吳小芳，陸建林

順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528000

兩種擴(kuò)增儀對(duì)聯(lián)合毛細(xì)管電泳技術(shù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的影響

吳小芳，陸建林

順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528000

目的使用兩種擴(kuò)增儀進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳，觀察兩種擴(kuò)增儀對(duì)結(jié)果的影響以及有何不同。方法運(yùn)用PowerPlex試劑盒對(duì)DNA在Applied Biosystems 9700和Hema 9700兩種擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增包括對(duì)血卡進(jìn)行直接擴(kuò)增和對(duì)提取后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后在Applied Biosystems 3130XL上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)；使用同一DNA進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)增儀的穩(wěn)定性檢測(cè)；使用7種非人樣本DNA進(jìn)行種屬特異性檢測(cè)；運(yùn)用不同稀釋度的2800陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)；對(duì)使用兩種擴(kuò)增儀擴(kuò)增檢測(cè)后的所有結(jié)果進(jìn)行分析、討論和評(píng)價(jià)。結(jié)果使用兩種擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)后，其分型結(jié)果在兩種擴(kuò)增儀之間沒(méi)有明顯差別，其分型結(jié)果均穩(wěn)定準(zhǔn)確且在兩種擴(kuò)增儀上呈現(xiàn)一致性，種屬特異性檢測(cè)結(jié)果一致，靈敏度檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論兩種擴(kuò)增儀在進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，其結(jié)果在兩種擴(kuò)增儀之間沒(méi)有明顯差別，其結(jié)果呈現(xiàn)出一致性，兩種擴(kuò)增儀均可應(yīng)用于常規(guī)擴(kuò)增。

擴(kuò)增儀；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；毛細(xì)管電泳；分型

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，聚合酶連反應(yīng)（PCR）技術(shù)可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，能將微量的DNA大幅增加［1］。目前，常規(guī)檢測(cè)步驟包括DNA提取、定量、復(fù)合STR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)等已經(jīng)成為廣大實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，使用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行復(fù)合STR擴(kuò)增則是其中至關(guān)重要的一步［2］，而PCR儀器的發(fā)展中PCR溫度循環(huán)至關(guān)重要，PCR擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確無(wú)誤，DNA聚合酶以及快速升/降溫速率的PCR擴(kuò)增儀［3］的出現(xiàn)，使快速PCR技術(shù)在各科研實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用成為可能。國(guó)內(nèi)許多研究文獻(xiàn)均局限于舊式的PCR擴(kuò)增儀，隨著科技的發(fā)展，新型的PCR擴(kuò)增儀層出不窮，國(guó)內(nèi)外多家公司均有推出不同類(lèi)型的PCR擴(kuò)增儀，而國(guó)內(nèi)外不同擴(kuò)增儀之間結(jié)果有何不同的相關(guān)研究卻很局限，所以本文針對(duì)在國(guó)內(nèi)外具有代表性的Applied Biosystems公司的9700 PCR擴(kuò)增儀和黑馬公司的Hema 9700PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，通過(guò)血卡直接擴(kuò)增［4-6］和DNA擴(kuò)增，對(duì)兩種擴(kuò)增儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)來(lái)評(píng)估不同擴(kuò)增儀對(duì)最終分型結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

志愿者靜脈血卡60份，類(lèi)人猿、猴、羊、豬、兔、鼠、狗的DNA各2份[7-8]，樣本DNA50份。

1.2 主要試劑和儀器

PowerPlex?21試劑盒［9］（Promega，美國(guó)），ABI 9700擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，美國(guó)），Hema 9700擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）ABI 3130XL遺傳分析儀（Applied Biosystems，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 DNA擴(kuò)增PowerPlex?21擴(kuò)增體系：Master Mix 5μL，Primer Mix 5μL，滅菌水13μL，模板DNA2μL。擴(kuò)增程序：96℃1 min，94℃10 s，59℃1 min，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；60℃延伸10 min；25℃保

存［10］。

1.3.2 直接擴(kuò)增PowerPlex?21擴(kuò)增體系：Master Mix 5μL，Primer Mix 5μL，滅菌水15μL，0.5 mm血卡。擴(kuò)增程序：72℃20 min，96℃1 min，94℃10 s，59℃1 min，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；60℃延伸10 min；25℃保存［10］。

1.3.3 穩(wěn)定性擴(kuò)增同一份DNA（編號(hào)D7）參照DNA擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序重復(fù)擴(kuò)增5次，同1份血卡（編號(hào)F3）參照直接擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序重復(fù)直接擴(kuò)增5次［11］。

1.3.4 種屬特異性擴(kuò)增使用類(lèi)人猿、猴、羊、豬、兔、鼠、狗的DNA參照DNA擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.5 靈敏度擴(kuò)增使用濃度分別為1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 ng/μL［12］的2800樣本參照DNA擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.6 電泳檢測(cè)擴(kuò)增后使用ABI 3130XL型分析儀進(jìn)行檢測(cè)，電泳檢測(cè)時(shí)，PowerPlex?21試劑盒上樣混合物為10μL甲酰胺和2μL ILS500混勻?yàn)?2μL，加入1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物或ladder，具體操作參照PowerPlex?21試劑盒使用說(shuō)明。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析所得DNA檢測(cè)圖譜獲得13個(gè)基因座以上正確分型且各等位基因峰高高于50RFUs為有效分型[13-14]，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果按照同一基因座出現(xiàn)該峰2次以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)原則進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［15］。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 DNA擴(kuò)增

對(duì)50份樣本DNA使用PowerPlex?21的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，共獲得1534個(gè)STR等位基因，所有DNA在兩臺(tái)擴(kuò)增儀擴(kuò)增后均獲得良好分型結(jié)果，準(zhǔn)確性均為100％，同一份樣品擴(kuò)增檢測(cè)后，其峰高和峰面積在兩臺(tái)擴(kuò)增儀間無(wú)明顯差異（圖1）。

2.2 直接擴(kuò)增

對(duì)60份志愿者靜脈血卡使用PowerPlex?21的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行直接擴(kuò)增，然后使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，共獲得1875個(gè)STR等位基因，所有血卡在兩臺(tái)擴(kuò)增儀擴(kuò)增后均獲得良好均衡的分型結(jié)果，準(zhǔn)確性均為100％，同一份樣品擴(kuò)增檢測(cè)后，其峰高和峰面積在兩臺(tái)擴(kuò)增儀間無(wú)明顯差異（圖2）。

2.3 穩(wěn)定性檢測(cè)

使用PowerPlex?21的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)ν环軩NA（編號(hào)D7）重復(fù)擴(kuò)增5次，然后使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，其峰高峰面積在兩臺(tái)擴(kuò)增儀間無(wú)明顯差異；使用PowerPlex?21的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)ν环菅ǎň幪?hào)F3）重復(fù)直接擴(kuò)增5次，然后使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，其峰高峰面積在兩臺(tái)擴(kuò)增儀間無(wú)明顯差異。

2.4 種屬特異性檢測(cè)

使用PowerPlex?21的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)︻?lèi)人猿、猴、羊、豬、兔、鼠、狗7種非人DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，在ABI 9700擴(kuò)增儀擴(kuò)增后，類(lèi)人猿檢測(cè)出9個(gè)片段，其中2個(gè)片段在等位基因bin上。猴和豬分別均檢測(cè)出1個(gè)等位基因片段，均不在等位基因bin上。羊、鼠、兔和狗的樣本均未檢測(cè)出特異性分型；在Hema 9700擴(kuò)增儀擴(kuò)增后，類(lèi)人猿檢測(cè)出11個(gè)片段，其中3個(gè)片段在等位基因bin上。羊、猴和豬分別均檢測(cè)出1、2和1個(gè)等位基因片段，均不在等位基因bin上。鼠、兔和狗的樣本均未檢測(cè)出特異性分型。

2.5 靈敏度檢測(cè)

使用PowerPlex?21的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序?qū)?、0.75、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 ng/μL的2800陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用3130XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，ABI 9700擴(kuò)增儀和Hema擴(kuò)增儀擴(kuò)增后檢測(cè)結(jié)果均顯示樣品濃度達(dá)到或超過(guò)0.063 ng/μL時(shí)可以獲得完整分型結(jié)果且各等位基因峰高高于50RFUs，0.063 ng/μL的2800陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果顯示，在D3S1358位點(diǎn)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，在D2S1338位點(diǎn)、D19S433位點(diǎn)和Penta D位點(diǎn)出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，0.032 ng/μL的2800陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果顯示，在D3S1358位點(diǎn)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，在D2S1338位點(diǎn)、D19S433位點(diǎn)、Penta D位點(diǎn)、Penta E位點(diǎn)、D8S1179位點(diǎn)和TPOX位點(diǎn)出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，且相同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2800擴(kuò)增檢測(cè)后，其峰高在兩臺(tái)擴(kuò)增儀間無(wú)明顯差異（圖3）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用PowerPlex?21試劑盒在Applied Biosystems 9700和Hema 9700兩種擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)DNA擴(kuò)增、血卡直接擴(kuò)增、穩(wěn)定性檢測(cè)、種屬特異性檢測(cè)和靈敏度檢測(cè)等發(fā)現(xiàn)兩臺(tái)擴(kuò)增儀在擴(kuò)增效力上沒(méi)有明顯差異，其峰高和峰面積呈現(xiàn)極大的一致性。

ABI 9700擴(kuò)增儀外觀為藍(lán)色液晶大屏幕顯示屏，PCR編程及運(yùn)行過(guò)程簡(jiǎn)便直觀，升降溫速率為3.5℃/s，一個(gè)主機(jī)可配多種不同類(lèi)型的樣品基座，調(diào)換方便簡(jiǎn)單，檢出率高，適用于常規(guī)擴(kuò)增，與3130XL等常規(guī)測(cè)序儀相適用，并且攜帶自動(dòng)斷電保護(hù)，恢復(fù)供電后自動(dòng)執(zhí)行未完成程序。Hema9700擴(kuò)增儀外觀為高清晰超大5.7寸彩色大屏幕中文LCD，用戶(hù)界面的擴(kuò)增過(guò)程相關(guān)參數(shù)和圖表顯示更直觀，編程簡(jiǎn)單快捷，升溫速率≥4.0℃/S，降溫速率≥3.5℃/S，標(biāo)準(zhǔn)模塊是：（96×0.2+77×0.5）mL混合模塊；可另選384well模塊；模塊更換方便、快捷，檢出率高，適用于常規(guī)擴(kuò)增，與3130XL等常規(guī)測(cè)序儀相適用，具有斷電記憶功能和時(shí)間遞增/遞減功能，適合長(zhǎng)鏈基因（450 nm以上）的擴(kuò)增，具有溫度遞增/遞減功能，適合科研需求，從我們常規(guī)使用來(lái)看，Hema 9700擴(kuò)增儀更具備經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)，界面為中文操作，更符合實(shí)驗(yàn)員語(yǔ)言需求，屏幕較大，觀察也更為便捷等。

圖1 兩臺(tái)擴(kuò)增儀上DNAPowerPlex?21擴(kuò)增分型結(jié)果

從DNA擴(kuò)增結(jié)果和血卡直接擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看，ABI 9700擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果與Hema9700擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，檢測(cè)的圖譜中均沒(méi)有位點(diǎn)丟失現(xiàn)象，其峰高在不同位點(diǎn)呈現(xiàn)一致性。穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示，ABI 9700擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果與Hema 9700擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，其分型峰高在兩臺(tái)擴(kuò)增儀和5次擴(kuò)增中沒(méi)有明顯差異，在不同位點(diǎn)呈現(xiàn)一致性。

種屬特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，兩臺(tái)擴(kuò)增儀在擴(kuò)增同樣的非人DNA樣本時(shí)，其分型結(jié)果呈現(xiàn)一致性，ABI 9700與Hema 9700擴(kuò)增儀分別在類(lèi)人猿DNA上檢測(cè)出9個(gè)和11個(gè)片段，在羊DNA上分別檢測(cè)出0和1個(gè)片段，在猴DNA上分別檢測(cè)出1和2個(gè)片段，在豬DNA上均檢測(cè)出1個(gè)片段，在鼠、兔和狗上均未檢出任何片段，二者在檢測(cè)到的片段上呈現(xiàn)一致性。靈敏度結(jié)果顯示，在同一個(gè)濃度的2800下，ABI 9700擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果與Hema9700擴(kuò)增后的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，在不同濃度的2800上，兩臺(tái)擴(kuò)增儀的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)一致性，隨著2800的濃度降低，分型峰高也逐漸降低，在2800濃度為0.032 ng/μL時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)丟點(diǎn)現(xiàn)象，兩臺(tái)擴(kuò)增儀在丟點(diǎn)的位點(diǎn)上呈現(xiàn)一致性。

圖2 兩臺(tái)擴(kuò)增儀上血卡PowerPlex?21直接擴(kuò)增分型結(jié)果

在馬洪濱等［16］關(guān)于兩種PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)結(jié)果的比較中，兩臺(tái)擴(kuò)增儀擴(kuò)增后其檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而在湯春園等［17］關(guān)于兩臺(tái)不同廠家的PCR擴(kuò)增儀的研究報(bào)告中，也有指出，不同PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增后，其檢測(cè)結(jié)果并沒(méi)有明顯差異，在蔣明等［18］關(guān)于3種常見(jiàn)型號(hào)PCR擴(kuò)增儀的研究報(bào)告中也指出，3臺(tái)擴(kuò)增儀擴(kuò)增后其結(jié)果統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些既往研究結(jié)果與本文最終得出的研究結(jié)果是相一致的，使用國(guó)內(nèi)外不同擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增后檢測(cè)，其結(jié)果并未有明顯差異。結(jié)合外觀、性能、DNA擴(kuò)增、血卡直接擴(kuò)增、穩(wěn)定性檢測(cè)、種屬特異性檢測(cè)和靈敏度檢測(cè)結(jié)果綜合考量，兩臺(tái)擴(kuò)增儀擴(kuò)增效果間無(wú)明顯差異，兩臺(tái)擴(kuò)增儀均可適用于常規(guī)擴(kuò)增，可廣泛應(yīng)用于各實(shí)驗(yàn)室和科研院所。這一研究結(jié)果有助于廣大實(shí)驗(yàn)室在選購(gòu)擴(kuò)增儀時(shí)提供重要參考依據(jù)，本研究結(jié)果也有助于實(shí)驗(yàn)人員在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，排除使用了不同擴(kuò)增儀的問(wèn)題，也有助于實(shí)驗(yàn)人員相互交流實(shí)驗(yàn)儀器的使用情況等。

圖3 不同濃度的2800在ABI9700和Hema9700擴(kuò)增儀上的擴(kuò)增分型結(jié)果平均峰高圖

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Effect of the polymerase chain reaction combined capillary electrophoresis on two amplification instruments

WU Xiaofang,LU Jianlin
Medical Colledge,Shunde Polytechnic,Foshan 528000,China

Objective To observe the effects and differences between the two amplification instruments combined capillary electrophoresis.Methods DNA extracted were amplified with the optimized PCR method and cycling protocol using Powerplex 21 kit on the Applied Biosystems 9700 and HEMA 9700 instrument,including direct amplification and DNA amplification,and then genotyped using Applied Biosystems 3130xl.Same DNA test was repeated five times to test the stability of the instrument,seven kinds of non-human DNA samples were detected and 9947 was used as positive standard to test the sensitivity.Then genotyping results were validated and discussed.Results Genotyping results between the two instruments had no significant differences,genotyping results were stable and accurate and showed consistency in species-specific detection and sensitivity detection between the two amplification instruments.Conclusions There is no significant difference between the two amplification instruments of the routine amplification test and the results were consistent.The results showed that the two amplification instruments could be used in routine amplification.

amplification instrument;polymerase chain reaction;capillary electrophoresis;typing

2016-09-15

吳小芳，碩士，助教，E-mail:670313991@qq.com

陸建林，碩士，副教授，E-mail:184778962@qq.com