廖建坤，何玉華，陳亞平

武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院番禺院區(qū)急診科，廣東廣州511430

水通道蛋白 44在大鼠腦缺血再灌注后腦水腫中的變化及意義

廖建坤，何玉華，陳亞平

武警廣東省總隊(duì)醫(yī)院番禺院區(qū)急診科，廣東廣州511430

目的基于大鼠局灶性腦損傷缺血再灌注模型，觀察水通道蛋白4（AQP4）、蛋白激酶C（PKC）的表達(dá)水平變化與腦水腫的關(guān)系。方法線栓法復(fù)制大腦中動脈缺血再灌注模型，大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組和缺血再灌注（CIR）組。通過綠色熒光蛋白GFP標(biāo)識的AQP4示蹤系統(tǒng)評價(jià)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的水通透性，同時檢測腦組織含水量和進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。AQP4和PKC的表達(dá)使用免疫組織化學(xué)方法檢測。結(jié)果CIR后6 h大鼠開始出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，腦組織含水量在CIR 12 h明顯升高，24 h～3 d時達(dá)到高峰；AQP4表達(dá)在早期水平降低，從12 h逐漸升高，至CIR 24 h明顯升高，3 d達(dá)高峰；PKC在CIR 6 h后緩慢增加，連續(xù)5 d維持較高水平。結(jié)論腦水腫可能和PKC、AQP4的升高相關(guān)，PKC可能在CIR早期通過磷酸化AQP4以降低AQP4的表達(dá)以延緩腦水腫進(jìn)程。

水通道蛋白4；蛋白激酶C；水通透性；腦水腫

外傷性腦水腫通常繼發(fā)于腦挫裂傷，腦出血病灶之中，同時也是造成顱內(nèi)高壓、腦疝以及創(chuàng)傷傷殘的主要原因，如何減輕該情況的發(fā)生，一直是神經(jīng)外科、急診科的研究方向。顱腦損傷后腦水腫的形成有多種細(xì)胞信號參與［1-5］，這些細(xì)胞信號之間的關(guān)聯(lián)研究是當(dāng)前國內(nèi)外的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。已有研究表明水通道蛋白4(AQP4）、蛋白激酶C（PKC）與腦水腫關(guān)系密切［6-9］。但PKC與AQP4在腦水腫變化各個階段的關(guān)聯(lián)研究鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）模型AQP4、PKC的不同時相動態(tài)變化與腦水腫的關(guān)系，進(jìn)一步闡明AQP4在腦水腫發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)理，為今后顱腦損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

大鼠144只(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供)，鼠齡，4～5個月，體質(zhì)量300～330 g，等級：cl，出現(xiàn)的死亡及神經(jīng)功能評分未達(dá)要求者由備用組補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)對照分為3組：正常對照組、假手術(shù)組、缺血再灌注（CIR）組。缺血再灌注組分別在6、12 h、1、3、5 d給予免疫組織化學(xué)染色及腦組織含水量檢測，每時間點(diǎn)12只大鼠；正常對照組和假手術(shù)組每6只大鼠亦分別給予免疫組織化學(xué)染色及腦組織含水量測量。

1.2 試劑和儀器

國產(chǎn)手術(shù)顯微鏡與光學(xué)顯微鏡、80～100°C干燥箱、免抗鼠單克隆體PKC、生物素化二抗、SABC免疫組化試劑盒。鈣黃綠素-AM、pMD?20-T Vector、特異性PCR引物、硅膠模型TM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒。

1.3 方法

線栓法制作大鼠大腦MCAO/R模型，缺血2 h后再灌注。假手術(shù)組實(shí)施相同手術(shù)，線栓置入深度＜10 mm。神經(jīng)功能評分采用Garcia JH法［10］，依照Elliot公式計(jì)算腦組織含水量。SABC行免疫組化染色用于檢測PKC、AQP4的表達(dá)水平。以GFP-C1-AQP4-M23的 CTX-TNA2細(xì)胞為觀察對象，記錄GFP熒光圖像并進(jìn)行圖像重建，了解AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的分布。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0分析并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組均數(shù)間比較用q檢驗(yàn)，雙變量關(guān)系用相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

分析3組觀察指標(biāo)AQP4、PKC、腦含水量及神經(jīng)功能缺損評分情況（表1），因?qū)φ战M組與假手術(shù)組在6、12 h、1、3、5 d這5個時間節(jié)點(diǎn)的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故只選擇6 h這一時間節(jié)點(diǎn)值與CIR組進(jìn)行比較。

表1 3組各觀察指標(biāo)的變化（±s）

表1 3組各觀察指標(biāo)的變化（±s）

*P＜0.05 vs對照組.

分組CIR組6 h CIR組12 h CIR組24 h CIR組3 d CIR組5 d對照組假手術(shù)組F P例數(shù)（n）24 24 24 24 24 12 12 AQP4 2.90±0.55* 4.30±0.53 5.30±0.52* 6.30±0.53* 6.17±0.42* 3.89±0.12 3.62±0.53 21.5＜0.05 PKC 5.49±0.53* 5.51±0.45* 5.95±0.81* 6.21±0.85* 6.42±0.53* 4.10±0.02 3.65±0.59 32.4＜0.05腦含水量（％）79.12±0.31 80.16±0.21* 82.59±0.78* 82.87±0.56* 83.15±0.72* 77.98±0.48 77.69±0.53 18.3＜0.05神經(jīng)功能缺損評分10.92±0.72* 10.21±0.77* 9.19±2.16* 8.12±2.11* 10.29±1.11* 18.32±0.13 17.65±0.54 85.7＜0.01

3 討論

缺血致腦水腫的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，AQP4、PKC等細(xì)胞信號在腦缺血再灌注不同階段的表達(dá)升高與腦水腫形成有關(guān)。大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵作用是調(diào)節(jié)腦內(nèi)水平衡［11-13］，可能是表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP4因其水通透性改變而釋放入腦組織，水通過AQP的轉(zhuǎn)運(yùn)快速入腦。AQP4在中樞廣泛分布，與中樞水代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，參與腦損傷等繼發(fā)腦水腫的形成過程［14］。本研究中CIR組除6 h檢測AQP4含量顯著低于正常對照組和假手術(shù)組外，其余12、24 h、3、5 d這4個時間節(jié)點(diǎn)AQP4的含量均高于對照組，3 d達(dá)到峰值，5 d下降不多。分析其原因，可能是缺血再灌注造成了大鼠大腦的持續(xù)性損傷，這種損傷隨時間的延續(xù)有加重的傾向。

PKC的表達(dá)變化情況也和AQP4相似，6、12、24 h、3、5 d這5個時間節(jié)點(diǎn)的含量持續(xù)且明顯增加，到第5天達(dá)到最高水平。與此情況相似的還有神經(jīng)功能缺損評分，在相同的時間節(jié)點(diǎn)評分持續(xù)且明顯增加，說明神經(jīng)功能缺損5 d達(dá)到高峰。AQP4、PKC和神經(jīng)功能缺損評分的同向增加是否說明AQP4與PKC在腦水腫中具有疊加效應(yīng)尚不得而知。AQP4與PKC之間可能存在的關(guān)聯(lián)也不清楚。有關(guān)研究表明：PKC可使AQP4磷酸化以達(dá)到調(diào)節(jié)AQP4活性的目的［15］。Manley［12］發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞敲除AQP4基因后水的通透性比正常星形膠質(zhì)細(xì)胞水通透性降低了7.1倍，本實(shí)驗(yàn)早期也發(fā)現(xiàn)AQP4明顯低于正常對照組。鑒于PKC可使AQP4磷酸化而失活，早期AQP4水平降低可能表明PKC對AQP4活性的抑制效應(yīng)，PKC的移位激活不但降低AQP4基因表達(dá)和蛋白含量，而且還對AQP4進(jìn)行磷酸化修飾，導(dǎo)致AQP4活性降低，減輕腦水腫及神經(jīng)功能損害［16］。CIR組6-12h水腫已發(fā)生，而此時AQP低表達(dá)，提示PKC可能已參與腦水腫的形成。分析其原因，可能是PKC被激活后促進(jìn)興奮性氨基酸的釋放從而加重神經(jīng)元的缺血性損傷，引起腦水腫。

綜上所述，本研究認(rèn)為在CIR早期，機(jī)體本能地調(diào)節(jié)PKC表達(dá)增加以通過磷酸化AQP4而減輕腦水腫及神經(jīng)功能損害，這一點(diǎn)可從CIR組6 h時AQP4顯著低于對照組和假手術(shù)組，而PKC明顯高于對照組得到體現(xiàn)。隨著缺血再灌注時間的加長，一方面PKC激活后興奮性氨基酸釋放加重神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，另一方面PKC不能有效減少AQP4的表達(dá)，AQP4的增多引起嚴(yán)重的腦水腫和神經(jīng)功能的嚴(yán)重?fù)p害。我們由此推測，外源性PKC和PKC激活劑可減少AQP4表達(dá)從而減輕腦水腫和神經(jīng)功能損害，這將為揭示顱腦損傷后細(xì)胞毒性腦水腫發(fā)病機(jī)制和顱腦損傷的防治提供重要的理論依據(jù)。PKC在CIR后期（1～5 d）是否因?yàn)檎{(diào)控AQP4失效而與AQP4協(xié)同加重腦水腫和神經(jīng)功能損害尚需進(jìn)一步研究以明確。

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Change of aquaporin-4 in brain edema after cerebral ischemia reperfusion in rats

LIAO Jiankun,HE Yuhua,CHEN Yaping
Department of emergency,Armed Police Corps Hospital of Guangdong,Guangzhou 511430,China

Objective To explore the relationship between expression level of aquaporin-4(AQP4),protein kinase C(PKC)and brain edema based on the focal cerebral ischemia reperfusion rat model.Methods The rat model of middle cerebral artery (MCA)was duplicated by suture method.The rats were randomly divided into normal control group,sham-operated group and cerebral ischemia reperfusion(CIR)group.Water permeability for rat astrocytes was evaluated by the green fluorescent protein(GFP)labeled AQP4 tracing system.Scores of neurofunctional defect were graded and water content in brain tissues was measured.Expression of AQP4 and PKC in brain tissue was detected by immunohistochemistry.Results Neurofunctional defect occurred at 6 h after CIR.Water content in brain tissue increased at 12 h after CIR,reached peak at day 1-3.The expression levels of AQP4 were decreased first,then increased gradually at 12 h later,obviously increased at 24 h after CIR and reached to highest point at day 3.While PKC increased gradually at 6 h after CIR,kept high level for 5 days.Conclusion Brain edema may relate to the rise of PKC and AQP4,PKC may reduce the expression of AQP4 via phosphorylation in the early stage of CIR in order to delay the process of brain edema.

aquaporin4;protein kinase C;water permeability;brain edema

2016-08-16

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A20124521）

廖建坤，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail:liaofang_1997@126.com