劉慶生 邱 靜 蔡丹莉 桑 怡 陳芝蕓

我國是胃癌高發(fā)地區(qū)，其病死率居于各種惡性腫瘤的首位，慢性萎縮性胃炎（CAG）的胃黏膜腸上皮化生和異型增生被廣泛認(rèn)為是胃癌前病變，CAG伴腸腺化生或不典型增生的癌變率為7%～9%。研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜組織存在腺體萎縮和慢性炎癥時(shí)，該部位黏膜細(xì)胞抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域呈高甲基化狀態(tài)和抑癌基因蛋白的低表達(dá)。目前關(guān)于CAG不同中醫(yī)證型與胃癌關(guān)系研究報(bào)道較少，然而文獻(xiàn)報(bào)道CAG的產(chǎn)生與胃黏膜組織中P16、hMLH1基因的表達(dá)有關(guān)［1］。因此本研究以P16、 hMLH1 DNA甲基化表達(dá)為切入點(diǎn)，采用焦磷酸測序法檢測經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)的CAG患者胃黏膜中的P16、hMLH1 DNA甲基化表達(dá)。分析CAG不同中醫(yī)證型胃黏膜p16、hMLH1 DNA甲基化水平差異及其相關(guān)性，探討癌基因侵襲、發(fā)生、發(fā)展與中醫(yī)證型之間的關(guān)系，尋求這些差異產(chǎn)生的可能原因。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2013年1月至2014年12月就診于本院經(jīng)電子胃鏡以及胃黏膜組織病理證實(shí)為CAG的患者180例［2］，辨證分型為肝胃不和型、瘀毒內(nèi)阻型、痰濕凝結(jié)型、脾胃虛寒型、胃熱傷陰型、氣血雙虧型［3］，每組各30例。其中男86例，女94例；年齡30～75歲，平均年齡（62.98±10.06）歲。再每組選取無嗜酒史、無服藥史的患者12例，共72例CAG患者檢測胃黏膜DNA甲基化率，其中男32例，女40例；年齡30～75歲，平均年齡（60.94±11.14）歲。各證型間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 病例納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合CAG診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者（男女不限）［3］。（2）年齡 18～75 歲。（3）近4周未服用過質(zhì)子泵抑制劑及抗生素。（4）自愿參加研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有胃部手術(shù)史者。（2）已確診為胃癌或者其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者。（3）長期服用非甾體抗炎藥（NSAID）患者。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料及方法 （1）標(biāo)本采集：常規(guī)胃鏡檢查，取胃竇、胃角和胃體胃黏膜進(jìn)行病理組織活檢，新鮮標(biāo)本立即放置于EP管中，迅速保存至液氮中。（2）方法：檢測胃黏膜組織p16、mlh1DNA甲基化表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。Pyrosequencing檢測在96孔PCR反應(yīng)板中加入反應(yīng)結(jié)合珠2μl，結(jié)合緩沖液38μl，PCR產(chǎn)物40μl，室溫下充分混勻10min。開啟真空泵吸取結(jié)合珠及PCR產(chǎn)物混懸液，依次浸入70% 乙醇，0.2M NaOH和沖洗緩沖液中各5s；關(guān)閉真空泵，后將探頭上結(jié)合珠及PCR產(chǎn)物置人40μl退火緩沖液（含測序引物1.5μl），85℃變性2min，冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。根據(jù)Pyrose quencing軟件序列設(shè)計(jì)信息計(jì)算出劑量，在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及四種dNTP（QIAGEN），將試劑艙及96孔反應(yīng)板放入Pyrosequencing檢測儀（PyroMark Q96 ID，QIAGEN）進(jìn)行反應(yīng)，Pyro Q-CpG軟件自動(dòng)分析取得各位點(diǎn)甲基化定量分析數(shù)據(jù)。引物合成見表1。

表1 引物合成

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（s）表示，行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的采用多組均數(shù)比較的單因素方差分析，若不服從正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)法；計(jì)數(shù)資料以n表示，行非參數(shù)檢驗(yàn)法Kruskal Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)各證型間性別和年齡的比較 CAG中醫(yī)各證型間性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、3。

表2 中醫(yī)各證型間性別的比較（n）

表3 中醫(yī)各證型間年齡的比較［歲，］

表3 中醫(yī)各證型間年齡的比較［歲，］

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2.2 p16，hMLH1DNA基因甲基化與CAG中醫(yī)各證型關(guān)系 CAG的中醫(yī)各證型中p16基因甲基化率由高至低依次是肝胃不和＞脾胃虛寒＞氣血雙虧＞痰濕凝結(jié)＞胃熱傷陰＞瘀毒內(nèi)阻。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，胃熱傷陰、瘀毒內(nèi)阻組與肝胃不和組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 4。

表4 p16基因甲基化與CAG中醫(yī)各證型關(guān)系

2.3 基因甲基化與CAG中醫(yī)各證型關(guān)系 見表5。

表5 hMLH1DNA基因甲基化與CAG中醫(yī)各證型的關(guān)系

2.4 P16、hMLH1 DNA甲基化與病理分級(jí)關(guān)系 經(jīng)Spearman相關(guān)法檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CAG中醫(yī)各證型DNA甲基化與病理分級(jí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 P16、hMLH1 DNA 甲 基 化 與 Hp關(guān) 系 經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CAG中醫(yī)各證型DNA甲基化與Hp感染比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

研究認(rèn)為幽門螺旋桿菌（Hp）感染是觸發(fā)CAG形成和導(dǎo)致胃癌的重要危險(xiǎn)因素，根除Hp可以延緩胃黏膜萎縮的進(jìn)展，降低胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性。KondoT等［4］在研究與胃MALT淋巴瘤發(fā)現(xiàn)，相關(guān)的11個(gè)基因的CpG島甲基化表型發(fā)生率與Hp感染率同步上升，其中尤其是p16，MINT31等基因的甲基化與Hp感染密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，CAG癌前病變的病理變化與中醫(yī)證型之間存在一定的相關(guān)性，病理程度較輕時(shí)以實(shí)證為主，病理程度中、重度時(shí)以虛為主，虛實(shí)夾雜表現(xiàn)多見［5］。本研究經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CAG中醫(yī)各證型p16及hMLH1DNA甲基化與病理分級(jí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。可能受近年來患者健康意識(shí)、胃鏡普查率的提高等因素影響，入組的病例以單純CAG伴輕度腸化患者居多，而中重度腸化及不典型增生病例相對(duì)太少有關(guān)。

DNA甲基化是最為重要的表觀遺傳學(xué)修飾，其熱點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化導(dǎo)致的抑癌基因表達(dá)失活和及低甲基化導(dǎo)致的原癌基因的激活。CpG島在正常狀態(tài)下一般是非甲基化的，當(dāng)其發(fā)生甲基化時(shí)，常使重要的基因如抑癌基因、DNA修復(fù)基因、凋亡基因等發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉寂，導(dǎo)致正常細(xì)胞的調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，形成腫瘤。

抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的異常甲基化導(dǎo)致其功能失活是其參與腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。p16基因被認(rèn)為是最重要的抑癌基因之一，其編碼的p16蛋白可通過與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶 CDK4和CDK6 結(jié)合而抑制蛋白激酶的活性，從而對(duì)細(xì)胞周期起到負(fù)調(diào)控作用。與其他腫瘤不同的是，在胃癌中p16基因突變或缺失少見，而主要由于啟動(dòng)子和第1外顯子甲基化導(dǎo)致。在正常細(xì)胞中p16基因啟動(dòng)子區(qū)保持非甲基化狀態(tài)，基因可以正常表達(dá)、轉(zhuǎn)錄，基因啟動(dòng)子甲基化可誘導(dǎo)p16、CDX2及 RASSF1A等抑癌基因的失活［7-9］。Yao等［6］研究顯示，21例由胃黏膜上皮異型增生發(fā)展為胃癌的病例中，有5例檢測到p16基因異常甲基化，并經(jīng)基因測序證實(shí)該基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島出現(xiàn)高甲基化，反映了癌的演變過程，也證明了其可能是早期事件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各證型中p16基因甲基化率由高至低依次是肝胃不和＞脾胃虛寒＞氣血雙虧＞痰濕凝結(jié)＞胃熱傷陰＞瘀毒內(nèi)阻。組間比較發(fā)現(xiàn)，胃熱傷陰、瘀毒內(nèi)阻組與肝胃不和組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而肝胃不和、脾胃虛寒、氣血雙虧組p16基因甲基化率較痰濕凝結(jié)、胃熱傷陰及瘀毒內(nèi)阻高，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

hMLH1作為主要的DNA錯(cuò)配修復(fù)基因之一，表達(dá)減少或缺失都會(huì)削弱DNA錯(cuò)配修復(fù)的能力。Li等［7］研究191例胃癌組織、133例癌旁組織和42例非胃癌患者正常胃黏膜組織，發(fā)現(xiàn)其hMLH1表達(dá)分別為80.1%（153/191）、60.2%（80/133）和31.0%（13/42），癌組織hMLH1表達(dá)明顯高于癌旁組織和非胃癌患者的正常胃。由此得出，hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化是引起蛋白表達(dá)缺失的主要原因，hMLH1蛋白表達(dá)缺失與胃癌的發(fā)生有關(guān)。本研究經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CAG的中醫(yī)各證型中hMLH1 DNA基因甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示hMLH1 DNA基因甲基化率與CAG中醫(yī)各證型無相關(guān)性。

本資料結(jié)果顯示，各證型中痰濕凝結(jié)、胃熱傷陰、瘀毒內(nèi)阻型p16基因甲基化率較其他三型低，p16為抑癌基因，基因啟動(dòng)子甲基化率降低可抑制抑癌基因的失活，因此，上述結(jié)果提示此三型CAG的人群癌變發(fā)生率可能低于其他三型。而肝胃不和、氣血雙虧、脾胃虛寒型p16基因甲基化率較其他三型高，提示這三型CAG的人群癌變發(fā)生率可能會(huì)增加，因此，在治療方面，對(duì)于肝胃不和、氣血雙虧、脾胃虛寒型的CAG應(yīng)高度重視，定期隨訪，及早治療防止胃癌的發(fā)生。CAG萎縮部位與胃癌的發(fā)生率密切相關(guān)，已知的胃體萎縮癌變率高于胃竇，CAG不同部位萎縮的癌變率是否與上述中醫(yī)證型相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

［1］ 劉麗華,張方信．胃癌前病變中DNA甲基化狀態(tài)與葉酸．世界華人消化雜志,2005,13(23):2770-2772．

［2］ 劉慶生,桑怡,蔡丹莉,等．慢性萎縮性胃炎中醫(yī)證型與病理﹑HP感染關(guān)系研究．浙江臨床醫(yī)學(xué)雜志,2015,17(12):2121-2123．

［3］ 鄭筱萸．中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則．中國醫(yī)藥科技出版社,2002:124-128．

［4］ T Kondo,T Oka,H Sato,et al． Accumulation of aberrant CpG hypermethylation by Helicobacter pylori infection promotes development and progression of gastric MALT lymphoma．Int JOncol,2009, 35(3):547-557．

［5］ 王俊,黃雅慧．CAG胃黏膜癌前病變病理變化與中醫(yī)證型及TRPV1﹑TRPM8的相關(guān)性研究．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,23(24):2627-2630．

［6］ Yao JF,Chen WX,Yin YL,et al．Expressions and clinical significance of cyclo oxygenase-2 and p16 in gastric cancer and its precancerous lesion．Chin J Gastroentero,2009,14(1):31-34．

［7］ Li M,Liu L,Wang Z, et al． Overexpression of hMSH2 and hMLH1 protein incertain gastric cancers and their surrounding mucosae．Oncol Rep,2008,19(2):401-406．