趙華鋒，王瑞蓮，周嘉明，孫晶

(1.青島市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東 青島 266101；2.德國(guó)海德堡大學(xué) 經(jīng)濟(jì)系，德國(guó) 海德堡 999035)

番茄醬中單氰胺檢測(cè)衍生化條件的研究

趙華鋒1，王瑞蓮1，周嘉明1，孫晶2

(1.青島市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東 青島 266101；2.德國(guó)海德堡大學(xué) 經(jīng)濟(jì)系，德國(guó) 海德堡 999035)

建立了柱前衍生化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)番茄醬中單氰胺的最佳衍生化條件；在衍生化試劑丹磺酰氯濃度為10 mg/mL，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h，緩沖體系的pH值為10.5時(shí)，衍生效果最佳，單氰胺最低檢測(cè)濃度為0.00005 mg/kg，衍生產(chǎn)物在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

單氰胺；柱前衍生；丹磺酰氯；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

丹磺酰氯是檢測(cè)一、二級(jí)氨基酸的著名衍生化試劑，生成的氨基酸衍生物可用反相液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[1]。單氰胺分子量小、極性大，無(wú)法直接進(jìn)行色譜分析，單氰胺結(jié)構(gòu)中含有氨基，嘗試采用丹磺酰氯衍生化反應(yīng)后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

目前單氰胺的檢測(cè)還沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于單氰胺殘留檢測(cè)方法的報(bào)道也很少[2]。本文以丹磺酰氯作為柱前衍生化試劑，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為檢測(cè)手段，對(duì)番茄醬中的單氰胺進(jìn)行檢測(cè)。研究了丹磺酰氯作為柱前衍生試劑使用的條件：衍生試劑的濃度、衍生化反應(yīng)的時(shí)間和溫度及緩沖體系的pH值對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，并得到了最佳的衍生化條件，同時(shí)考察了衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(98%) 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；甲醇、丙酮、甲酸 均為色譜純；碳酸鈉、碳酸氫鈉、丹磺酰氯 均為優(yōu)級(jí)純；超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 Waters I-Class液相-XEVO TQ質(zhì)譜；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CTK80離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸/水；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子(ESI+)；母離子：276.2；定量離子：156.2；定性離子：171.2；錐孔電壓：32 V；定量、定性離子的碰撞能量分別為30，20 eV。

1.3 標(biāo)樣溶液的配制

精確稱(chēng)取單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.00001 g)，用水溶解并定容至10 mL，制得1000 μg/mL標(biāo)樣溶液，備用。使用前根據(jù)需要稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品預(yù)處理

稱(chēng)取10.00 g混勻的番茄醬樣品于均質(zhì)器鋼杯中，加入30 mL甲醇，均質(zhì)2 min，10 mL甲醇分2次清洗均質(zhì)棒，減壓抽濾，濾液轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，并用甲醇定容到100 mL，混勻，從容量瓶中準(zhǔn)確移取5～10 mL至具塞刻度試管中，加入碳酸鈉、碳酸氫鈉混合溶液和丹磺酰氯丙酮溶液，混勻后在恒溫水浴振蕩中反應(yīng)，冷卻至室溫，用甲醇定容到10 mL，混合均勻后用0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，LC-MS/MS測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的確認(rèn)

單氰胺和丹磺酰氯的反應(yīng)方程式見(jiàn)圖1，這一反應(yīng)中起決定作用的因素有4個(gè)，分別為緩沖體系的pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和丹磺酰氯濃度，考察這4個(gè)因素對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，確定出最佳的衍生化條件。

圖1 單氰胺和丹磺酰氯的反應(yīng)方程式

2.1.1 反應(yīng)體系pH值的確定

單氰胺和丹磺酰氯的反應(yīng)要在堿性條件下進(jìn)行，調(diào)節(jié)碳酸鈉、碳酸氫鈉緩沖溶液的pH值為8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0。分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明: pH值為10.5時(shí)，反應(yīng)效果最好，于是確定緩沖溶液的pH值為10.5。

2.1.2 反應(yīng)溫度和時(shí)間的確定

分別采用反應(yīng)溫度為40，50，60，70 ℃進(jìn)行衍生化反應(yīng)，均取得了成功，但從節(jié)能省時(shí)方面考慮，故選擇60 ℃反應(yīng)1 h，既快速又反應(yīng)完全。

2.1.3 丹磺酰氯濃度的確定

測(cè)定了丹磺酰氯濃度在1～14 mg/mL 范圍內(nèi)對(duì)番茄醬樣品中單氰胺衍生效果的影響，每組做3個(gè)平行，取3次測(cè)定結(jié)果的平均值。單氰胺衍生物的峰面積隨丹磺酰氯濃度變化的情況見(jiàn)圖2。

圖2 丹磺酰氯濃度與單氰胺衍生物生成量的關(guān)系

由圖2可知，丹磺酰氯濃度為10 mg/mL時(shí)，單氰胺的衍生基本完全；大于10 mg/mL時(shí)，單氰胺衍生物的生成量基本無(wú)變化，已趨于平衡，番茄醬中含有大量的氨基酸，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)和丹磺酰氯反應(yīng)。因此，丹磺酰氯的濃度升高到一定程度時(shí)，才能保證單氰胺的反應(yīng)正常進(jìn)行，最終選擇丹磺酰氯的濃度為10 mg/mL。

2.2 液質(zhì)條件的優(yōu)化

衍生質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的單氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生產(chǎn)物分子量為275，質(zhì)譜通過(guò)針泵連續(xù)進(jìn)樣，采用MS Scan方式進(jìn)行掃描，調(diào)節(jié)錐孔電壓，得到較強(qiáng)的[M+H]峰母離子276.2，對(duì)選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量，得到豐度較好的2個(gè)子離子，分別為156.2和171.2，根據(jù)MRM的色譜峰形及靈敏度，確定156.2為定量離子，171.2為定性離子。采用最佳的衍生化條件進(jìn)行衍生反應(yīng)后單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和番茄醬樣品加標(biāo)的色譜圖見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 0.05 mg/L單氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖4 番茄醬中單氰胺的色譜圖(添加濃度為0.05 mg/kg)

2.3 衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性及最低檢測(cè)濃度

2.3.1 衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

采用最佳的衍生化條件衍生0.0002 mg/L的單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生后1，12，24，36，48 h分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 衍生產(chǎn)物的儀器最低檢測(cè)濃度

番茄醬中添加0.0002 mg/kg單氰胺的色譜圖信噪比(S/N)為12，按照S/N=3計(jì)算儀器的最低檢測(cè)濃度，則單氰胺在番茄醬中的最低檢測(cè)濃度為0.00005 mg/kg。

3 結(jié)論

本文成功建立了柱前衍生化高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)番茄醬中單氰胺的最佳衍生化條件：衍生化試劑丹磺酰氯濃度為10 mg/mL、反應(yīng)溫度為60 ℃、反應(yīng)時(shí)間為1 h、緩沖體系pH值為10.5時(shí)，衍生效果最佳，單氰胺最低檢測(cè)濃度為0.00005 mg/kg，衍生產(chǎn)物在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

[1]Negro A, Garbisa S, Gotte L, et al. The use of reverse-phase high-performance liquid chromatography and pre-column derivatization with dansyl chloride for quantitation of specific amino acids in collagen and elastin[J]. Analytical Biochemistry,1987,160(1):39-46.

[2]張春濤,張玲,劉維娟,等.基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法檢測(cè)葡萄和土壤中的單氰胺[C].第十七屆全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文集,2009:163-164.

Study on Derivatization Condition of Cyanamide Detection in Tomato Sauce

ZHAO Hua-feng1, WANG Rui-lian1, ZHOU Jia-ming1, SUN Jing2

(1.Center Testing International (Qingdao) Co., Ltd., Qingdao 266101, China;2.Department of Economics,University of Heidelberg,Heidelberg 999035, Germany)

To establish the optimal pre-column derivatization UPLC-MS/MS method for the detection of cyanamide in tomato sauce. The most suitable derivatization conditions are determined as follows: dansyl chloride concentration is 10 mg/mL, reaction temperature is 60 ℃, reaction time is 1 h, pH of buffer system is 10.5; the limit of quantification is 0.00005 mg/kg, the derivative products are stable within 48 hours.

cyanamide; pre-column derivatization; dansyl chloride; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry

2016-07-15

趙華鋒(1981-)，男，山東臨沂人，工程師，碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)。

TS207.4

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.033

1000-9973(2017)01-0142-02