吳 昊 張華暹 鄭卜毅 譚龍威

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）在所有年齡階段都具有高度的致殘率，腦外傷可對神經(jīng)組織造成原發(fā)性和繼發(fā)性的損傷，原發(fā)性損傷是由最初的機械損傷引起的血管，神經(jīng)元和軸突的物理性破壞，緊隨原發(fā)性損傷，存在不同通路來誘發(fā)繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致初始損傷周圍區(qū)域的額外組織死亡［1］。長春西汀在臨床上可以改善腦供血不足、血管性認(rèn)知功能障礙和老年癡呆癥。本研究采用大鼠TBI模型，探討長春西汀對于TBI的保護作用以及對抗氧化和凋亡通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 長春西汀購自百靈威公司，吐溫80購自Sigma-Aldrich公司，protein assay kit、RIPA 裂解液和Super Signal West Dura chemiluminescence購自 Thermo Scientific公 司，Bcl-2、Bax、Caspase 3和GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司，標(biāo)記有辣根過氧化物酶的二級抗體IgG購自公司Jackson-Immuno Research，醋酸纖維素酶購自Whatman公司。丙二醛（MDA）的含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.2 實驗儀器 垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自Applied Biosystems公司，離心機購自Eppendorf公司，Image Quant LAS 4000 mini 購自GE healthcare公司，立體定位儀購自上海拜力生物科技有限公司，顱腦撞擊器購自hatteras公司。

1.3 實驗動物與分組 250只7周齡的Wistar雄性大鼠購自上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于獨立通風(fēng)籠盒（IVC）環(huán)境中，適應(yīng)2d。在IVC環(huán)境中每天光照和黑暗各12h，22°C，60%濕度。大鼠自由取食和飲水。大鼠隨機分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組和長春西汀組（低、中、高3個劑量），每組各50只。

1.4 TBI模型制作 對大鼠稱重，根據(jù)體重腹腔注射10%的水合氯醛，按照0.4 ml/100g進行麻醉，并固定于立體定位儀上，固定頭部，清除毛發(fā)。假手術(shù)組大鼠只進行顱部皮膚切口，然后清潔傷口縫合。模型組和長春西汀組參考Feeney法［2］制作TBI模型：常規(guī)手術(shù)開顱骨窗，要求硬膜保持完整，使用重量為20g的砝碼于30cm高度連接金屬導(dǎo)桿墜落，撞擊硬膜上的圓錐，造成TBI。撞擊后1h參照Wayne Clark評估方法，進行大鼠的神經(jīng)行為學(xué)觀察和評分，TBI分為輕度、中度和重度，神經(jīng)行為學(xué)評分分別為≤6分、≤12分和≤18分，選用其中的重度損傷作為研究模型。長春西汀組分為3個劑量組，分別腹腔注射長春西汀10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg，模型組腹腔注射等量生理鹽水，給藥14d。

1.5 腦組織含水量檢測 在給藥第14天，腹腔注射10%的水合氯醛（0.4 ml/100g）麻醉10只大鼠后迅速斷頭、開顱、取出完整的腦組織，電子天平測量腦組織濕重，將腦組織在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中、95℃、干燥24h至恒重，然后干燥冷卻15min，用電子天平稱重。腦含水量（%）=（濕重-干重）/ 濕重×100%。

1.6 酶活性檢測 在給藥第3、7和14天，分別取10只大鼠，對血漿中SOD、GPx、CAT的活性使用相應(yīng)的試劑盒進行檢測，活性單位為U/mg。

1.7 免疫印跡實驗 在給藥第14天，10只大鼠腦組織用裂解液（25mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，150mmol/L NaCl，1mmol/L Na3VO4，1% Triton X-100 和 protease inhibitor cocktail）裂解。裂解后，12000r/min，4℃離心90min，取上清液，測定蛋白濃度。將蛋白用裂解液稀釋為相同的濃度，再加入相同體積的2×loading buffer。樣品加熱震蕩15min。各取10μl的樣品，用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，剪下目的蛋白，室溫，在含有5%的脫脂牛奶中封閉1h。將蛋白與對應(yīng)的抗體在4℃孵育過夜。次日，將膜用洗膜液洗3次，15min/次。與相應(yīng)的標(biāo)記有辣根過氧化物酶的二抗室溫孵2h。用洗膜液洗膜3次，15min/次。最后用辣根過氧化物酶的底物與膜作用5min。用Image Quant LAS 4000 mini曝光蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism Software 7統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，兩組以上的數(shù)據(jù)差異用one way ANOVA進行分析，兩組數(shù)據(jù)之間的差異應(yīng)用student's t test分析。當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長春西汀對大鼠的氧化應(yīng)激影響 見表1～4。

表1 長春西汀對大鼠SOD的影響［U/mg，］

表1 長春西汀對大鼠SOD的影響［U/mg，］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

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表2 長春西汀對大鼠GPx的影響［U/mg，（］

表2 長春西汀對大鼠GPx的影響［U/mg，（］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

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表3 長春西汀對大鼠CAT的影響［U/mg，］

表3 長春西汀對大鼠CAT的影響［U/mg，］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

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表4 長春西汀對大鼠MDA的影響［nmol/mg，］

表4 長春西汀對大鼠MDA的影響［nmol/mg，］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

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2.2 長春西汀對大鼠腦細胞凋亡通路影響 Western Blot檢測結(jié)果，與模型組大鼠比較，長春西汀20mg/kg和40mg/kg組大鼠腦組織中Bax和Caspase 3的表達均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2的表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 長春西汀對大鼠腦水腫影響 腦稱重結(jié)果分析，與模型組大鼠比較，長春西汀20mg/kg和40mg/kg組大鼠腦組織含水量均顯著下降（P＜0.05），見表5。

表5 長春西汀對大鼠腦水腫影響［%，］

表5 長春西汀對大鼠腦水腫影響［%，］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

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3 討論

TBI后，繼發(fā)性損傷對組織的破壞性常較原發(fā)性損傷更為廣泛和嚴(yán)重，由自由基及脂質(zhì)過氧化引起的氧化應(yīng)激損傷是繼發(fā)性損傷中已被廣泛認(rèn)同的病理生理機制之一，TBI后短時間內(nèi)即可迅速產(chǎn)生大量的自由基，主要表現(xiàn)為對各種生物大分子的攻擊，造成了機體嚴(yán)重的損害［3］。腦組織含有豐富的脂肪酸，易被氧化，MDA是脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，消耗了相當(dāng)大比例的氧，并限制了抗氧化防御系統(tǒng)。由于其較高的代謝率和脂肪含量，腦組織對TBI損傷特別敏感，因此在繼發(fā)性TBI中會出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)功能障礙和死亡。繼發(fā)性的TBI常涉及創(chuàng)傷部位的細胞凋亡。Bcl-2（bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物）抑制細胞凋亡，Bax（Bcl2-Associated X的蛋白質(zhì)）促進細胞凋亡，TBI動物模型中Bcl-2水平下降，Bax水平升高［4］。Caspase 3是一種白細胞介素轉(zhuǎn)換酶，并被認(rèn)為是哺乳動物細胞凋亡和炎癥通路的主要效應(yīng)因子，是細胞凋亡活性的標(biāo)記物。

線粒體在正常生理條件下產(chǎn)生超氧陰離子自由基和過氧化氫（H2O2），這些不斷產(chǎn)生的活性氧（ROS）是由SOD、GSH-Px、CAT來負責(zé)清除的。SOD，催化超氧陰離子生成過氧化氫，然后被CAT或GSH-Px分解為水和氧氣。羥基自由基（-OH）可以通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生H2O2（H2O2+Fe2+的→-HO+Fe3++-OH）。其他小分子抗氧化劑，如谷胱甘肽（GSH），抗壞血酸，和α-生育酚，也參與清除自由基的清除。

大量動物實驗表明，TBI后機體的氧自由基反應(yīng)增強，創(chuàng)傷后過氧化脂質(zhì)的含量明顯增加，羰基蛋白水平亦明顯提高［5］。TBI動物模型研究也證實使用抗氧化劑能 夠減輕創(chuàng)傷后繼發(fā) TBI［6］。

本實驗研究了長春西汀對于重度TBI大鼠的保護機制。結(jié)果顯示，長春西汀能夠劑量依賴性的提高重度TBI大鼠的抗氧化能力，改善大鼠腦水腫程度，中劑量組（20mg/kg）和高劑量組（40mg/kg）與模型組比較具有顯著的治療效果。在腦細胞保護機制方面，長春西汀同樣劑量依賴性的改善了重度TBI大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase的水平，中劑量組（20mg/kg）和高劑量組（40mg/kg）與模型組比較分別顯著增加腦組織中Bcl-2的水平，減少Bax和Caspase 3水平?；诒緦嶒灁?shù)據(jù)，長春西汀的劑量為20mg/kg～40mg/kg時，對于重度TBI大鼠具有明顯的治療效果。

［1］ Kertmen H, Gürer B, Yilmaz ER, et al． Antioxidant and antiapoptotic effects of darbepoetin-α against traumatic brain injury in rats． Arch Med Sci,2015,11(5):1119-1128．

［2］ Wong DY,Krebsbach PH,Hollister SJ．Brain cortex regeneration affected by scaffold architectures．J Neurosurg,2008,109(4):715-22．［3］ Awasthi D,Church DF,Torbati D,et al．Oxidative stress following traumatic brain injury in rats．Surg Neurol,1997,47(6):575-581．

［4］ Wang Q,Zhang L,Yuan X,et al．The Relationship between the Bcl-2/Bax Proteins and the Mitochondria-Mediated Apoptosis Pathway in the Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells into Neurons．PLoS One,2016,11(10):e0163327．

［5］ Reed TT,Owen J,Pierce WM,et al．Proteomic identification of nitrated brain proteins in traumatic brain-injured rats treated postinjury with gamma-glutamylcysteine ethyl ester:insights into the role of elevation of glutathione as a potential therapeutic strategy for traumatic brain injury．J Neurosci Res,2009,87(2):408-417．

［6］ Hall ED,Vaishnav RA,Mustafa AG．Antioxidant therapies for traumatic brain injury． Neurotherapeutics,2010,7(1):51-61．