōu)化，為后續(xù)番茄TYLCV的抗性檢測提供了方便和技術(shù)支持。

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Optimization and Application of DNA Extraction Methods for Detecting Tomato yellow leaf curl virus Resistance

QIAO Ning1，2，YAN Zhen-xin3，NI Xiu-mei1，DAI Hui-jie1，2，ZHU Xiao-ping2*，KONG Ling-guang2
（1Weifang University of Science and Technology，Shouguang 262700，Shandong，China；2College of Plant Protection，Shandong Agricultural University，Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests，Taian 271018，Shandong，China；3Shandong Shouguang Fukang Pharmaceutical Co. Ltd. R&D，Shouguang 262700，Shandong，China）

The rapid and efficient method for tomato DNA extraction has been optimized and improved based on the conventional DNA extraction methods．The comparation improved method，the classic method（commercial kits）and rapid method（other kits）was carried out by the PCR analysis．The results showed that DNA obtained by improved method was slightly different comparing to the classic method with less time and funds when faced with large amount of test samples for detecting Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）resistance without the use of liquid nitrogen and other toxic solvents throughout the experiment．

Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）；DNA extraction；Resistance detection

喬寧，男，講師，專業(yè)方向：蔬菜育種及病蟲害防治，E-mail：qning78@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：竺曉平，男，教授，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail：zhuxp@sdau.edu.cn

2016-09-24；接受日期：2016-11-29

山東省科技發(fā)展計劃項目（2010GNC10915），2015年度壽光市科技發(fā)展計劃項目，山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2015CQ022）