方 葆 沈國森 郭 珍*

RNA降解復(fù)合體是RNA在生物體內(nèi)更新的主要工具。信使RNA（mRNA）的更新對蛋白的表達(dá)起重要作用，其調(diào)控多種生理學(xué)過程。作者自2015年5月至2016年7月通過對綠膿桿菌RNA降解蛋白PNPase與RNase E進(jìn)行克隆表達(dá)純化，并獲取復(fù)合物蛋白，以期揭示PNPase與RNase E對綠膿桿菌RNA的降解機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與方法 載體pW28由pET28a改造而來、載體PGEX-6p-2、E.coli菌株DH5α、E.coli BL21（DE3），基因組模板從綠膿桿菌PAO1標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取。

1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶 BamH I、Hind III和Xho I、ExTaqDNA 聚合酶、DNA純化試劑盒購自PROMEGA 公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自 OMEGA 公司；Ni-NTA親和層析膠、GST親和層析柱、DEAE 層析柱、分子篩 Superdex 75 購自 GE 公司。試劑 IPTG 等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計 對PNPase與RNase E基因序列分析及應(yīng)用Primer 5軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計，限制性內(nèi)切酶分別為 BamH I、Hind III和 BamH I、Xho I。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物及其序列

1.4 PCR擴(kuò)增目的基因 用綠膿桿菌PAO1的基因組為模板，PCR擴(kuò)增PNPase與RNase E，反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性50s、57℃退火45s、72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存；PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析；用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒回收、純化目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶 BamH I，Xho I與BamH I、Xho I對純化后 PCR產(chǎn)物、載體pW28與載體PGEX-6p-2雙酶切，并用DNA 純化試劑盒進(jìn)行回收、純化。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 純化雙酶切（BamH I + Hind III與BamH I+Xho I）后的PCR產(chǎn)物和載體pW28、載體PGEX-6p-2，用T4DNA連接酶在16金屬浴中連接16 h，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5a中。PNPase：涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒；RNase E：涂布于含100 mg/L氨芐霉素的LB平板上，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定篩選陽性單克隆，再轉(zhuǎn)化至表達(dá)用感受態(tài)E.coli BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.6 PNPase與RNase E的誘導(dǎo)表達(dá) 將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21（PNPase、RNase E）接種于LB培養(yǎng)基（PNPase：50 mg/L卡那霉素；RNase E：100 mg/L氨芐霉素）中，培養(yǎng)至A600nm約為0.6，加入終濃度為0.2mmol/L IPTG，于18℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)12h，離心收集菌體，-80℃凍存。

1.7 PNPase的純化 冰浴，超聲破碎離心后的菌體，4℃，12 000 r/min，離心30min收集上清液。上清液通過預(yù)先用結(jié)合緩沖液平衡過的Ni-NAT-Sepharose Fast Flow column，然后用200ml洗滌緩沖液（20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，pH8.0，25mmol/L 咪唑）洗滌雜蛋白，最后用洗脫緩沖液（20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，250mmol/L咪唑）洗脫目的蛋白。為進(jìn)一步提高蛋白純度，再用DEAE-Sepharose Fast Flow和Superdex 200分子篩純化，將純化后的PNPase蛋白質(zhì)在超濾杯中脫鹽、脫咪唑，濃縮至體積約為5ml，并用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度約為30mg/ml。

1.8 PNPase與RNase E相互作用 冰浴，超聲破碎離心后的菌體（RNase E），4℃，12000r/min，離心30 min收集上清液。上清液通過預(yù)先用結(jié)合緩沖液平衡過的GST親和層析柱中，4℃，冰上輕搖孵育12h，使GST-RNase E融合蛋白與GST層析柱充分結(jié)合。讓GST親和層析柱中液體自然流出，再用Binding Buffer（20mM tris-HCl、pH8.0、50mMNaCl）充分洗滌層析柱中未結(jié)合的雜蛋白并平衡層析柱；取脫鹽、脫咪唑、濃縮后的PNPase蛋白質(zhì)加入經(jīng)RNase E蛋白質(zhì)結(jié)合的GST層析柱上，4℃，孵育8h，RNase E與PNPase充分結(jié)合。讓GST親和層析柱中的液體自然流出，用Binding Buffer（20mM tris-HCl、pH8.0、50mMNaCl）充分洗滌GST親和層析柱；用20ml PPase加入GST親和層析柱中，切掉GST標(biāo)簽，并讓柱中的液體自然流出；用5ml的谷胱甘肽作為洗脫液洗脫與GST層析柱結(jié)合的蛋白質(zhì)；脫鹽、脫咪唑、濃縮；留樣進(jìn)行SDSPAGE電泳。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增目的基因與重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PNPase：1%瓊脂糖核酸電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的片段長度大約為1700bp，與目的片段長度相吻合（見圖1A）；PCR產(chǎn)物和載體pW28連接后，經(jīng)過菌液PCR，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I + Hind III雙酶切后核酸電泳鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1B）。RNase E：1%瓊脂糖核酸電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的片段長度大約為1700bp，與設(shè)計的目的長度吻合（見圖1A）。PCR產(chǎn)物和載體PGEX-6p-2連接后，經(jīng)過菌液PCR，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I+Xho I雙酶切后核酸電泳鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1B）。重組質(zhì)粒送往北京華大基因測序中心測序，結(jié)果表明所構(gòu)建的質(zhì)粒完全正確。表明成功構(gòu)建PNPase與RNase E表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 A：1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物；B：重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 PNPase的 純化 PNPase與 RNase E分別低溫誘導(dǎo)表達(dá)后，對 PNPase進(jìn)行純化。冰浴，超聲破碎離心后的菌體，4℃，12000r/min，離心30min收集上清液。因載體pW28中含His標(biāo)簽PNPase用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow column進(jìn)行初步純化，25mmol/L低濃度咪唑洗脫非特異性結(jié)合蛋白，250mmol/L高濃度咪唑洗脫目的蛋白。SDS-PAGE電泳顯示PNPase得與鎳離子親和層析柱結(jié)合良好，為進(jìn)一步提高PNPase的純度，繼續(xù)用DEAE-Sepharose Fast Flow和Superdex 200分子篩純化，SDS-PAGE檢測蛋白純度得到進(jìn)一步提高。將純化后的PNPase蛋白質(zhì)在超濾杯中脫鹽、脫咪唑，濃縮至體積約為5ml，并用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度約為30mg/ml。SDSPAGE電泳顯示，表達(dá)蛋白位于約60kD處，該實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡鞍?9.5kD，加上融合的6個his標(biāo)簽，條帶位置相吻合。見圖2。

圖2 PNPase蛋白的表達(dá)與純化效果圖

2.3 PNPase與RNase E相互作用 GST-RNase E融合蛋白與GST層析柱充分結(jié)合，讓GST親和層析柱中液體自然流出后，50mMNaCl洗滌層析柱中未結(jié)合的雜蛋白；再加入脫鹽、脫咪唑、濃縮后的PNPase蛋白質(zhì)至GST層析柱上，4℃，孵育8h，使RNase E與PNPase充分結(jié)合；再用50mMNaCl的Binding Buffer洗滌GST親和層析柱；用PPase切掉GST標(biāo)簽，并讓柱中的液體自然流出；用5ml的谷胱甘肽作為洗脫液洗脫與GST層析柱結(jié)合的蛋白質(zhì)；脫鹽、脫咪唑、濃縮、SDS- PAGE電泳。PNPase無GST標(biāo)簽，其不與GST親和層析柱結(jié)合，結(jié)合上的就是與GST柱上的RNase E結(jié)合。SDS-PAGE電泳顯示，通過Pulldown，PNPase的量明顯下降，PNPase與RNase E能在50mM、100mM、200mM和300mM NaCl條件下結(jié)合，由此表明PNPase與RNase E在體外相互作用。見圖3。

圖3 PNPase與RNase E的體外結(jié)合

3 討論

在真核生物中，mRNA主要由外核體蛋白復(fù)合物從3'到5'方向降解。而類似的，在細(xì)菌中，與真核外核體蛋白復(fù)合物有類似結(jié)構(gòu)域的聚核苷酸磷酸化酶（即PNPase）對原核mRNAs的降解起關(guān)鍵作用［1］。PNPase是一種進(jìn)化保守的酶，幾乎存在于除酵母、錐蟲和古細(xì)菌外的所有物種中［2］。PNPase是一個3'到5'方向的核酸外切酶，磷酸鹽催化RNA的磷酸解作用，產(chǎn)生分解產(chǎn)物二磷酸核苷。PNPase降解或合成的活性方向主要由二磷酸核苷和磷離子的相對濃度控制［3］。在大腸桿菌中，PNPase主要與RNase E、RhlB和烯醇化酶等形成RNA降解復(fù)合物起作用，PNPase可以非特異性地持續(xù)降解RNA3'端的核苷酸，但當(dāng)遇到像莖環(huán)一樣的鏈RNA結(jié)構(gòu)就會停止［4］。研究發(fā)現(xiàn)，RNase E參與此降解過程的調(diào)控［5-8］。Salima等對大腸桿菌PNPase的結(jié)構(gòu)研究顯示PNPase核心區(qū)域形成一個三同聚體環(huán)形結(jié)構(gòu)包圍著一個大中心通道。RNase E的微區(qū)域通過氫鍵與PNPase PH區(qū)域形成反向平行的β折疊片中微區(qū)域（第327-331位氨基酸殘基）相互作用［9］。在細(xì)菌中，有兩個RNase E抑制因子（RraA和RraB）通過與降解體結(jié)合從而影響復(fù)合物的成分和調(diào)節(jié)酶性質(zhì)。這些蛋白似乎是通過與RNase E的非催化區(qū)域相互作用而在體內(nèi)和體外抑制RNase E的活性，其可以減少RNA降解復(fù)合體上PNPase的量［10］。本文成功構(gòu)建了RNase E-PGEX-6p-2重組表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)GST-RNase E的融合蛋白。通過Pull-down，成功驗(yàn)證綠膿桿菌RNase E與PNPase相互結(jié)合。并在50mM NaCl濃度下得到PNPase-RNase E蛋白的穩(wěn)定復(fù)合物。原核表達(dá)系統(tǒng)具有方便快捷及成本便宜等優(yōu)勢，本課題組首次采用原核表達(dá)系統(tǒng)來制備PNPase-RNase E復(fù)合物，為開展三維結(jié)構(gòu)和相關(guān)功能研究的奠定基礎(chǔ)。

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