馮曉紅 黃 琦* 金若晨 陳 頡

糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展不僅與整體血糖水平有關(guān)，而且與血糖的波動(dòng)性也密切相關(guān)。波動(dòng)性高血糖導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥機(jī)制尚不明確，有研究顯示可能與血糖波動(dòng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激有關(guān)。波動(dòng)性高血糖比持續(xù)性高血糖產(chǎn)生更明顯的氧化應(yīng)激［1］。Nrf2/ARE信號通路是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路［2］。Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，HO-1、γ-GCS，是受其調(diào)控的下游抗氧化蛋白。本實(shí)驗(yàn)擬觀察波動(dòng)性高血糖糖尿病大鼠腎臟HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達(dá)的影響，探討波動(dòng)性高血糖危害的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件 健康雄性SPF級SD大鼠24只，體重160～180g，鼠齡6～8周，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12 h明暗交替，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 超短效胰島素諾和銳（丹麥諾和諾德）；鏈脲佐菌素（購自美國Sigma公司）；血糖試紙及血糖儀（德國羅氏）；自制高脂飼料：蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎(chǔ)飼料69.5%；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）試劑盒；HO-1、γ-GCS及Nrf2蛋白一抗（購自美國Abcam公司）。

1.3 模型建立 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組（N組，n=8）和糖尿病模型組（n=16）。普通飼料喂養(yǎng)組，高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病模型組大鼠組。2周后模型組予小劑量鏈脲佐菌素（STZ）35mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，測隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L為模型制作成功。將糖尿病模型組隨機(jī)分為穩(wěn)定高糖組（S組，n=8）和波動(dòng)性高糖組（F組，n=8），F(xiàn)組注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動(dòng)大鼠模型，N組及S組給予腹腔注射生理鹽水0.375 g/（kg·d）體重作為對照。F組每日8：00及15：00給予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/（kg·d），并分別于30 min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳1U，造成1d中血糖值大幅度波動(dòng)。喂養(yǎng)8周。

1.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有大鼠予10%水合氯醛1ml/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清液，測定SOD、MDA、ROS值（方法參照說明書）；處死大鼠后取腎臟組織，以10%中性甲醛液固定。HE染色，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。免疫組化測定HO-1、γ-GCS及 Nrf2的表達(dá)。PV法免疫組化染色，嚴(yán)格按照PV試劑盒說明書操作，DAB顯色，陽性顆粒呈棕黃色。應(yīng)用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色分析，測定HO-1、γ-GCS及 Nrf2陽性表達(dá)的平均光密度（OD值）。每個(gè)切片隨機(jī)測定5個(gè)視野的陽性O(shè)D值，取平均值作為該片的代表值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模后S組大鼠精神萎靡，行動(dòng)遲緩，對外界反應(yīng)遲鈍，毛色無光澤，易臟，進(jìn)食減少，飲水量、尿量增加，尿液腥臊味加重，多數(shù)大鼠體質(zhì)量明顯降低，F(xiàn)組較S組癥狀更明顯。

2.2 造模第4周大鼠血糖比較 見表1。

表1 造模第4周大鼠血糖比較［mmol/L，］

表1 造模第4周大鼠血糖比較［mmol/L，］

注：與N組比較，*P＜0.05

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2.3 各組大鼠血清指標(biāo)結(jié)果的比較 見表2。

表2 各組大鼠血清指標(biāo)結(jié)果的比較

表2 各組大鼠血清指標(biāo)結(jié)果的比較

注：與N組比較，*P＜0.05；與S組比較，#P＜0.05

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2.4 腎臟HE染色 N組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)未見明顯病變，S組腎小球細(xì)胞輕度增多，體積增大；F組腎小球毛細(xì)血管球萎縮，球囊增大，分葉明顯，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂。

2.5 大鼠腎臟組織HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達(dá)的比較 HO-1陽性表達(dá)腎小球胞漿，γ-GCS陽性表達(dá)主要分布于腎小球固有細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中，Nrf2蛋白陽性表達(dá)定位于腎小球固有細(xì)胞的胞漿和胞核，陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。見表3、圖1～3。

表3 大鼠腎臟組織HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達(dá)的比較（

表3 大鼠腎臟組織HO-1、γ-GCS及 Nrf2表達(dá)的比較（

注：與N組比較，*P＜0.05；與S組比較，#P＜0.05

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圖1 各組HO-1免疫組化染色情況

圖2 各組γ-GCS免疫組化染色情況

圖3 各組Nrf2免疫組化染色情況

3 討論

糖尿病的高血糖狀態(tài)可以分為慢性持續(xù)性高血糖和慢性波動(dòng)性高血糖兩種。慢性持續(xù)高血糖和波動(dòng)性高血糖對糖尿病的預(yù)后及慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［3］，而且糖尿病患者血糖波動(dòng)越大，慢性并發(fā)癥的發(fā)生率越高，預(yù)后越差。最近發(fā)現(xiàn)糖尿病發(fā)生的急性血糖波動(dòng)是觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)額外因素［4］，即血糖波動(dòng)更容易引發(fā)氧化應(yīng)激［5］。氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，導(dǎo)致活性氧（ROS）家族在機(jī)體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷。高血糖狀態(tài)下，長期的代謝失衡生成大量的ROS，可以通過激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）及氨基己糖等多種途徑和直接作用引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致血管病變產(chǎn)生并發(fā)癥。其中過氧化的脂質(zhì)降解后的產(chǎn)物MDA（丙二醛）可間接反映氧自由基對血管細(xì)胞的損傷程度。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)抗氧化防御體系被激活，有一種重要的抗氧化酶SOD，其具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，可清除超氧陰離子自由基，防止細(xì)胞損傷，故可反映機(jī)體的抗氧化能力。另外氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2 通過與抗氧化酶/蛋白基因上游中的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是迄今發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，Nrf2和其細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白Keap1發(fā)生分離，前者會向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)和活化，啟動(dòng)其下游多種抗氧化蛋白表達(dá)和Ⅱ相解毒酶的合成，如HO-1、γ-GCS，SOD等，減輕氧化應(yīng)激引起的損傷。波動(dòng)性高糖對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷情況下，HO-1作為一種重要的細(xì)胞保護(hù)蛋白其表達(dá)相應(yīng)地增高，但生理性的代償并不足以拮抗氧化應(yīng)激所帶來的細(xì)胞損傷。研究表明，誘導(dǎo)HO-1增加在抗氧化、抗高血壓、糖尿病和缺血再灌注腎保護(hù)中有積極作用［6］。γ-GCS 是抗氧化劑的重要屏障-谷胱甘肽合成過程中的限速酶，分為重鏈（γ-GCSHS）和輕鏈（γ-GCS-LS）兩個(gè)亞基，其數(shù)量、活性等直接影響抗氧化的水平。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是穩(wěn)定性高血糖還是波動(dòng)性高糖，均可導(dǎo)致SOD活力下降、MDA、ROS含量增加，大鼠腎臟HO-1，γ-GCS及Nrf2的表達(dá)均較正常組有所增加，相對于穩(wěn)定性高糖，波動(dòng)性高糖使上述變化更為顯著，說明波動(dòng)性高糖可使氧化-抗氧化失衡進(jìn)一步加劇，氧化應(yīng)激損傷加重。Nrf2可能是糖尿病腎病發(fā)病中抗氧化基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游抗氧化蛋白H0-1和γ-GCS參與了糖尿病腎病的抗氧化防御機(jī)制。

［1］ Ceriello A,Esposito K,Piconi L,et al．Oscillating glucose is more deleterious to endothelial function and oxidative stress than mean glucose in normal and type 2 diabetic patiens．Diabetes, 2008,57(5):1349-1354．

［2］ Kensler TW,Wakabayashi N,Biswal S．Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1－Nrf2－ARE pathway．Annu Rev Pharmacol Toxicol,2007,47(1): 89-116．

［3］ 王先令,陸菊明．血糖波動(dòng)對糖尿病預(yù)后及其慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的影響．國外醫(yī)學(xué):內(nèi)分泌學(xué)分冊,2005,25(3):169-171．

［4］ Yaqoob M,McCMland P,Patrick AW,et al．Evidence of oxidant injury and tubular damage in early diabetic nephropathy．QJM,1994, 87(10):601-607．

［5］ 李金榮,王瑞英,張松筠．NADPH氧化酶在糖尿病腎病中的作用．國際內(nèi)科學(xué)雜志,2009,36(2):93-97．

［6］ Cao J,Sodhi K,Inoue K,et al．Lentiviral-human heme oxygenase targeting endothelium improved vascular function in angiotensin II animal model of hypertension．Hum Gene Ther,2011,22(3):271-282．