蔣 璐 成伯寧*

辣椒素是從辣椒屬植物中得到的紅辣椒的活性成分，其特點為辛辣，是辣味的主要成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)式：H3CO（HO）-C6H3-CH2-NH-CO-（CH2）4=CHCH（CH3）2，即反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺；分子量305，屬酰胺類化合物。辣椒素純品呈單斜長方形片狀無色晶體，熔點65℃，沸點210℃～220℃，易溶于乙醇、乙醚、苯以及氯仿，微溶于二硫化碳。辣椒素具有多種藥理活性，如止痛［1］、降脂［2］、減肥［3］及抗腫瘤等作用，近年來國內(nèi)外研究結(jié)果表明，辣椒素對多種腫瘤細胞具有抑制生長和增殖的作用，祝麗麗等［4］研究表明，辣椒素可抑制結(jié)腸癌HT-29細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，誘導(dǎo)細胞凋亡。唐忠志等［5］報道，在體外辣椒素對人胃癌MKN-45細胞有明顯的抑制生長作用，并呈劑量、濃度依賴性。但辣椒素對食管癌EC109細胞是否具有抗腫瘤效果，目前研究較少，本課題從細胞增殖及凋亡角度，從體內(nèi)外探討辣椒素是否具有抗食管鱗狀細胞癌的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細胞 辣椒素（Santa Cruz公司）；CCK-8試劑盒與細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）；Tunnel凋亡試劑盒（Roche公司）；鼠源單克隆抗體Ki-67（Sigma公司）；人食管癌EC109細胞株購自ATCC。

1.2 辣椒素的配制與細胞培養(yǎng) 將辣椒素溶解在乙醇中，配成300μmol/L的溶液，置于-20℃冰箱保存。臨用時，以完全培養(yǎng)液稀釋辣椒素至所需濃度。對照組培養(yǎng)液為含體積分數(shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。EC109細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期的EC109細胞，經(jīng)胰酶消化后吹打成單細胞懸液，調(diào)整濃度為1×104個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml，24h后分別加入含濃度依次為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg辣椒素的培養(yǎng)液，并設(shè)置對照組，其他濃度者為實驗組。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔各加入10μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在450nm波長處測定吸光度（A），參比波長為600nm。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組A450值-空白調(diào)零組A450值）/（對照組A450值-空白調(diào)零組A450值）×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布 將對數(shù)生長期EC109細胞以4×105個細胞數(shù)接種于6孔板中，當(dāng)細胞滿80%時，不同濃度的辣椒素（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）處理細胞48h，同時設(shè)對照組，藥物處理后，用胰酶消化，制成單細胞懸液，以PBS緩沖液清洗2次，用70% 冷乙醇4℃固定過夜。300r/min離心10min去除乙醇固定液，冷PBS沖洗細胞3次，加入終濃度為80mg/ml的RNase A，37℃反應(yīng)30min；細胞冰凍10 min，然后加入50 mg/ml PI，室溫避光反應(yīng)1h后，流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488nm發(fā)射波長530nm，實驗重復(fù)3次，Cell quest軟件分析。

1.5 食管鱗狀細胞癌EC109細胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 將4×106個EC109細胞懸浮于0.2ml含有25%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，注射至裸鼠背部靠近右側(cè)后肢皮下，建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型。接種4～5周后，待移植瘤體積長至100～150mm3，將裸鼠按腫瘤體積大小排序并隨機區(qū)組設(shè)計分成4組：生理鹽水（0.2ml/只）組、低劑量（5mg/kg）組、中劑量組（10mg/kg）、高劑量組（20mg/kg），每組各15只。各組均采用腹腔注射給藥，藥物注射的最終體積為0.2ml/只，分組當(dāng)天開始腹腔注射給藥，1次/3d，共11次；給藥期間每周使用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的長（A）、寬（B）和高（C），估算腫瘤近似體積［V=π（A×B×C）/6］；給藥結(jié)束后1周，用10%水合氯醛麻醉裸鼠，取出皮下移植瘤稱重，并測量腫瘤體積。

1.6 TUNNEL法檢測各組移植瘤內(nèi)細胞凋亡情況 取出制備好的石蠟切片。對各組標本的同一橫截面進行連續(xù)切片，所得石蠟切片進行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，按照Tunel試劑盒所示的操作步驟進行操作；Tunel染色后陽性細胞的鏡下表現(xiàn)為細胞核染成棕褐色，胞核固縮，染色質(zhì)濃縮，而胞漿不著色；在高倍鏡下（OLYMPUS BX51，400×）隨機選擇10個視野，圖片經(jīng)Image-pro plus 6軟件處理分析后，陽性細胞比例采用累積吸光值（IOD）表示，吸光值越大表明凋亡細胞數(shù)越多。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測各組瘤體內(nèi)Ki-67的陽性表達指數(shù) 石蠟切片常規(guī)脫臘水化，0.3% H2O2封閉，微波抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，Ki-67抗體室溫20min；4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌三次，滴加HRP標記的二抗37℃ 30min，PBS 再次洗滌三次，DAB 顯色3-5min，沖洗后蘇木素復(fù)染，流水沖洗返藍后脫水封。圖片結(jié)果用Ipp-6圖像處理軟件進行分析平均光密度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的辣椒素對食管鱗狀細胞癌EC109細胞增殖抑制情況 不同濃度辣椒素（5、10、20mg/kg）處理食管鱗狀細胞癌EC109細胞48h，CCK-8法檢測細胞增殖情況如圖1所示：低劑量組EC109細胞存活率為（88.45±7.45）%；中劑量組EC109細胞存活率為（75.41±6.75）%；高劑量組EC109細胞存活率為（62.27±5.37）%；均具有明顯的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴現(xiàn)象。

圖1 不同濃度的辣椒素對食管鱗狀細胞癌EC109細胞增殖抑制情況

2.2 不同濃度的辣椒素對食管鱗狀細胞癌EC109細胞周期的影響 不同濃度辣椒素處理食管鱗狀細胞癌EC109細胞48h，流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布如圖2所示：對照組G0/G1比例為（58.61±4.25）%；低 劑量組G0/G1比例為（69.32±5.05）%；中劑量 組G0/G1比例為（77.18±4.74）%；高劑量組G0/G1比 例 為（91.02±5.34）%；對 照 組 G2/M+S比 例 為（41.39±4.37）%；低 劑 量 組G2/M+S比例 為（30.68±4.75）%；中 劑 量 組G2/M+S比 例為（22.82±5.96）%；高 劑 量 組G2/M+S比 例 為（8.98±4.62）%。G2/M%+S%反映了細胞增殖能力，由此可見辣椒素通過改變EC109細胞周期的分布，抑制細胞增殖作用。

圖2 不同濃度的辣椒素對食管鱗狀細胞癌EC109細胞周期的影響

2.3 各組裸鼠皮下移植瘤瘤體體積變化情況 食管鱗狀細胞癌EC109細胞裸鼠皮下移植瘤接種第四周（28d）開始隨機分組藥物處理，如圖3所示：藥物處理前各組裸鼠皮下移植瘤體積無明顯差異（P＞0.05）；給藥的過程中，各組之間差異性逐漸明顯，給藥結(jié)束后1周測量瘤體體積，對照組為（1.36±0.24）cm3；低劑量組為（0.91±0.21）cm3，抑瘤率為0.33%；中劑量組為（0.73±0.18）cm3，抑瘤率為0.46%；中劑量組為（0.39±0.13）cm3，抑瘤率為0.71%；辣椒素對EC109細胞具有抑制瘤體生長的作用，其抑制效果呈現(xiàn)明顯的濃度依賴現(xiàn)象。

圖3 各組裸鼠皮下移植瘤瘤體體積變化情況

2.4 Tunnel法檢測瘤體內(nèi)細胞凋亡情況 與對照組IOD值為（28.3±2.16）相比較，低劑量組組IOD值為（43.1±2.81），中劑量組IOD值為（63.4±3.12），高劑量組IOD值為（107.3±7.31），可見對照組細胞核少數(shù)陽性表達，低劑量組細胞核陽性表達明顯增多，高劑量組最明顯；免疫組化法檢測各組瘤體內(nèi)Ki-67的陽性表達，Ki-67是細胞的核增生抗原，反應(yīng)細胞增生情況，如圖4所示：對照組陽性率較高，表明增生活躍，隨著辣椒素濃度的遞增，胞核陽性率表達明顯降低，高劑量組只有少數(shù)細胞核有陽性表達。

圖4 Tunnel法檢測瘤體內(nèi)細胞凋亡情況﹑免疫組化法檢測各組瘤體內(nèi)Ki-67的陽性表達

3 討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，以鱗癌為主，腺癌發(fā)病率未見明顯增高趨勢［6］，目前新發(fā)病例中，＞90%為鱗癌，食管癌已成為我國衛(wèi)生部確定的十大特色腫瘤之一。根治性手術(shù)是食管癌最有效的治療手段，患者一旦出現(xiàn)吞咽困難等臨床癥狀時，絕大多數(shù)已屬于晚期，錯過根治性手術(shù)機會；放療是晚期食管鱗癌及上段鱗癌最重要的治療手段，但由于放療劑量的要求及放療相關(guān)性損傷的存在，明顯限制了放射性治療的應(yīng)用，食管鱗癌對化療欠敏感，且其毒副作用較大，應(yīng)用有限。

辣椒素是紅辣椒中主要成分之一，來源廣泛，并且毒副作用較小，已有研究表明，辣椒素具有抗直腸癌、胃癌等作用，但辣椒素抗食管鱗癌的相關(guān)研究較少，本課題旨在探討辣椒素是否對食管鱗癌具有抗腫瘤作用，首先在體外運用CCK-8、流式細胞術(shù)等技術(shù)，檢測不同濃度辣椒素處理后對食管鱗癌在細胞增殖及細胞周期的方面的影響，發(fā)現(xiàn)辣椒素具有抑制食管鱗癌EC109細胞增殖的作用，也可擾亂細胞的正常周期，使G0/G1期細胞數(shù)目相應(yīng)增加，并均具有濃度依賴性。為進一步探討辣椒素抗食管鱗癌的作用，課題組建立了食管鱗癌EC109細胞的裸鼠皮下移植瘤動物模型，測量瘤體體積，計算抑瘤率，發(fā)現(xiàn)辣椒素具有抑制瘤體生長的作用。

Tunnel法［7］，即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標記測定法，也稱DNA 斷裂的原位末端標記法，這一方法能對DNA分子斷裂缺口中的3'-OH進行原位標記，DNA分子斷裂缺口的暴露意味細胞凋亡的增加，本課題運用Tunnel法發(fā)現(xiàn)辣椒素具有促進瘤體內(nèi)EC109細胞的凋亡；Ki-67是表達于核表面與增生相關(guān)的抗原，其表達量的增加表明細胞增生活躍［8］；課題組運用Tunnel法及Ki-67的檢測，發(fā)現(xiàn)辣椒素對EC109細胞裸鼠皮下移植瘤具有增殖抑制作用，及凋亡促進作用。

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