劉伯洋，李利軍，程 昊，黃文藝，馮 軍，孔紅星,*

分子印跡固相萃取技術(shù)對(duì)六堡茶中表兒茶素的分離特性

劉伯洋1，李利軍1，程 昊1，黃文藝1，馮 軍2，孔紅星1,*

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 柳州 545005）

以表兒茶素為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，通過(guò)原位聚合法制備分子印跡聚合物。首先考察不同模板分子、功能單體、交聯(lián)劑比例條件下表兒茶素分子印跡聚合物的特異性吸附能力。結(jié)果表明表兒茶素與丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯物質(zhì)的量比為1∶6∶40時(shí)，分子印跡聚合物的吸附效果最佳，其模板分子回收率KMIPs為84.62%，特異性識(shí)別因子Q為4.55；然后利用掃描電子顯微鏡和紅外光譜技術(shù)對(duì)制備的印跡聚合材料進(jìn)行表征；最后在毛細(xì)管電泳最優(yōu)條件下對(duì)加載過(guò)固相萃取柱的過(guò)柱液與洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，建立分子印跡固相萃取-毛細(xì)管電泳聯(lián)用檢測(cè)表兒茶素的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子印跡聚合物成功聚合，形貌良好且具有專(zhuān)一吸附特性。該方法適用于六堡茶中表兒茶素的檢測(cè)。

分子印跡；表兒茶素；固相萃?。幻?xì)管電泳

六堡茶是中國(guó)千年名茶，屬黑茶類(lèi)，因原產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)梧州市蒼梧縣六堡鄉(xiāng)而得名。表兒茶素是六堡茶葉中主要活性成分之一，約占兒茶素含量的40%～50%。研究表明，表兒茶素具有防治心血管疾病[1]、預(yù)防癌癥、抗氧化[2-3]等生物活性作用。尋找合適方法分離與測(cè)定六堡茶中表兒茶素，已經(jīng)成為廣西本地茶資源推廣的重要考量依據(jù)。目前檢測(cè)表兒茶素的方法主要有高效液相色譜法[4-5]、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[6]等，但這些方法普遍存在預(yù)處理步驟復(fù)雜、檢測(cè)出樣品峰受雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重或無(wú)法檢測(cè)出峰等缺點(diǎn)。

分子印跡固相萃?。╩olecularly imprinted solidphase extraction，MISPE）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型SPE技術(shù)。通過(guò)化學(xué)方法合成分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs），利用印跡分子對(duì)實(shí)際樣品中某一特定分子具有特異性識(shí)別機(jī)理的特性，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行選擇性分離。在MISPE過(guò)程中，模板分子會(huì)與MIPs中特定大小與形狀的空穴相結(jié)合，從而將目標(biāo)分子保留在SPE柱內(nèi)，然后將其洗脫下來(lái)，此時(shí)洗脫液中僅含有模板分子，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)分子純化的效果。與傳統(tǒng)SPE法相比，MIPs對(duì)模板分子擁有較好的吸附性與選擇性，可以在復(fù)雜體系中選擇性吸附目標(biāo)分子并將其更穩(wěn)定的保存至柱內(nèi)，只有使用較強(qiáng)洗脫效果的洗脫溶液才能將目標(biāo)分子從MIPs上洗脫下來(lái)。這種選擇性吸附特性在天然活性物質(zhì)分離領(lǐng)域內(nèi)顯示出良好的應(yīng)用前景[7-13]。本實(shí)驗(yàn)采用原位聚合法制備表兒茶素MIPs，建立一種新的MISPE-CE聯(lián)用檢測(cè)方法以降低雜質(zhì)峰干擾，從而更好的對(duì)六堡茶中表兒茶素進(jìn)行分離與測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六堡茶 市購(gòu)；表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）（用前重結(jié)晶除阻聚劑）、偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN） 上海阿拉丁試劑有限公司；丙烯酰胺（azobisisobutyronitrile，AM），甲醇、乙醇、冰乙酸、正丙醇、1,4-丁二醇（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACS2000型高效CE儀（正、負(fù)電源，電壓0～30 kV可調(diào)，未涂層熔融石英毛細(xì)管（50 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度36 cm）） 北京彩陸科學(xué)儀器有限公司；UV-2102PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AR124CN電子天平 上海奧豪斯有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DL-60D超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；傅里葉變換紅外分光光度計(jì) 上海珀金埃爾默儀器有限公司；HV 04-55場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國(guó)蔡司公司；ZFD-A5040A全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表兒茶素MIPs的制備

采用原位聚合法合成表兒茶素MIPs：以表兒茶素為模板分子，AM為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，正丙醇與1,4-丁二醇混合溶液為致孔劑，分別按不同比例制備MIPs，如表1所示。

表1 制備表兒茶素MIPs的物料組成Table1 Chemicals used for making L-epicatechin MIPPss

以P3為例，稱取0.007 23 g（0.002 5 mmol）表兒茶素溶于正丙醇與1,4-丁二醇混合溶液中，加入0.010 8 g（0.15 mmol）AM，將混合溶液置于振蕩器中振蕩0.5 h，使AM與表兒茶素在溶劑中充分混合溶解，然后加入189 μL（1 mmol）EGDMA與1 mg（0.6 mmol）AIBN，將混合溶液放入超聲波清洗器中，在30 ℃條件下超聲脫氣20 min，然后用移液槍取80 μL混合溶液至200 μL移液槍槍頭中，充氮除氧10 min，密封槍頭兩端。將處理好的槍頭放入55 ℃恒溫水浴鍋中加熱24 h，加熱結(jié)束后取出槍頭得到圖1A所示的MISPE小柱，槍頭前端白色固體即為MIPs。將注射器與SPE小柱相連接如圖1B所示，用甲醇-冰乙酸（9∶1，V/V）混合溶液沖洗聚合物以去除MIPs中的模板分子，至洗脫液中檢測(cè)不到模板分子時(shí)停止洗脫。再用甲醇溶液對(duì)其進(jìn)行二次洗脫，以除去殘留在萃取柱上的冰乙酸。最后將其放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)60 ℃真空干燥24 h，將得到的聚合物槍頭放入干燥器中備用。

圖1 SPE柱效果圖Fig. 1 Solid phase extraction column

作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，非印跡聚合物（non-molecularly imprinted polymers，NMIP）在無(wú)模板分子存在條件下利用相同條件制備。

1.3.2 MIPs與NMIP模板分子回收率實(shí)驗(yàn)

采用SPE-CE法評(píng)價(jià)聚合物對(duì)模板分子的回收率。取制備好的P1、P2、P3、P4與NP1、NP2、NP3、NP4（NP為與聚合物P相對(duì)應(yīng)的非印記聚合物）8 根SPE柱，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將相同體積與物質(zhì)的量的表兒茶素溶液加載至各組SPE柱上端，使用甲醇與冰乙酸對(duì)SPE柱進(jìn)行洗脫，最終得到8 組洗脫液。將各組洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至干，然后用甲醇定容至初始體積，最后利用CE技術(shù)檢測(cè)8 組洗脫液中表兒茶素的物質(zhì)的量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前后溶液中表兒茶素物質(zhì)的量的變化可計(jì)算聚合物模板分子回收率與特異性識(shí)別因子（Q）。

模板分子回收率按公式（1）計(jì)算：

式中：K為模板分子回收率/%；Cp為經(jīng)過(guò)萃取柱后洗脫溶液中所含表兒茶素的物質(zhì)的量/mol；Cc為表兒茶素在溶液中的物質(zhì)的量/mol。

特異性識(shí)別因子（Q）按公式（2）計(jì)算：

式中：Q為特異性識(shí)別因子；KMIPs為MIPs對(duì)模板分子的回收率/%；KNMIP為NMIP對(duì)模板分子的回收率/%。

電泳條件：將相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]與實(shí)際效果結(jié)合分析，得到CE檢測(cè)最佳條件。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度25 ℃，重力進(jìn)樣，進(jìn)樣高度15 cm，進(jìn)樣時(shí)間25 s，分離電壓－20 kV，于波長(zhǎng)230 nm處直接檢測(cè)。背景緩沖液為30 mmol/L磷酸鹽的混合體系＋0.05 mmol/L CTAB＋12.5%乙腈混合溶液，pH值為10.0。

1.3.3 聚合物結(jié)構(gòu)與形貌表征

利用傅里葉變換紅外分光光度計(jì)對(duì)表兒茶素MIPs結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。取1 mg待測(cè)物質(zhì)與100 mg KBr混合壓片，在500～4 000 cm－1光譜范圍內(nèi)分別對(duì)MIPs、NMIP與AM 3 種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)槍頭狀的MISPE柱水平切面，經(jīng)噴金處理后進(jìn)行電子顯微鏡掃描，以考察柱內(nèi)聚合物的形貌。

1.3.4 MIPs選擇性能實(shí)驗(yàn)

配制甲醇為溶劑，濃度為0.1 mmol/L的表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，置于5 mL的離心管中，通過(guò)超聲除氣裝置將其混勻并脫氣。將混合溶液加載至SPE柱上端，收集過(guò)柱液，然后用甲醇淋洗萃取柱并收集淋洗液，再用甲醇-乙酸（9∶1，V/V）混合溶液對(duì)萃取柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。過(guò)柱液、淋洗液與洗脫液分別在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至干，最后用甲醇定容至相同容積，再在電泳最優(yōu)條件下分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 樣品處理

將六堡茶干茶葉放入中藥材粉碎機(jī)粉碎至粉末。取出適量茶葉粉末溶于乙醇溶劑，在85 ℃水浴條件下索氏提取4 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將提取液倒入蒸發(fā)皿中，放入烘箱烘干備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合條件優(yōu)化

圖2 表兒茶素分子印跡過(guò)程示意圖Fig. 2 Schematic illustration of molecularly imprinting of L-epicatechin

表兒茶素MISPE柱的特異性吸附性能與聚合物的組成、比例等條件密切相關(guān)。對(duì)模板分子而言，選擇合適功能單體是直接影響SPE柱吸附性能的關(guān)鍵。如圖2所示，由于表兒茶素分子中4 個(gè)羥基基團(tuán)都可以形成氫鍵位點(diǎn)，而AM中含有的羰基基團(tuán)，易與表兒茶素分子中的多個(gè)羥基基團(tuán)以氫鍵相結(jié)合，因此選用表兒茶素作為模板分子，AM作為功能單體，并對(duì)模板分子、功能單體與交聯(lián)劑之間的配比進(jìn)行優(yōu)化與考察，以改善聚合物吸附及選擇性能。有文獻(xiàn)[17-25]報(bào)道，模板分子和功能單體比例一般為1∶4或1∶6，因?yàn)樵诖吮壤龡l件下模板分子和功能單體的結(jié)合量最大。為了考察模板分子、功能單體、交聯(lián)劑間配比對(duì)模板分子回收率的影響，對(duì)制備的8 種聚合物進(jìn)行回收率分析，如表2所示。由于表兒茶素含有多個(gè)羥基，即單個(gè)分子能與功能單體作用的識(shí)別位點(diǎn)較多，所以需要功能單體的量也比較多，但是功能單體量太大則會(huì)增加聚合物非特異性吸附能力，降低SPE柱選擇吸附性能。表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，按P3比例制備的MIPs回收率最高，且特異性識(shí)別因子P3的值最大，說(shuō)明聚合物特異性吸附作用力最強(qiáng)，非特異性吸附的影響最小。因此本實(shí)驗(yàn)選用模板分子、功能單體與交聯(lián)劑物質(zhì)的量比例為1∶6∶40作為MIPs制備最優(yōu)條件。

表2 不同比例對(duì)聚合物模板分子回收率的影響Table2 Effect of template to functional monomer to cross-linking agent ratio on template recovery

2.2 MIPs形態(tài)結(jié)構(gòu)表征

圖3 聚合物紅外光譜圖Fig. 3 IR spectra of molecularly imprinted and non-imprinted polymers

如圖3所示，AM特征峰在3 351.67、1 692.94 cm－1和1 612.68 cm－1處，這3 個(gè)吸收峰分別代表AM中N—H、C＝O和C＝C基團(tuán)。由圖3a可知，MIPs的C＝O基團(tuán)特征峰在1 730.31 cm－1處，說(shuō)明該聚合物已通過(guò)EGDMA與AM成功聚合。NMIP的C＝O基團(tuán)特征峰在1 632.93 cm－1處，比MIPs特征峰值低，這是因?yàn)镸IPs中的C＝O基團(tuán)受到了模板分子與功能單體之間氫健作用的影響。圖3a中3 451.95 cm－1處寬峰代表功能單體AM中N—H基團(tuán)不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，而1 454.54 cm－1處的吸收峰則是不對(duì)稱酯中C—O基團(tuán)。這些結(jié)果都可以表明MIPs已經(jīng)成功制備。

圖4 MIPs掃描電鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of the molecularly imprinted polymer

在最優(yōu)比例條件下所制備聚合物，通過(guò)掃描電鏡對(duì)聚合物的形貌進(jìn)行表征，如圖4所示。聚合物呈顆粒狀疊加在一起，且擁有疏松多孔、分散性均一的特點(diǎn)，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使MIPs在SPE過(guò)程中具有較大比表面積與較低流動(dòng)阻力，這些優(yōu)點(diǎn)有助于增強(qiáng)其在樣品中特異性吸附性能。

2.3 MIPs選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

為近一步研究MIPs在SPE過(guò)程中選擇特性，本實(shí)驗(yàn)選用濃度0.1 mmol/L表兒茶素與表兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，其結(jié)構(gòu)式如圖5所示。對(duì)該混合溶液進(jìn)行SPE實(shí)驗(yàn)，如圖6所示。

圖5 表兒茶素（A）與表兒茶素沒(méi)食子酸酯（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 5 Structures of L-epicatechin (A) and epicatechin-gallate (B)

圖6 MISPE過(guò)程中物混合溶液的CCEE圖Fig. 6 Capillary electropherograms of mixed solutions obtained during molecularly imprinted solid phase extraction

圖6 a表明，在最優(yōu)電泳條件下混合溶液中表兒茶素與表兒茶素沒(méi)食子酸酯完全分離，峰形良好；在圖6b中，經(jīng)過(guò)MISPE柱后過(guò)柱液僅檢測(cè)出小部分表兒茶素沒(méi)食子酸酯，這是因?yàn)楸韮翰杷嘏c大部分表兒茶素沒(méi)食子酸酯已經(jīng)吸附在MIPs上，沒(méi)有隨過(guò)柱液流出；SPE柱經(jīng)甲醇淋洗后，淋洗液中僅能檢測(cè)到表兒茶素沒(méi)食子酸酯（圖6c）；采用更強(qiáng)洗脫能力的甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液對(duì)SPE柱進(jìn)行洗脫后，表兒茶素成功被洗脫下來(lái)如圖6d所示，模板分子在該洗脫溶劑條件下的回收率達(dá)到84.62%。比較混合溶液中2 種物質(zhì)結(jié)構(gòu)式（圖5）不難發(fā)現(xiàn)，表兒茶素沒(méi)食子酸酯空間體積遠(yuǎn)大于表兒茶素，所以不容易進(jìn)入以表兒茶素為模板分子合成的MIPs孔穴中。而由圖6b可知，部分表兒茶素沒(méi)食子酸酯吸附在MIPs上，這是因?yàn)镾PE柱本身具有非特異性吸附作用，但這種弱吸附作用很容易被淋洗下來(lái)。因?yàn)楸韮翰杷厥俏皆谔囟ㄐ蚊才c大小的印跡孔穴內(nèi)，所以只有采用更強(qiáng)效果洗脫液才能將其洗脫下來(lái)。MIPs對(duì)不同分子具有不同的吸附能力，這種吸附特性使得表兒茶素分子在MISPE過(guò)程中被特異性吸附在SPE柱上，再經(jīng)洗脫液流出，從而達(dá)到對(duì)復(fù)雜樣品中目標(biāo)分子的純化作用。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

圖7 六堡茶樣品過(guò)柱前后CE圖Fig. 7 CE chromatogram of L-picatechin before and after MISPE

為了驗(yàn)證表兒茶素MISPE柱在實(shí)際樣品中選擇特性，對(duì)六堡茶樣品進(jìn)行CE檢測(cè)。配制甲醇作溶劑0.1 mmol/L樣品溶液在最優(yōu)電泳條件下檢測(cè)，如圖7所示。由于六堡茶成分復(fù)雜，所以在圖7a中表兒茶素色譜峰周?chē)嬖诤芏嚯s峰。而在過(guò)柱洗脫液中這些雜峰在很大程度上減弱甚至消失（圖7b）。這說(shuō)明表兒茶素MISPE柱特異性吸附能力較強(qiáng)，有效分離出表兒茶素分子，從而較好避免實(shí)際樣品中雜質(zhì)峰的干擾，且具備較高模板分子回收率。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用原位聚合法在移液槍頭中制備表兒茶素MIPs。對(duì)不同組成比例MIPs與NMIP的模板分子回收率進(jìn)行了對(duì)比分析。并對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)與形貌進(jìn)行表征，同時(shí)對(duì)多種溶質(zhì)混合物與實(shí)際樣品進(jìn)行SPE實(shí)驗(yàn)，所得到的過(guò)柱液、淋洗液與洗脫液利用CE技術(shù)進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果表明MISPE柱對(duì)表兒茶素具有專(zhuān)一吸附特性。本實(shí)驗(yàn)制備方法操作簡(jiǎn)單，使用原位聚合技術(shù)免去了傳統(tǒng)本體聚合技術(shù)中研磨聚合物與裝填萃取柱步驟，保證了聚合物形貌不被破壞，所制備的SPE柱可以多次重復(fù)使用，同時(shí)也為六堡茶中表兒茶素的檢測(cè)提供了一種新方法。

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Separation of L-Epicatechin in Liubao Tea by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction

LIU Boyang1, LI Lijun1, CHENG Hao1, HUANG Wenyi1, FENG Jun2, KONG Hongxing1,*
(1. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, College of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545006, China; 2. College of Medical, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545005, China)

Molecularly imprinted polymers (MIPs) were synthesized by in situ polymerization using L-epicatechin as the template molecule, acrylamide (AM) as the functional monomer, azobisisobutyronitrile (AIBN) as the initiator, and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the cross-linking agent. Firstly, the specific adsorption capacity of L-epicatechin MIPs was evaluated as a function of the proportions of template molecule, functional monomer, and cross-linking agent. The results showed that when the molar ratio of L-epicatechin to acrylamide to ethylene glycol dimethacrylate was 1:6:40, MIPs exhibited the best adsorption capacity, with template molecule recovery (KMIPs) of 84.62% and specific recognition factor (Q) of 4.55. Scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) were used to characterize the MIPs. Finally, we used capillary electrophoresis to detect the effluent and the eluate under optimum conditions. As a result, a molecularly imprinted solid phase extraction-capillary electrophoresis (MISPE-CE) method for the determination of L-epicatechin was developed. The experimental results showed that molecularly imprinted polymers were successfully synthesized with good morphology and specific adsorption characteristics. This method is feasible for the analysis of L-epicatechin in Liubao tea.

molecular imprinting; L-epicatechin; solid phase extraction; capillary electrophoresis

10.7506/spkx1002-6630-201702027

O658

A

1002-6630（2017）02-0164-06

劉伯洋, 李利軍, 程昊, 等. 分子印跡固相萃取技術(shù)對(duì)六堡茶中表兒茶素的分離特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 164-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702027. http://www.spkx.net.cn

LIU Boyang, LI Lijun, CHENG Hao, et al. Separation of L-epicatechin in Liubao tea by molecularly imprinted solid phase extraction[J]. Food Science, 2017, 38(2): 164-169. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702027. http://www.spkx.net.cn

2016-03-30

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFAA118402）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃資助項(xiàng)目

劉伯洋（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿佑≯E技術(shù)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。E-mail：www.lby746129579@qq.com

*通信作者：孔紅星（1967—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)榉治鰷y(cè)試技術(shù)與糖資源綜合利用。E-mail：khx100@sina.com