鄭少偉，鐘浩博，繆海雄，劉偉樂，李勝發(fā)，陳楚群，孫春漢惠州市第一人民醫(yī)院骨科，廣東惠州516001

p5533凋亡刺激蛋白 22通過穩(wěn)定β-catenin-E-cadhheerriinn復合體抑制骨肉細胞轉移

鄭少偉，鐘浩博，繆海雄，劉偉樂，李勝發(fā)，陳楚群，孫春漢惠州市第一人民醫(yī)院骨科，廣東惠州516001

目的探討p53凋亡刺激蛋白2（ASPP2）對骨肉瘤細胞轉移的影響及其機制。方法Q-PCR檢測骨肉瘤組織和細胞中ASPP2 mRNA的表達；western blot檢測骨肉瘤細胞中ASPP2蛋白表達；transwell檢測細胞轉移能力；co-IP實驗檢測β-catenin和E-cadherin相互作用水平；免疫熒光檢測β-catenin在細胞核中表達水平。結果8例手術標本Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中ASPP2 mRNA的表達較癌旁組織明顯降低；4株骨肉瘤細胞系中（OS187、SAOS2、HOS和MG63）ASPP2 mRNA和蛋白的表達較正常成骨細胞明顯減少。過表達ASPP2蛋白的SAOS2其轉移能力明顯減弱，同時β-catenin和E-cadherin相互作用水平增加，而β-catenin核轉位減少。結論ASPP2可以減少骨肉瘤細胞SAOS2的轉移，其機制可能的通過穩(wěn)定β-catenin-E-cadherin復合體，抑制β-catenin核轉位。

p53凋亡刺激蛋白2；骨肉瘤轉移；β-catenin-E-cadherin復合體；β-catenin核轉位

骨肉瘤是易發(fā)生于長骨干骺端的原發(fā)性惡性腫瘤。由于骨肉瘤細胞生長迅速及易侵襲，即使骨肉瘤的規(guī)范化治療通常采用手術前化療、手術和術后定期化療，即新輔助化療加手術的綜合治療模式，治療也強調多學科協(xié)作，但多數(shù)病人最終死于遠處肺轉移［1-2］。p53凋亡刺激蛋白2（ASPP2）是p53凋亡刺激蛋白家族的主要成員之一，參與細胞生長、凋亡以、損傷應激和細胞遷移等一系列生理病理反應［3-4］。研究表明，ASPP2可以穩(wěn)定β-catenin-E-cadherin復合體，抑制β-catenin核轉位，從而抑制腫瘤細胞的轉移［5］。目前國內外尚無有關ASPP2在骨肉瘤中表達和骨肉瘤轉移的研究。本研究主要觀察ASPP2表達與骨肉瘤細胞轉移的關系，為探討ASPP2在骨肉瘤轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集8例發(fā)生轉移的骨肉瘤男性病人的手術標本。正常成骨細胞及骨肉瘤細胞OS187、SAOS2、HOS、和MG63由南方醫(yī)院骨科實驗室贈予。SYBR Green Real-time PCR Master Mix和Trizol（TaKaRa，大連），抗人ASPP2單克隆鼠抗（Abcam，美國），β-catenin和E-cadherin兔多克隆抗體（CST，美國），人β-actin鼠單克隆抗體（Santa Cruz，美國），過表達ASPP2質粒由上海吉瑪生物公司合成，Lipofectamine? 2000（life，美國）。

1.2 人骨肉瘤手術標本收集和處理

收集人骨肉瘤組織及癌旁5 cm正常骨組織，新鮮組織用液氮預冷后的研磨碗研磨成粉末狀，加入適量Trizol研磨后，-80℃保持。

1.3 質粒轉染

由上海吉瑪公司合成質粒。將SAOS2細胞懸液（細胞數(shù)約為2×105）接種于24孔板中，5％CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，等細胞融合度達到80％左右后，按Lipofectamine?2000方法轉染過表達ASPP2及對照組的質粒。轉染質粒72 h后熒光顯微鏡下觀察細胞熒光率。終濃度為0.2 μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達ASPP2細胞，收集部分細胞western blot檢測ASPP2蛋白表達情況。

1.4 Q-PCR檢測ASPP2 mRNA的含量

Trizol方法提人骨肉瘤組織或6孔板中RNA，用TAKARA反轉錄試劑盒及說明逆轉成cDNA。生成的cDNA取2 μL，與10 μL 2×SYBR混合，再加入6 μL水和上、下游引物各1 μL（ASPP2引物:上游，5-TATCTAATCCTTACCGAAACC-3；下游，5-AACTAATACTCGGACTCCC-3。b-actin引物:上游，5-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3；下游，5-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3），混勻為20 μL反應體系，反應條件為95℃5 min；95℃15 s，60℃60 s，40個循環(huán)。ASPP2的表達水平用CT值（熒光信號達到設定閾值所經的循環(huán)數(shù)）表示，內參為GAPDH。

1.5 Western blot檢測ASPP2蛋白水平

60 mm皿收集細胞，提取蛋白。5％濃縮膠80 V衡壓30 min，10％分離膠恒壓110 V，40 min，濕轉120 mA恒流50 min，37℃搖床5％BSA封閉2 h，轉印后加入一抗：ASPP2和β-actin 4℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，山羊抗兔或山羊抗鼠近紅外二抗1∶15000，常溫避光搖床孵育1.5 h，避光TBST洗膜15 min×4次。Odyssey V3.0掃描儀掃描膜。重復3次。

1.6 Transwell實驗

穩(wěn)定表達ASPP2及resume細胞消化后用無血清培養(yǎng)基DMEM制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104/mL。吸取200 μL細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含10％血清的DMEM 600 μL。12 h后取出小室，去除培養(yǎng)基，4％多聚甲醛固定10 min后，結晶紫染色2 h，顯微鏡下拍照。

1.7 免疫熒光實驗

將細胞種于confocal皿中，12 h后收集細胞，4％多聚甲醛固定10 min，PBS洗3 min×3次。1‰曲拉通通透細胞膜及核膜，β-catenin一抗1：50 4℃孵育過夜。PBS洗3 min×3次，594紅色熒光二抗常溫1 h，DAPI 5 min，封閉拍照。

1.8 Co-IP實驗

提取蛋白后，b-catenin抗體磁珠混合體4℃孵育4 h后，洗3次，加入適量2×loading buffer，100℃水浴10 min，Western blot檢測β-catenin和E-cadherin。

1.9 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，采用單因素方差分析法，首先利用Levene方法進行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計學意義后進一步作多重比較，多重比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織及細胞中ASPP2表達的水平

本研究收集了8例骨肉瘤病人及癌旁骨組織標本，用Q-PCR法檢測了ASPP2 mRNA水平。結果顯示，骨肉瘤組織（T）中ASPP2 mRNA較癌旁骨組織（N）明顯減少。進一步對比了正常成骨細胞和骨肉瘤細胞（OS187、SAOS2、HOS和MG63）中ASPP2 mRNA和蛋白的表達差異，結果顯示骨肉瘤細胞中的ASPP2 mRNA和蛋白較正常成骨細胞中的明顯減少（圖1）。

2.2 過表達ASPP2抑制HOS細胞侵襲

ASPP2是作為一個抑癌基因，其在骨肉瘤組織和細胞中表達明顯減少。我們在低表達ASPP2的骨肉瘤細胞SAOS2中過表達ASPP2（圖2A），侵襲實驗結果表明，過表達ASPP2后SAOS2侵襲能力受到明顯抑制（圖2B）。

2.3 ASPP2抑制β-cantein核轉位

E-cadherin可以和β-cantein形成復合體，抑制β-cantein核轉位。我們運用CO-IP實驗檢測了過表達ASPP2的SAOS2細胞中E-cadherin和β-cantein相互作用情況，結果顯示過表達ASPP2后，E-cadherin和b-cantein相互作用明顯增多（圖3A）。同時觀察到，過表達ASPP2的SAOS2細胞中，β-cantein核轉位受到抑制（圖3B）。

3 討論

p53凋亡刺激蛋白家族包括：ASPPI、ASPP2和iASPP。因其能夠與p53蛋白結合，調控p53促進凋亡基因轉錄的能力，調節(jié)腫瘤細胞凋亡而得名［3-4］。ASPP2是ASPP家族中最具特色的促凋亡蛋白［3］。在人腦膠質瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌等常見腫瘤中，ASPP2的表達都明顯下降［6-9］。臨床研究也表明，ASPP2的表達水平也腫瘤患者的生存率也有一定的關聯(lián)，高表達ASPP2的患者預后較低表達的好［10］。本研究結果顯示，骨肉瘤組織中ASSP2 mRNA的表達較癌旁骨組織明顯降低，并且骨肉瘤細胞系中ASSP2 mRNA和蛋白表達也較正常成骨細胞明顯減少?？梢?，ASSP2表達下降可能是影響骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。

圖1 骨肉瘤組織及細胞中ASPP2表達的水平A：Q-PCR骨肉瘤組織中ASPP2 mRNA表達水平;B:細胞中ASPP2 mRNA表達水平;C：Western blot檢測骨肉瘤細胞中ASPP2蛋白表達水平.*P＜0.05 vs N;#P＜0.05 vs HOSB.

圖2 過表達ASPP2對HOS細胞侵襲的影響A:Western blot檢測SAOS2細胞中ASPP2表達;B:Transwell實驗檢測SAOS2細胞侵襲能力的變化.*P＜0.05 vs vector-NC.

圖3 ASPP2對β-cantein-E-cadherin復合物穩(wěn)定的影響(原放大倍數(shù)×60)A:CO-IP實驗檢測了E-cadherin和β-cantein相互作用情況;B:免疫熒光檢測β-cantein核轉位,β-cantein紅色熒光,DAPI藍色熒光.

大部分骨肉瘤患者預后不好的一個重要因素是發(fā)生了轉移［11-12］。Mak等［13］發(fā)現(xiàn)在絨毛膜癌中抑制ASSP2表達，可以促進其發(fā)生轉移?？梢姡珹SPP2不僅參與調控細胞的凋亡，也對腫瘤細胞的轉移有抑制作用。我們在低表達ASPP2的高轉移性骨肉瘤細胞SAOS2過表達ASPP2，發(fā)現(xiàn)其轉移能力明顯減弱。由此提示，ASPP2對骨肉細胞的轉移有一定抑制作用。那么，ASSP2是如何發(fā)揮抑制腫瘤轉移的作用的?新近的研究也發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中ASPP2可以穩(wěn)定β-catenin-E-cadherin形成復合體，從而減少乳腺癌細胞的轉移［3］。E-cadherin和β-catenin形成復合體組成了細胞間的粘附的主要蛋白結構，可以增加細胞間的連接而減少腫瘤細胞的轉移［14-15］；另一方面，E-cadherin和β-catenin形成復合體可以穩(wěn)定β-catenin，減少β-catenin核轉位促進腫瘤轉移的作用［16-17］。，因此，我們進一步檢測了ASPP2對β-catenin-E-cadherin復合體的影響，發(fā)現(xiàn)過表達ASPP2后，骨肉瘤細胞SAOS2中β-catenin-E-cadherin結合增多，并且核蛋白中β-catenin蛋白表達減少。由此可見，ASPP2也可以穩(wěn)定骨肉瘤細胞中β-catenin-E-cadherin復合體，從而減少β-catenin核轉位。

綜上所述，骨肉瘤中ASPP2低表達與骨肉瘤細胞高轉移能力有關，其可能的機制是ASPP2低表達后減少對β-catenin-E-cadherin復合體的穩(wěn)定作用，β-catenin核轉位后促進了骨肉瘤細胞的轉移。

［1］Mirabello L,Troisi RJ,Savage SA.Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004:data from the Surveillance, Epidemiology,and End Results Program［J］.Cancer,2009,115(7): 1531-43.

［2］Posthumadeboer J,Witlox MA,Kaspers G,et al.Molecular alterations as target for therapy in metastatic osteosarcoma:a review of literature［J］.Clin Exp Metastasis,2011,28(5):493-503.

［3］Vives V,Su J,Zhong S,et al.ASPP2 is a haploinsufficient tumor suppressor that cooperates with p53 to suppress tumor growth［J］. Genes Dev,2006,20(10):1262-7.

［4］Samuels LY,O'connor DJ,Bergamaschi D,et al.ASPP proteins specifically stimulate the apoptotic function of p53［J］.Mol Cell, 2001,8(4):781-94.

［5］Wang YH,Bu FF,Royer C,et al.ASPP2 controls epithelial plasticity and inhibits metastasis through beta-catenin-dependent regulation of ZEB1［J］.Nat Cell Biol,2014,16(11):1092-6.

［6］朱泳鵬,王東軍,何友虎.人腦膠質瘤中ASPP1和ASPP2蛋白的表達及其與細胞凋亡的相關性［J］.廣東醫(yī)學,2012,33(13):1964-8.

［7］Li SJ,Shi GX,Yuan H,et al.Abnormal expression pattern of the ASPP family of proteins in human non-small cell lung cancer and regulatory functions on apoptosis through p53 by iASPP［J］.Oncol Rep,2012,28(1):133-40.

［8］Sgroi DC,Teng S,Robinson G,et al.In vivo gene expression profile analysis of human breast cancer progression［J］.Cancer Res, 1999,59(22):5656-61.

［9］Meng WD,Chu RX,Wang BZ,et al.Helicobacter pylori infection and expressions of apoptosis-related proteins p53,ASPP2 and iASPP in gastric cancer and precancerous lesions［J］.Pathol Biol (Paris),2013,61(5):199-202.

［10］蘇敏,谷宇,蘇勝發(fā),等.p53凋亡刺激蛋白家族蛋白表達與非小細胞肺癌患者預后的關系［J］.中華腫瘤雜志,2014,36(4):268-72.

［11］Gozo MC,Jia DY,Aspuria PJ,et al.FOXC2 augments tumor propagation and metastasis in osteosarcoma［J］.Oncotarget,2016,7 (42):68792-802.

［12］Liu HL,Zhi LQ,Duan N,et al.Abnormal expression of Tim-3 antigen on peripheral blood T cells is associated with progressive disease in osteosarcoma patients［J］.FEBS Open Bio,2016,6(8): 807-15.

［13］Mak VC,Lee L,Siu MK,et al.Downregulation of ASPP2 in choriocarcinomacontributestoincreasedmigratorypotential through Src signaling pathway activation［J］.Carcinogenesis,2013, 34(9):2170-7.

［14］Chang YW,Su YJ,Hsiao M,et al.Diverse targets of beta-Catenin during the Epithelial-Mesenchymal transition define cancer stem cells and predict disease relapse［J］.Cancer Res,2015,75(16): 3398-410.

［15］Varisli L,Ozturk BE,Akyuz GK,et al.HN1 negatively influences thebeta-Catenin/E-Cadherininteraction,andcontributesto migration in prostate cells［J］.J Cell Biochem,2015,116(1):170-8.

［16］Lee K,Lindsey AS,Li N,et al.Beta-catenin nuclear translocation in colorectal cancer cells is suppressed by PDE10A inhibition,cGMP elevation,and activation of PKG［J］.Oncotarget,2016,7(5): 5353-65.

［17］Jin RS,Liu WS,Menezes S,et al.The metastasis suppressor NDRG1 modulates the phosphorylation and nuclear translocation of beta-catenin through mechanisms involving FRAT1 and PAK4［J］.J Cell Sci,2014,127(14):3116-30.

ASPP2 inhibits osteosarcoma cells metastasis by stabilizing the β-catenin-E-cadherin complex

ZHENG Shaowei,ZHONG Haobo,MIAO Haixiong,LIU Weile,LI Shengfa,CHEN Chuqun,SUN Chunhan Department of Orthopedic Surgery,Huizhou First People's Hospital,Huizhou 516001,China

Objective To explore the effect and mechanism of apoptosis stimulating protein2 of p53(ASPP2)in osteosarcoma cells metastasis.Methods Quantitative-Polymerase Chain Reaction(Q-PCR)was performed to determine ASPP2 mRNA in eight samples of osteosarcoma tissue and four cell lines of osteosarcoma.The levels of ASPP2 protein were detected by western blot.The metastasis ability of SAOS2 cells that overexpressed ASPP2 were estimated by Transwell experiment.The Levels of interaction of β-catenin and E-cadherin were analyze by co-IP.Immunofluorescence was used to detect the expression of ASPP2 protein in the nuclear of osteosarcoma cells.Results The ASPP2 mRNA levels in eight osteosarcoma tissue samples were decreased significantly than that in normal bone tissue.Compared with normal human osteoblast cells HOSB,the levels of BRMS1 mRNA and protein obviously decreased in osteosarcoma cell lines OS187、SAOS2、HOS and MG63.The metastasis ability,β-catenin-E-cadherin complex and β-catenin nuclear-translocation of SAOS2 cells was significantly inhibited after ASPP2 overexpression.ConclusionBRMS1 can inhibit SAOS2 cells metastasis and the mechanism may involve with stabilizing the β-catenin-E-cadherin complex,and suppress β-catenin nuclear-translocation.

apoptosis stimulating protein2 of p53;osteosarcoma cells metastasis;β-catenin-E-cadherin complex;β-catenin nuclear-translocation

2016-10-21

鄭少偉，E-mail:522948721@qq.com